CN116593689A - 区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条 - Google Patents

区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条 Download PDF

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Abstract

本说明书一些实施例提供了一种区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条，双试纸条包括第一试纸条和第二试纸条，第一试纸条和所述第二试纸条均包括检测膜和结合垫；其中，检测膜上均设置有检测线，第一试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体中的一个，第二试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体中的另一个；第一试纸条和第二试纸条的结合垫上含有与第一试纸条和第二试纸条的检测线包被的抗体所对应的新冠病毒重组S蛋白或新冠病毒重组N蛋白，新冠病毒重组S蛋白或新冠病毒重组N蛋白由标记物标记。

Description

区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条
技术领域
本说明书涉及生物检测技术及体外诊断领域，特别是涉及一种区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条、包含其的检测装置和检测试剂盒及其应用。
背景技术
新冠病毒包含四种主要的结构蛋白：刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)，核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N蛋白)，膜蛋白(Membrane protein，M蛋白)，包膜蛋白(Envelopeprotein，E蛋白)。其中，S蛋白能介导病毒进入宿主细胞，因此它是感染后引起宿主免疫系统产生中和性抗体的主要靶标。S蛋白包含两个功能性亚基S1、S2，其中S1亚基的受体结合域(RBD)可以与人类血管紧张素转化酶2(ACE2)结合进而侵入细胞，新冠病毒S蛋白与病毒传染能力与发病机制密切相关。N蛋白在新冠病毒中含量丰富，是一种高度免疫原性蛋白，参与基因组复制和细胞信号通路调节。
自新型冠状病毒在世界范围内大幅传播以来，新冠抗体的体外诊断试剂/试纸已经成为不可或缺的快速诊断方式。但是现有的检测技术不能对抗体的来源做出有效区分，例如，不能准确区分受试者体内的抗体是感染病毒后自身产生的抗体、接种灭活病毒疫苗产生的抗体，还是由接种重组疫苗或mRNA疫苗而产生的。
因此，需要一种能够区分新冠抗体来源的检测方法，以提高新冠抗体检测的准确性或为新冠疫苗接种效果提供判断依据。
发明内容
本说明书一些实施例提供了一种区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条。在一些实施例中，所述双试纸条包括第一试纸条和第二试纸条，所述第一试纸条和所述第二试纸条均包括检测膜和结合垫；其中，所述检测膜上均设置有检测线，所述第一试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体中的一个，所述第二试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体中的另一个；所述第一试纸条和所述第二试纸条的结合垫上含有与所述第一试纸条和所述第二试纸条的检测线包被的抗体所对应的新冠病毒重组S蛋白或新冠病毒重组N蛋白，所述新冠病毒重组S蛋白或新冠病毒重组N蛋白由标记物标记。
本说明书一些实施例还提供了一种检测装置或检测试剂盒，包括如上所述的免疫层析双试纸条，其中，所述检测装置包括检测笔、检测卡、检测板和/或检测棒。
本说明书一些实施例还提供了一种免疫层析双试纸条的结合垫的制备方法，所述双试纸条包括第一试纸条和第二试纸条，包括：采用柠檬酸三钠与氯金酸制备胶体金；使用所述新冠病毒重组S蛋白的S1亚基标记所述胶体金，得到第一金溶液；使用所述新冠病毒重组S蛋白的S1亚基的RBD标记所述胶体金，得到第二金溶液；使用所述新冠病毒重组N蛋白标记所述胶体金，得到第三金溶液；将所述第一金溶液和所述第二金溶液喷点在处理液处理后的结合垫上，得到所述第一试纸条或第二试纸条的结合垫之一；将所述第三金溶液喷点在所述处理液处理后的结合垫上，得到所述第一试纸条或第二试纸条的另外一条结合垫。
本说明书一些实施例还提供了一种如上所述的免疫层析双试纸条在新冠抗体检测、新冠疫苗接种效果检测或新冠抗体来源检测中的应用。
本说明书一些实施例还提供了一种包含如上所述的免疫层析双试纸条在检测装置或检测试剂盒中的应用，所述检测装置包括检测笔、检测卡、检测板和/或检测棒。
附图说明
本说明书将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，在这些实施例中，相同的编号表示相同的结构，其中：
图1是根据本说明书一些实施例所示的区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条中的其中一个试纸条的示例性结构示意图；
图2是根据本说明书一些实施例所示的采集指尖血样本的步骤示意图；
图3是根据本说明书一些实施例所示的示例性的区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条的检测结果示意图。
具体实施方式
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
除另有定义外，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
术语“约”和“左右”可描述在某个值的一定取值范围内，例如该值的±0.5幅度范围内等。例如，术语“强约1-2个色度”可以包括大于原数值0.5至小于原数值2.5的任意数值。
术语“样品”包括但不限于感染或疑似感染冠状病毒的血浆、血清或全血；接种冠状病毒疫苗后的血浆、血清或全血；冠状病毒蛋白免疫动物后的血浆、血清或全血；或生物学方法获得的抗冠状病毒的抗体样品。所述样品可来源于感染或疑似感染新冠病毒的人或动物的血浆、血清、全血、胸腹腔积液、脑脊液或组织标本，还可来源于生物学方法如动物免疫制备的动物血清、血浆、全血或抗新冠病毒冠状病毒的抗体的溶液。
术语“样本冲洗液”、“冲洗液”、“样本缓冲液”、“样本稀释液”，除非特别说明，均为同一种溶液，用于稀释样品浓度或洗脱样品。
如本文所用，术语“抗体”通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。例如，抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(又称为互补决定区(CDR))。通常每个VH和VL由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。抗体可以具有不同的类型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
术语“抗原结合部分”或“抗原结合片段”或“受体结合域”，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。在一些实施例中，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如scFv)、嵌合抗体，双抗体和包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的至少一部分抗体的多肽。抗体的抗原结合片段可从给定抗体(例如，在本申请中提供的抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体中)通过本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学切割方法)获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选特异性。
如本文所用，“抗原”是指新冠病毒全病毒裂解液的抗原或者重组表达的新冠病毒抗原。抗原可以选自新冠病毒膜蛋白(M)抗原、包膜蛋白(E)抗原、刺突蛋白(S)抗原、和/或核衣壳蛋白(N)抗原。在一些实施例中，新冠病毒抗原选自刺突蛋白(S)和/或核衣壳蛋白(N)抗原。优选地，所述新冠病毒抗原为新冠病毒S蛋白的S1亚基抗原、新冠病毒S亚基的RBD抗原以及N蛋白抗原。本说明书的一些实施例中的新冠病毒S亚基的RBD抗原可采用常规重组表达的方法生产。例如，通过构建表达新冠病毒S亚基的RBD抗原的质粒。示例性质粒包括但不限于pFastBac1、pTT5。还例如，通过表达载体转染表达细胞(如CHO细胞、SF9细胞)，通过细胞表达纯化得到新冠病毒S亚基的RBD抗原重组蛋白。
术语“新型冠状病毒”(SARS-CoV-2)”或术语“新冠”，也被称为“2019-nCoV”或“COVID-19”，是β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)一旦侵入人体，便会引发一系列免疫反应，产生抗体。人体从感染到免疫过程中，IgM抗体在感染后快速产生，含量较低并且持续的时间较短，因此通常被用来作为判断急性感染期的诊断指标。而机体中合成IgG抗体的时间要晚于IgM抗体，IgG抗体的合成含量高且在体内存在时间较长，甚至可能长期存在。因此，IgG抗体可以作为感染过新冠病毒后期的指示靶标或用来验证疫苗接种效果。
当前检测新冠抗体的方法包括血清学检测和核酸检测。血清学检测方法包括化学发光法、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、胶体金法检测法。然而，现有的血清学检测方法仅限于分析新冠病毒总抗体(Ab)和IgM抗体，但不能区分新冠病毒抗体的来源。例如，不能准确区分受试者体内的抗体是感染病毒后自身产生的抗体、接种灭活病毒疫苗产生的抗体，还是由接种重组疫苗或mRNA疫苗而产生的。因此，可能存在无法准确评估不同疫苗的免疫保护效果的技术问题。
本说明书一方面提供了一种区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条。双试纸条包括第一试纸条和第二试纸条，第一试纸条和第二试纸条均包括检测膜和结合垫。检测膜上均设置有检测线(T线)，第一试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体中的一个，第二试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体中的另一个。例如，第一试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体，第二试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体。又例如，第一试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体，第二试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体。
在一些实施例中，上述抗体可以为鼠抗人IgG抗体。在一些实施例中，检测线处抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体的浓度为0.2-1.8mg/ml。在一些实施例中，检测线处抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体的浓度为0.2-1.6mg/ml。在一些实施例中，检测线处抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体的浓度为0.4-1.6mg/ml。在一些实施例中，检测线处抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体的浓度可以为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.8mg/ml、1.2mg/ml、1.6mg/ml或1.8mg/ml。在一些实施例中，检测线处抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体的浓度为0.5mg/ml。在一些实施例中，检测线处抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体的浓度为1.6mg/ml。
本说明书一个或多个实施例中的双试纸条的检测线(T线)和质控线(C线)设置于检测膜上。其中，T线是由喷点在结合垫上的化合物(例如，蛋白)形成的一条线。C线是由喷点在结合垫上的化合物(例如，蛋白)形成的另一条线。在一些实施例中，在试纸条或检测试剂盒中会指示出检测线位置，加入待检测样本后，可通过观察检测线上的出线显色情况判断样品中的分子是否与检测线上的化合物发生反应。
在一些实施例中，第一试纸条和第二试纸条的结合垫上含有与第一试纸条和第二试纸条的检测线包被的抗体所对应的新冠病毒重组S蛋白或新冠病毒重组N蛋白。也就是说，当第一试纸条的检测线包被的是抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体时，第一试纸条的结合垫上含有的是新冠病毒重组S蛋白；当第二试纸条的检测线包被的是抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体时，第二试纸条的结合垫上含有的是新冠病毒重组N蛋白。在一些实施例中，新冠病毒重组S蛋白或新冠病毒重组N蛋白由标记物标记。在一些实施例中，标记物为带有颜色的物质，例如，乳胶、胶体金或带有颜色的水溶性物质。优选地，所述标记物为胶体金。
在一些实施例中，抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体可以包括抗新冠病毒重组S蛋白的S1亚基抗体和抗S1亚基中的RBD抗体。相对应地，所述新冠病毒重组S蛋白包括新冠病毒重组S蛋白的S1亚基与S1亚基中的RBD。S1亚基与S1亚基中的RBD分别由标记物标记。
在一些实施例中，抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体可以分别是抗新冠病毒重组S蛋白和N蛋白的单克隆抗体，分别是如申请号CN202111501645.X和CN202111361909.6中所示的单克隆抗体。应当注意的是，所有针对新冠病毒重组S蛋白和N蛋白的抗体均能实现本发明所产生的效果，本发明对比并不进行限制。由于病毒不断变异，本发明的新冠病毒重组S蛋白和N蛋白是指任何新冠病毒分支的S蛋白和N蛋白，其氨基酸序列或核苷酸序列可通过技术网站(例如，NCBI)获得。
在一些实施例中，检测膜上还设置有质控线(C线)，质控线包被羊抗兔抗体。在一些实施例中，第一试纸条和第二试纸条的结合垫上还含有用来与质控线中的羊抗兔抗体对应的兔抗体。兔抗体也由所述标记物标记。
在一些实施例中，质控线处所述羊抗兔抗体的浓度为0.5-1.5mg/ml。在一些实施例中，质控线处所述羊抗兔抗体的浓度为0.8-1.0mg/ml。
在一些实施例中，新冠抗体来源包括第一来源和第二来源，所述第一来源为被动感染新冠病毒产生的和/或接种灭活新冠病毒疫苗产生的，所述第二来源为接种新冠重组蛋白疫苗、腺病毒疫苗和/或mRNA疫苗产生的。灭活新冠病毒疫苗本质上属于没有致病力而保留抗原性的病毒，因此被动感染新冠病毒或接种灭活疫苗后人体内可以产生S蛋白和N蛋白的抗体。而新冠重组蛋白疫苗、腺病毒疫苗和/或mRNA疫苗是通过基因工程技术将表达S蛋白抗原靶点的mRNA导入体内，在体内表达S蛋白并刺激机体产生特异性免疫反应。因此，接种新冠重组蛋白疫苗、腺病毒疫苗和/或mRNA疫苗后人体产生的抗体只含S蛋白抗体。所以，当样本中的新冠病毒抗体的来源为被动感染新冠病毒以及接种灭活病毒疫苗时，表明样本中同时含有新冠病毒S蛋白的抗原和N蛋白的抗原，因此，含有S蛋白抗体的试纸条和含有N蛋白抗体的试纸条的C线和T线处均出现指示色；当样本中的新冠病毒抗体的来源为接种重组疫苗、腺病毒疫苗和/或mRNA疫苗时，表明样本中仅含有新冠病毒S蛋白的抗原，因此，其中一个试纸条的C线和T线处出现指示色，另一个试纸条的C线处出现指示色，T线处不出现指示色。
所述试纸条除了检测膜和结合垫之外，还包括底板、吸水纸和样品垫。
图1是根据本说明书一些实施例所示的区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条中的其中一个试纸条的示例性结构示意图。如图1所示，试纸条可以包括：吸水纸1、质控线2、检测线3、结合垫4、样品垫5、底板6、检测膜7。附加地或可选地，试纸条还可以包括下膜条8，用于当双试纸条放置于检测装置或检测试剂盒中时，用颜色区分这两个试纸条，以免混淆。
本说明书实施例中的检测膜包括但不限于硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜，优选为硝酸纤维素膜。示例性硝酸纤维素膜可以包括S&SAE99、whatman8um、MilliporeM135、或SartoirusCN140等。
样品垫和结合垫的材料不作特别限定。在一些实施例中，样品垫和结合垫的材料可以为玻璃纤维膜、聚酯材料、无纺布或滤纸中的一种。在一些实施例中，样品垫的材质为玻璃纤维，结合垫的材质为聚酯纤维。在一些实施例中，样品垫和结合垫可以经过处理液处理，所述处理液包括Tween20、Tritonx-405、Casein、BSA、PEG-20000，PVP和NaCl中的一种或多种。
本说明书实施例中的吸水纸的材料可以包括但不限于脱脂棉吸水纸、硅胶吸水纸或海绵吸水纸。
本说明书实施例中的底板可以是各种具有支撑作用的薄片。仅作为示例，所述底板的材料可以为聚氯乙烯(PVC)板、聚丙烯(PP)板、聚乙烯(PE)板或聚氨酯(PU)板。
在一些实施例中，可以将吸水纸、检测膜、结合垫、样品垫相互搭接1-2mm，依次黏贴在底板上，经切条机切条，得到免疫层析试纸条。其中，搭接是指样品垫、检测膜、结合垫和吸水纸相邻两个部分相互重合的连接，这样的搭接结构能保证在加样层析过程中样品能依次流经样品垫、检测膜、结合垫和吸水纸。
本说明书一些实施例的另一方面提供了一种检测装置或检测试剂盒。检测装置或检测试剂盒包括上述免疫层析双试纸条。检测装置还可以包括检测笔、检测卡、检测板和/或检测棒。
在一些实施例中，当检测装置为检测笔时，检测笔包括笔型外壳、装配样本冲洗液的底座。在一些实施例中，样本冲洗液的包含0.8％NaCl、0.7％磷酸氢二钠、0.5％T酪蛋白、以及0.02％叠氮化钠。检测笔的结构和外观如公开号为CN307182555S中所示。优选地，检测笔可以是CN307182555S中提供的设计2的外观。在本发明中，还可以将外壳中间单窗支架替换为三窗支架，可以同时装配至多3个试纸条。搭配上述笔型外壳以及三窗支架，本发明实现了两种胶体金免疫层析试纸条的同时检测。在一些实施例中，将上述免疫层析试纸条装入笔型外壳时，需要对第一试纸条和第二试纸条进行区分。例如，可以通过粘贴不同纹样下膜条、或使用不同颜色对第一试纸条和第二试纸条进行区分。
在一些实施例中，当检测装置为检测卡时，检测卡还包括板型卡壳。将上述免疫层析试纸条装入板型卡壳，可以实现区分新冠抗体来源。
本说明书一个或多个实施例提供一种同时使用新冠病毒S蛋白和N蛋白的双试纸条。将两根试纸条装入检测装置(例如，检测笔)可以实现对于新冠抗体的检测，并能区分抗体产生的来源，对新冠感染状况或疫苗接种效果具有辅助诊断或辅助评估作用。例如，当两根试纸条的质控线(C线)处均出现指示色(例如，红色或者紫红色)，检测线(T线)处均不出现指示色时，可以通过显示结果辅助判断受试者未感染新冠病毒或未接种新冠疫苗；当两根试纸条的C线和T线处均出现指示色时，可以辅助判断受试者新冠病毒抗体的来源为被动感染新冠病毒以及接种灭活病毒疫苗；当其中一条试纸条的C线和T线处出现指示色，另一试纸条的C线处出现指示色，T线处不出现指示色时，可以通过显示结果辅助判断受试者新冠病毒抗体的来源为接种重组疫苗、腺病毒疫苗和/或mRNA疫苗。当接种新冠疫苗的受试者在接种疫苗一年及之后仍然能够检测到新冠抗体，则可以通过显示结果辅助评估疫苗的接种效果可以维持一年及以上。
本说明书一些实施例的另一方面还提供了一种免疫层析双试纸条的结合垫的制备方法，双试纸条包括第一试纸条和第二试纸条。免疫层析双试纸条的结合垫的制备方法包括：
S1，采用柠檬酸三钠与氯金酸制备胶体金；
S2，使用新冠病毒重组S蛋白的S1亚基标记胶体金，得到第一金溶液；
S3，使用新冠病毒重组S蛋白的S1亚基的RBD标记胶体金，得到第二金溶液；
S4，使用新冠病毒重组N蛋白标记胶体金，得到第三金溶液；
S5，将第一金溶液和第二金溶液喷点在处理液处理后的结合垫上，得到第一试纸条或第二试纸条的结合垫之一；
S6，将第三金溶液喷点在所述处理液处理后的结合垫上，得到第一试纸条或第二试纸条的另外一条结合垫。
在一些实施例中，S1亚基与胶体金的投料质量比可以介于1：20至1：10之间。在一些实施例中，S1亚基与胶体金的投料质量比为1：15。
在一些实施例中，RBD与胶体金的投料质量比可以介于1：15至1：5之间。在一些实施例中，RBD与胶体金的投料质量比为1：10。
在一些实施例中，N蛋白与胶体金的投料质量比可以介于1：15至1：5之间。在一些实施例中，N蛋白与胶体金的投料质量比为1：10。
在一些实施例中，第一试纸条的结合垫和第二试纸条的结合垫的处理液包含0.5％-1.0％的磷酸氢二钠、0.5％-1.0％的BSA、0.5％-1.0％的聚乙烯醇以及0.1％-0.5％的曲拉通X-100。
在一些实施例中，第一金溶液和第二金溶液分别以0.04-0.05OD/cm和0.08-0.1OD/cm喷点在处理液处理后的结合垫上。
在一些实施例中，第三金溶液以0.015-0.02OD/cm喷点在处理液处理后的结合垫上。
本说明书一些实施例的又一方面提供了一种免疫层析双试纸条在新冠抗体检测、新冠疫苗接种效果检测或新冠抗体来源检测中的应用。所述新冠抗体检测包括使用免疫层析双试纸条检测样品中新冠病毒或其变体的抗体。例如，可以通过免疫层析双试纸条检测受试者接种针对新冠病毒或其变体的疫苗后是否产生有效免疫、检测受试者感染新冠病毒或其变体后是否产生有效免疫、或是检测通过生物学方法获得的抗新冠病毒抗体。在一些实施例中，所述样品来源于感染或疑似感染新冠病毒或其变体的受试者，感染新冠病毒或其变体后康复者，接种针对新冠病毒或其变体的疫苗的受试者，或者通过生物学方法获得的抗新冠病毒或其变体的抗体。
本说明书一些实施例的又一方面提供了免疫层析双试纸条在检测装置或检测试剂盒中的应用，该检测装置包括检测笔、检测卡、检测板和/或检测棒。
在一些实施例中，以检测装置为检测笔为例，上述免疫层析双试纸条在检测笔中的应用可以包括如下步骤：
1、采集指尖血样本
采集过程如图2所示。
S201，使用清洁剂清洗双手或用酒精棉片a擦拭双手，在取样之前保持取手指干净。
S202，取下采血针b的上盖。
S203，将取样针紧紧抵住穿刺部位，刺破手指。
S204，顺指尖方向挤压手指出血。
S205，将检测笔的取样头浸润指尖血，采样完成。或将指尖血滴在上样窗。
在一些实施例中，所述样本还可以为静脉血。静脉血采样步骤可以包括：使用采血针规范采取静脉血，装入采血管密封并做好标记；使用移液器将血清/血液/血浆样本均匀地涂在取样头上或滴在上样窗中待检测。
2、检测样本
(1)本发明涉及传染病取样，因此在筛查疑似具有传染源的检测时检测人员需按照检验传染病的防护措施穿戴防疫服，佩戴医用口罩、医用外科手套等防护装备。居民自测等小型现场直接按照说明书规范取样检测即可。
(2)笔形检测：将采好样的取样头插到装有450uL样本冲洗液的底座中，静置15分钟进行层析。底座应垂直放置于桌面上。层析时，底座与检测笔均为垂直于桌面或者检测台进行向上层析，应尽量避免笔身以及底座晃动或者垂直于检测台。观察样本是否正常层析，如果未正常层析应重新拔出取样头，重新插入底座。15min之后观察出线情况。
在一些实施例中，当检测装置为检测板时，(2)中的检测过程是板形检测。即将血液滴入上样窗后再滴入3滴样本缓冲液进行层析。
3、结果判断
图3是根据本说明书一些实施例所示的区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条的检测结果示意图。
仅作为示例，第一试纸条1为针对S蛋白抗体检测的试纸条，第二试纸条2为针对N蛋白抗体检测的试纸条。如A中所示，当样本中不含新冠病毒抗体时，第一试纸条1和第二试纸条2的质控线(C线)处均出现指示色(例如，红色或者紫红色)，第一试纸条1和第二试纸条2的检测线(T线)处均不出现指示色；如B中所示，当样本中的新冠病毒抗体的来源为被动感染新冠病毒以及接种灭活病毒疫苗时，第一试纸条1和第二试纸条2的C线和T线处均出现指示色；如C中所示，当样本中的新冠病毒抗体的来源为接种重组疫苗、腺病毒疫苗或mRNA疫苗时，第一试纸条1的C线和T线处出现指示色，另一个试纸条的C线处出现指示色，T线处不出现指示色。
本发明的免疫层析双试纸条可用于快速检测接种新冠病毒疫苗的受试者血清中是否产生抗体、是否产生有效免疫，进而检测疫苗的接种效果。
实施例
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，若无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、制备蛋白标记胶体金的金溶液
1.将来自杭州旭科生物的COVID-19的重组S蛋白的S1亚基、RBD以及N蛋白在pH为7.0的0.005mol/L氯化钠溶液中进行透析过夜处理，透析完成后离心去除聚合物；
2.使用柠檬酸三钠与氯金酸制备胶体金，具体步骤如下：(1)将氯金酸配制成浓度为0.01％水溶液，加热至沸；
(2)加入0.5mL-1.5mL的浓度为1％柠檬酸三钠水溶液；
(3)继续加热煮沸，此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后2～3min左右变成红色。继续加热煮沸15min左右停止加热；
(4)冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积，得到直径为40-50nm的胶体金溶液。
3.使用0.1mol/L的K2CO3溶液将直径为40-50nm的胶体金溶液调节pH为9.0；
4.将重组S蛋白的S1亚基、RBD以及N蛋白溶液分别与胶体金溶液混合，搅拌5分钟。S1亚基与胶体金溶液的投料质量比为1：15、RBD与胶体金溶液的投料质量比为1：10、N蛋白与胶体金溶液的投料质量比为1：10。再加入一定量5％的BSA溶液，离心40分钟后吸弃上清液，重悬离心后再使用相同缓冲液复溶，最后加入0.5mg/mL叠氮钠溶液；
5.使用1100r/min离心20min后，弃去沉淀，再使用14000g在4℃离心1小时，吸弃上清再用含1％BSA的PB溶液重悬，得到胶体金标记的蛋白溶液。
实施例2、试纸条的优化
一、抗S蛋白的S1亚基IgG抗体、抗RBD IgG抗体检测方式的确定
使用以下几组方案作为筛选，筛选出一批性能比较优的检测方式，进行下一步优化。在本方案中，使用鼠抗人IgG标记胶体金作为结合垫材料；T线检测区包被相应蛋白。
实验组一：设置三根试纸条，试纸条1的T线包被S蛋白的S1亚基0.8mg/mL；试纸条2的T线包被N蛋白0.4mg/mL；以及试纸条3的T线包被RBD 0.8mg/mL；
实验组二：设置两根试纸条，试纸条1的T线包被S蛋白的S1亚基0.8mg/mL与RBD0.8mg/mL，试纸条2包被N蛋白0.4mg/mL。；
实验组三：设置两根试纸条，试纸条1的T线包被S蛋白的S1亚基0.5mg/mL与RBD0.5mg/mL，试纸条2包被N蛋白0.4mg/mL。
需要说明的是，下述表格中检测线的显色值参考来自于比色卡，数字越高表示显色越深。显色值范围为1-10，其中读值3.5及以上的色度判定为肉眼可见的出线。后续表格中T线出现深浅均以此读值方式表现。因此，肉眼可见出线的判定标准为T线的显色色度是否达到色卡读值3.5，其中0表示阴性。
使用上述3组试纸条组笔检测50例人体血清，C线读值均≥8，T线读数结果如表1-A、1-B和1-C所示。
表1-A实验组一使用三组试纸条检测50例人体血清的T线读数结果
表1-B实验组二使用三组试纸条检测50例人体血清的T线读数结果
表1-C实验组三使用三组试纸条检测50例人体血清的T线读数结果
从样本2、17、18、21、39的读数来看，实验组二的中强阳性在实验组三中大部分只能读到中强阳；5、6、13、19、20、22、34、37、38、40、42实验组二的弱阳性有的在实验组三中未能被检测出来。因此得到结论：T线的包被浓度越高，灵敏度越好。因此实验组二的检测方式优于实验组三。
从样本5、6、17、19、20、22、29、33、36、37、38、42、45、47、50的实验结果来看，弱阳性时实验组一与实验组二结果相差不大，实验组二在40、45、50样本时显示出了更好的灵敏度；而从样本2、11、18、39的结果来看，强阳性时实验组二的性能优于实验组一。可见，S蛋白的S1亚基与RBD共同包被在同一根试纸条时，试纸条对样本的检出更为灵敏。
综上所述，选择实验组二作为优化结果，即使用一根试纸条同时检测抗S蛋白的S1亚基与抗RBD的IgG抗体。
二、标记物和包被物的确定
将方案一中的包被原料与标记原料作为实验变量，探究包被原料与标记原料对检测灵敏度的影响。
实验组一：试纸条1使用S蛋白的S1亚基和RBD包被在T线；试纸条2使用N蛋白包被在T线。使用鼠抗人抗IgG抗体标记胶体金，喷点后得到结合垫；
实验组二：试纸条1使用S蛋白的S1亚基和RBD标记胶体金，试纸条2使用N蛋白标记胶体金，喷点后得到结合垫。使用鼠抗人抗IgG抗体包被在T线。
使用上述2组试纸条放置在检测笔中检测50例人体血清，C线读值均≥8，T线读数结果如表2-A和2-B所示。
表2-A使用两组试纸条检测50例人体血清的T线读数结果
表2-B使用两组试纸条检测50例人体血清的T线读数结果
S蛋白IgG抗体检测：从样本编号2、17、18、21、22、27、36、37、38、39的结果来看，强阳性情况下实验组二比实验组一显色强约1-2个色度；从样本编号5、6、13、15、16、19、20、27、29、33、34、40、42、45、50的结果来看，弱阳性情况下实验组二比实验组一显色约强半个色度，实验组二检测灵敏度高于实验组一。因此，在S蛋白IgG抗体的检测中，S蛋白的S1亚基和RBD适合标记胶体金，鼠抗人抗IgG抗体更适合包被在T线。
N蛋白IgG抗体检测：从样本编号2、10、11、13、14、16、18、19、20、29、39、40、42、43的结果来看，在实验组二显色为强阳性的情况下，实验组一的显色普遍弱，甚至相当一部分读数为阴性；而从样本编号6、27、38的显色结果来看，低浓度时实验组一和实验组二显色结果相当。因此，选择实验组二作为优化结果。综上所述，在N蛋白IgG抗体的检测中，N蛋白适合标记胶体金，鼠抗人抗IgG抗体更适合包被在T线。
实施例3、试纸条的组建
(1)结合垫前处理：使用含0.7％的磷酸氢二钠、0.5％BSA、0.5％聚乙烯醇、0.1％曲拉通X-100配置成结合垫处理液处理聚酯纤维，处理完成之后在45℃-55℃烘箱烘干1小时以上。
(2)样品垫的处理：样品垫处理液的配方包括含0.11％碳酸钠、0.2％叠氮化钠、3.8％硼砂、0.05％乙二胺四乙酸钠、1％聚乙烯吡咯烷酮、0.5％T酪蛋白、1.5％Triton X-405，将处理液涂布在玻璃纤维上，45℃-55℃烘干1小时以上。
(3)将实施例1中得到的胶体金溶液配置成特定浓度，以喷量2uL/cm的速度喷点在步骤(1)处理好的结合垫上，喷点完成后放置于烘箱以37℃烘干过夜或者45℃烘干2小时以上，切条得到结合垫。其中，金喷量(uL/cm)与试纸条单位长度内金颗粒的含量(OD/cm)的关系式如下：
喷量(uL/cm)×试纸条宽度(cm)×金水浓度(OD/uL)＝试纸条使用的金总量(OD)＝单位长度内金颗粒的含量(OD/cm)×试纸条宽度(cm)。
(4)将鼠抗人抗IgG抗体使用1×PBS溶液稀释到0.8-1.2mg/mL，以喷量1uL/cm的速度喷点在硝酸纤维素膜上，喷点完成后放置于烘箱以37℃烘干过夜或者45℃烘干2小时以上。
(5)将吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫相互搭接1-2mm，即为免疫层析试纸条。
将免疫层析试纸装入检测笔或检测板时，搭配上样缓冲液进行使用。装入笔型外壳时，试纸条粘贴下膜条，便于区分第一试纸条和第二试纸条。
实施例4、最低检出限(LOD)的评价
在本实施例中，C线羊抗兔抗的抗体包被浓度优选地为1mg/mL。
同样，优选地，在结合垫中兔抗体标记的胶体金颗粒浓度为0.015OD/cm。
本实施例中使用人源化IgG抗体质控为NIBSC产品，此产品基于WHO标准时抗SARS-CoV-2抗体的研究试剂，产品代码20/130。
该材料是通过血浆透析，从COVID-19PCR阳性康复后至少四周的患者身上获得的，该样本中抗体的信息如表3所示
表3质控品信息
名称 GM 96％CI 单位
Neut Ab 1300 981-1719 IU/ml
抗RBD-IgG 502 382-660 BAU/mL
抗S1-IgG 588 398-870 BAU/mL
抗Spike-IgG 476 418-542 BAU/mL
抗N-IgG 747 214-2606 BAU/mL
Neut Ab：中和抗体；CI：置信区间；IU：国际单位；BAU：中和抗体单位。
使用该质控获得本发明的LOD为：
抗Spike-IgG的LOD为59.5BAU/mL、或者0.2975BAU/Test；
抗RBD-IgG的LOD为62.8BAU/mL、或0.314BAU/Test；
抗S1-IgG的LOD为73.5BAU/mL、或0.368BAU/Test；
抗N-IgG的LOD为9.34BAU/mL、或0.0467BAU/Test。
实施例5、分析特异度评价
本发明选取以下表4中所示抗体测试本发明的分析特异度，结果表明，检测如下样本时，两根试纸条的T线均不显色，检测结果均为阴性，表明本发明的双试纸条在检测新冠中和抗体IgG来源时具有特异性，其检测结果不会被其他类型的抗体干扰。
表4分析特异度评价用抗体
除此之外，本发明还选取了如下表5中所示的内源性或外源性干扰物质，包括静脉真空采血管中添加的稳定剂，对于本发明的双试纸条进行干扰测试。结果如下表5所示。
表5内源性或外源性干扰物质
/>
通过表5中的检测结果可以看出，本发明所提供的双试纸条与上表中的干扰物质均无交叉反应，分析特异度良好。
实施例6、临床样本测试
本实施例中选取了国内外接种不同种类疫苗的人体血清样本，采样时距离接种时间至少4周以上，样本具体来源以及信息见表6。
表6临床样本测试
除此之外，本发明还选取了30例核酸阳性新冠患者康复(以核酸检测结果转阴性为准)至少4周后的血液样本进行检测，结果显示两根试纸条与试纸条均出线，即检测结果均为阳性，表明临床样本检测准确性达到了100％，可见本发明双试纸条初步可以区分抗体产生来源。
本发明所披露的一种区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条，带来的有益效果包括但不限于：(1)本说明书一个或多个实施例中使用抗新冠病毒S蛋白的两种亚基分别标记金颗粒，提升了新冠病毒抗体检测的准确性与灵敏度；(2)本发明所提供的双试纸条与多种干扰物质均无交叉反应，分析特异度良好；(3)本说明书一个或多个实施例提供一种同时使用新冠病毒S蛋白和N蛋白的双试纸条，能区分抗体产生的来源，对新冠感染状况或疫苗接种效果具有辅助诊断或辅助评估作用。需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。
本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (18)

1.一种区分新冠抗体来源的免疫层析双试纸条，其特征在于，所述双试纸条包括第一试纸条和第二试纸条，所述第一试纸条和所述第二试纸条均包括检测膜和结合垫；其中，
所述检测膜上均设置有检测线，所述第一试纸条的检测线包被抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体中的一个，所述第二试纸条的检测线包被抗所述新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体中的另一个；
所述第一试纸条和所述第二试纸条的结合垫上含有与所述第一试纸条和所述第二试纸条的检测线包被的抗体所对应的新冠病毒重组S蛋白或新冠病毒重组N蛋白，所述新冠病毒重组S蛋白或新冠病毒重组N蛋白由标记物标记。
2.根据权利要求1所述的免疫层析双试纸条，其特征在于，所述检测膜上还设置有质控线，所述质控线包被羊抗兔抗体。
3.根据权利要求2所述的免疫层析双试纸条，其特征在于，所述第一试纸条和所述第二试纸条的结合垫上含有用来与所述质控线中的羊抗兔抗体对应的兔抗体，所述兔抗体由所述标记物标记。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫层析双试纸条，其特征在于，所述标记物为乳胶或胶体金。
5.根据权利要求4所述的免疫层析双试纸条，其特征在于，所述抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体包括抗新冠病毒重组S蛋白的S1亚基的IgG抗体和抗新冠病毒重组S蛋白的S1亚基中的RBD的IgG抗体；所述新冠病毒重组S蛋白包括新冠病毒重组S蛋白的S1亚基与所述S1亚基中的RBD，所述S1亚基和所述RBD分别由所述标记物标记。
6.根据权利要求1所述的免疫层析双试纸条，其特征在于，新冠抗体来源包括第一来源和第二来源，所述第一来源为被动感染新冠病毒产生的和/或接种灭活新冠病毒疫苗产生的，所述第二来源为接种新冠重组蛋白疫苗、腺病毒疫苗和/或mRNA疫苗产生的。
7.根据权利要求2所述的免疫层析双试纸条，其特征在于，所述质控线处羊抗兔抗体的浓度为0.5-1.5mg/ml。
8.根据权利要求5-7任一项所述的免疫层析双试纸条，其特征在于，所述检测线处抗新冠病毒重组S蛋白的IgG抗体和抗新冠病毒重组N蛋白的IgG抗体的浓度为0.2-1.8mg/ml。
9.根据权利要求8所述的免疫层析双试纸条，其特征在于，所述双试纸条还包括底板、吸水纸和样品垫。
10.一种检测装置或检测试剂盒，包括如权利要求1所述的免疫层析双试纸条，其中，所述检测装置还包括检测笔、检测卡、检测板和/或检测棒。
11.一种免疫层析双试纸条的结合垫的制备方法，所述双试纸条包括第一试纸条和第二试纸条，包括：
采用柠檬酸三钠与氯金酸制备胶体金；
使用所述新冠病毒重组S蛋白的S1亚基标记所述胶体金，得到第一金溶液；
使用所述新冠病毒重组S蛋白的S1亚基的RBD标记所述胶体金，得到第二金溶液；
使用所述新冠病毒重组N蛋白标记所述胶体金，得到第三金溶液；
将所述第一金溶液和所述第二金溶液喷点在处理液处理后的结合垫上，得到所述第一试纸条或第二试纸条的结合垫之一；
将所述第三金溶液喷点在所述处理液处理后的结合垫上，得到所述第一试纸条或第二试纸条的另外一条结合垫。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，S1亚基与胶体金的投料质量比为1：15，RBD与胶体金的投料质量比为1：10。
13.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，N蛋白与胶体金的投料质量比为1：10。
14.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述第一试纸条的结合垫和所述第二试纸条的结合垫的所述处理液包含0.5％-1.0％的磷酸氢二钠、0.5％-1.0％的BSA、0.5％-1.0％的聚乙烯醇以及0.1％-0.5％的曲拉通X-100。
15.根据权利要求11-14任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第一金溶液和第二金溶液分别以0.04-0.05OD/cm和0.08-0.1OD/cm喷点在所述处理液处理后的结合垫上。
16.根据权利要求11-14任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第三金溶液以0.015-0.02OD/cm喷点在所述处理液处理后的结合垫上。
17.一种如权利要求1-9中任一项所述的免疫层析双试纸条在新冠抗体检测、新冠疫苗接种效果检测或新冠抗体来源检测中的应用。
18.一种包含如权利要求1-9任一项所述的免疫层析双试纸条在检测装置或检测试剂盒中的应用，所述检测装置包括检测笔、检测卡、检测板和/或检测棒。
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