CN116589436A - 一种具有抗炎活性的木脂素化合物、制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种具有抗炎活性的木脂素化合物、制备方法及其应用，涉及医药领域，为结构式如式(Ⅰ)所示的化合物或结构式如式(Ⅰ)所示的化合物在药学上可接受的盐：。本发明所提供的木脂素化合物，经体外药理实验证实，在其浓度为10μM时，细胞增殖率为120％，NO生成量为6.7299，表明其具有良好的抗炎活性。因此该木脂素化合物、或其衍生物、或其药用盐可用于抗炎药物中。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种具有抗炎活性的木脂素化合物、制备方法及其应用。
背景技术
炎症是机体对于外界刺激物和损伤产生的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍等。短期炎症有助于清除炎症物质，促进康复，而炎症过度或长期炎症能导致癌症、关节炎、败血症等疾病发生，严重威胁人体健康。炎症性疾病的治疗药物主要包括甾体类和非甾体类抗炎药。目前所用的这些药物或多或少存在副作用，如非甾体抗炎药导致造血系统改变、心血管损害、哮喘等，对人类健康产生了较为严重的危害。因此，从天然产物中寻找安全、高效的抗炎药物对保障人类生命健康意义重大。
木脂素是一类由两分子苯丙素衍生物(即C6-C3单体)聚合而成的天然化合物，多数呈游离状态，少数与糖结合成苷而存在于植物的木部和树脂中，故而得名。现代药理学研究表明，木脂素在治疗炎症疾病方面具有巨大潜力。
锥(Castanopsis chinensis)又名桂林栲、栲栗、小板栗等，为壳斗科锥属植物，广泛分布于广东、广西、贵州西南部和云南东南部，在民间主要用于止泻、止血及胃肠道炎等疾病的治疗。目前未见有从锥植物中提取具有抗炎活性的新木脂素Chinensin C成分的报道。鉴于此，本发明提供一种具有抗炎活性的木脂素化合物、制备方法及其应用。
发明内容
本发明为了解决上述的技术问题，提供一种具有抗炎活性的木脂素化合物、制备方法及其应用。
本发明为了解决上述技术问题，第一个目的是提供一种具有抗炎活性的木脂素化合物，为结构式如式(Ⅰ)所示的化合物或结构式如式(Ⅰ)所示的化合物在药学上可接受的盐：
其中，本发明所提供的具有抗炎活性的新木脂素成分为首次从植物锥(Castanopsis chinensis)的叶中分离得到，分子式为C38H37O10，该新的木脂素类化合物可命名为Chinensin C。所述药学上可接受的盐选自新木脂素与有机酸或无机酸所成的盐。也可以为本发明的木脂素化合物药用酯化衍生物。
本发明的有益效果是：本发明所提供的木脂素化合物Chinensin C，经体外药理实验证实，在其浓度为10μM时，细胞增殖率为120％，NO生成量为6.7299，表明其具有良好的抗炎活性。因此该木脂素化合物Chinensin C、或其衍生物、或其药用盐可用于抗炎药物中。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
第二个目的是提供一种具有抗炎活性的木脂素化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)取锥叶，将所述锥叶粉碎后加入含有醇类化合物的水溶液进行浸提，将浸提得到的提取液进行减压浓缩，得到水提取液；
(2)将所述水提取液采用石油醚进行脱脂，脱脂后进行减压浓缩，得到脱脂后的水提取液；
(3)将所述脱脂后的水提取液进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用甲醇-水混合溶液进行梯度洗脱，收集含有木脂素化合物的洗脱液Ⅰ；将收集的含有木脂素化合物的洗脱液Ⅰ进行Diaion HP20SS柱层析，采用甲醇-水混合溶液进行梯度洗脱，再次收集含有木脂素化合物的洗脱液Ⅱ；
(4)将收集的含有木脂素化合物的洗脱液Ⅱ注入反向高效液相色谱进行分离，采用体积分数为42％甲醇水溶液进行等度洗脱，收集色谱峰的保留时间为8.93min的洗脱液，将保留时间为8.93min的洗脱液进行浓缩干燥，得到如结构式(Ⅰ)所示的化合物，即为木脂素化合物；
采用上述进一步方案的有益效果是：本发明利用锥叶为原料提取分离得到的强效抗炎成分Chinensin C，其制备方法简单，操作容易，且利用叶子为原料进行提取，资源丰富，具有很好的潜在经济效益，且得到新的抗炎成分Chinensin C性质稳定、易存放。其抗炎活性良好，有望作为先导化合物开发出新的炎症治疗药。
进一步，步骤(1)中所述含有醇类化合物的水溶液中的醇类化合物包括乙醇、甲醇、丙醇中的任意一种或至少两种的混合，所述含有醇类化合物的水溶液中醇类化合物与水的体积比为(70～90)：(30～10)；
步骤(1)具体为：取锥叶，将所述锥叶粉碎后加入含有醇类化合物的水溶液进行浸提，加入所述含有醇类化合物的水溶液的体积与锥叶重量的比值为3～8L/Kg，过滤之后，对过滤的滤渣进行再次浸提，所述浸提次数为2～5次，每次所述浸提的时间为2～4d，将浸提得到提取液在45～70℃下进行减压浓缩使其中的醇类化合物完全的分离出来，得到水提取液。
进一步，步骤(2)具体为：将所述水提取液使用石油醚进行脱脂，所述水提取液与石油醚的体积比为0.5～1，所述脱脂次数为2～4次，脱脂后在30～80℃下进行减压浓缩，得到脱脂后的水提取液。
进一步，步骤(3)具体为：将所述脱脂后的水提取液进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用体积比为0～100％甲醇-水混合溶液依次进行梯度洗脱，收集含有木脂素化合物的洗脱液Ⅰ；将收集的含有木脂素化合物的洗脱液Ⅰ进行Diaion HP20SS柱层析，采用体积比为0～100％甲醇-水混合溶液依次进行梯度洗脱，再次收集含有木脂素化合物的洗脱液Ⅱ。
进一步，步骤(4)中，所述高效液相色谱进行分离的参数为：Matena DimensionsC18色谱柱，所述Matena Dimensions C18色谱柱的填料的粒度为5μm，所述MatenaDimensions C18色谱柱的柱温为40℃。
第三个目的是提供一种药物组合物，包括如上述所述的木脂素化合物或药学上可接受的盐，及药学上可接受的载体和/或辅料。
所述药物组合物中的活性成分(本发明的木脂素化合物或药学上可接受的盐)的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。所述药学上可接受的载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。
进一步，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、口含片、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂或控释剂。
所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型均可。所述药物组合物的适合给药剂量，根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。
第四个目的是提供一种药物组合物的应用，将如上述所述的药物组合物用于制备具有抗炎活性的药物。
第五个目的是提供一种具有抗炎活性的木脂素化合物的应用，将如上述所述的木脂素化合物或药学上可接受的盐用于制备具有抗炎活性的药物。
附图说明
图1为本发明化合物Chinensin C的1H-NMR(500MHz,CD3OD)图谱；
图2为本发明化合物Chinensin C的13C-NMR(125MHz,CD3OD)图谱；
图3为本发明化合物Chinensin C的HSQC图谱；
图4为本发明化合物Chinensin C的HMBC图谱；
图5是化合物Chinensin C的1H-1H COSY图谱；
图6为本发明化合物Chinensin C的HREIMS图谱；
图7为本发明化合物Chinensin C的ECD图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1：制备及其结构的鉴定
1、一种具有抗炎活性的木脂素化合物的制备方法
本发明的Chinensin C为从植物锥(Castanopsis chinensis)叶子中提取分离纯化的新木脂素类化合物，其分离纯化过程如下：
(1)干燥锥叶7.5kg粉碎后，40L的80％甲醇浸泡提取3次，每次浸提3d，滤过。合并滤液，减压浓缩得到水提取液2.1L，
(2)步骤(1)得到的水提取液用石油醚(3.0L)进行脱脂3次，脱脂后的水提取液减压浓缩去除石油醚后，得到脱脂后的水提取液；
(3)将脱脂后的水提取液经Sephadex LH-20凝胶(9.5cm×32.0cm)柱层析分离，依次用甲醇：水(0％、20％、40％、60％、80％、100％，各3L)进行梯度洗脱，TLC检测合并相同组分，得到9个流分(Fr.1～9)。其中Fr.7(28.0g)再经Diaion HP20SS(5.5cm×30.0cm)柱层析分离，依次用甲醇：水(0％、20％、40％、60％、80％、100％，各1.5L)进行梯度洗脱，TLC检测合并相同组分，得到12个流分(Fr.7.1～7.12)；收集含有木脂素化合物的洗脱液Ⅱ(Fr.7.11(2.4g))；
(4)将收集含有木脂素化合物的洗脱液Ⅱ(Fr.7.11(2.4g))采用反向高效液相色谱，42％甲醇水溶液作为流动相，收集色谱峰的保留时间为8.93min的洗脱液，将保留时间为8.93min的洗脱液进行浓缩干燥，得到如结构式(1)所示的化合物，即为新木脂素化合Chinensin C(30mg)。
2、Chinensin C的鉴定：
其中，图1为本发明化合物Chinensin C的1H-NMR(500MHz,CD3OD)图谱；图2为本发明化合物Chinensin C的13C-NMR(125MHz,CD3OD)图谱；图3为本发明化合物Chinensin C的HSQC图谱；图4为本发明化合物Chinensin C的HMBC图谱；图5是化合物Chinensin C的1H-1HCOSY图谱；图6为本发明化合物Chinensin C的HREIMS图谱；图7为本发明化合物ChinensinC的ECD图。
本发明的木脂素化合物Chinensin C，白色无定形粉末，在254nm紫外灯下有亮斑，与1％ FeCl3-EtOH显色剂反应呈棕色斑点。HREIMS图谱(图6)中显示其准分子离子峰为m/z:653.2329[M-H]-(计算值653.2392，C38H37O10)，提示分子式为C38H38O10，不饱和度为20。1H-NMR(500MHz,CD3OD)、13C-NMR(125MHz,CD3OD)的数据如下表1所示。
表1化合物Chinensin C的NMR数据(in CD3OD)
根据以上质谱、一维、二维核磁及ECD计算等波谱数据的综合分析，解析推导出化合物结构式如式(Ⅰ)所示，命名为Chinensin C：
实施例2：活性性检测
1、实验方法
1.1细胞培养和传代
细胞培养和传代：RAW264.7(购买于中国典型培养物保藏中心)培养于由10％胎牛血清、100U/mL青霉素和链霉素和DMEM原液配制而成的培养液中，放置于37℃、5％CO2的培养箱内进行孵育、培养。每隔24h换1次培养液，并用显微镜观察细胞状态。当培养皿内细胞生长到总体积的80％左右时，就可以对细胞进行传代处理。因为RAW264.7细胞是一种半贴壁细胞，所以它不需要用胰酶进行消化。将细胞培养上清丢弃后，先用PBS缓冲液清洗旧培养基，然后加入新鲜的培养基并通过吹打的方式使细胞从培养皿底部分离出来，从而获得细胞悬液。最后，在适当的密度下，将细胞转移至新的培养皿中培养。
1.2CCK-8法测定单体化合物的RAW264.7细胞增值检测
CCK-8法测定单体化合物的RAW264.7细胞增值检测：将实验组设置为给药物组、对照组、空白组。给药组为2.5、5、10、20、40、80μM的实施例制备的化合物Chinensin C，每组设3个复孔，调整细胞密度为2×104/孔。在96孔细胞培养板中分别用培养液和LPS铺板，孵24h，加入上述的不同浓度的实施例1制备的化合物，孵育48h后，加入每100μL含有10μL的CCK-8试剂的细胞培养液，继续孵育1h后，将酶标仪波长设置为450nm测OD值。
细胞增值率(％)＝[(O给药-O空白)/(O对照-O空白)]×100％
式中，O给药：样品+细胞培养基+CCK-8；O对照：细胞培养基+CCK-8；O空白：样品+CCK-8。
1.3Griess法检测单体化合物对巨噬细胞NO释放的影响
Griess法检测单体化合物对巨噬细胞NO释放的影响：将实验组设置为给药组(样品+LPS+RAW264.7细胞)、LPS模型组(LPS+RAW264.7细胞)、空白组(RAW264.7细胞)。取对数生长期的RAW264.7细胞，以2×104个/孔的密度接种于96孔板。置于CO2培养箱培养贴壁后，弃去细胞培养上清，加入含有1μg/mL的LPS(脂多糖)的各个浓度的样品(2.5、5、10、20、40、80μM的实施例制备的化合物Chinensin C)。培养24h后，取细胞培养上清50μL，然后分别加入恢复至室温的Griess ReagentⅠ和Griess ReagentⅡ液各50μL于96孔板中。同时用细胞完全培养基配制不同浓度的NaNO2溶液(0μM、1μM、2μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、100μM)作为标准溶液，取不同浓度的标准溶液50μL于96孔板并依次加入等体积的Griess试剂。酶标仪540nm波长处测OD值。以NaNO2溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。根据标准曲线计算样品溶液的NO2-浓度，实验结果以NO的生成量表示。
2、活性结果
LPS诱导对巨噬细胞RAW264.7的NO生成量：在浓度为10μM时，Chinensin C的细胞增殖率为120％，NO生成量为6.7299，此时对细胞增值率最高，结果表明Chinensin C对具有较好的抗炎效果，作为唯一的活性成分显著降低LPS诱导RAW264.7细胞释放NO，可有效用于制备抗炎药物，开拓了抗炎药物的新途径和锥植物的新用途，有显著的经济和社会效益。
综上，本发明利用锥叶为原料提取分离得到的强效抗炎成分Chinensin C，其制备方法简单，操作容易，且利用叶子为原料进行提取，资源丰富，具有很好的潜在经济效益，且得到新的抗炎成分Chinensin C性质稳定、易存放。其抗炎活性良好，有望作为先导化合物开发出新的炎症治疗药。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种具有抗炎活性的木脂素化合物，其特征在于，为结构式如式(Ⅰ)所示的化合物或结构式如式(Ⅰ)所示的化合物在药学上可接受的盐：
2.基于权利要求1所述一种具有抗炎活性的木脂素化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取锥叶，将所述锥叶粉碎后加入含有醇类化合物的水溶液进行浸提，将浸提得到的提取液进行减压浓缩，得到水提取液；
(2)将所述水提取液采用石油醚进行脱脂，脱脂后进行减压浓缩，得到脱脂后的水提取液；
(3)将所述脱脂后的水提取液进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用甲醇-水混合溶液进行梯度洗脱，收集含有木脂素化合物的洗脱液Ⅰ；将收集的含有木脂素化合物的洗脱液Ⅰ进行Diaion HP20SS柱层析，采用甲醇-水混合溶液进行梯度洗脱，再次收集含有木脂素化合物的洗脱液Ⅱ；
(4)将收集的含有木脂素化合物的洗脱液Ⅱ注入反向高效液相色谱进行分离，采用体积分数为42％甲醇水溶液进行等度洗脱，收集色谱峰的保留时间为8.93min的洗脱液，将保留时间为8.93min的洗脱液进行浓缩干燥，得到如结构式(Ⅰ)所示的化合物，即为木脂素化合物；
。
3.根据权利要求2所述一种具有抗炎活性的木脂素化合物的制备方法，其特征在于，
步骤(1)中所述含有醇类化合物的水溶液中的醇类化合物包括乙醇、甲醇、丙醇中的任意一种或至少两种的混合，所述含有醇类化合物的水溶液中醇类化合物与水的体积比为(70～90)：(30～10)；
步骤(1)具体为：取锥叶，将所述锥叶粉碎后加入含有醇类化合物的水溶液进行浸提，加入所述含有醇类化合物的水溶液的体积与锥叶重量的比值为3～8L/Kg，所述浸提次数为2～5次，每次所述浸提的时间为2～4d，将浸提得到提取液在45～70℃下进行减压浓缩，得到水提取液。
4.根据权利要求2所述一种具有抗炎活性的木脂素化合物的制备方法，其特征在于，
步骤(2)具体为：将所述水提取液使用石油醚进行脱脂，所述水提取液与石油醚的体积比为0.5～1，所述脱脂次数为2～4次，脱脂后在30～80℃下进行减压浓缩，得到脱脂后的水提取液。
5.根据权利要求2所述一种具有抗炎活性的木脂素化合物的制备方法，其特征在于，步骤(3)具体为：将所述脱脂后的水提取液进行Sephadex LH-20凝胶柱层析，采用体积比为0～100％甲醇-水混合溶液依次进行梯度洗脱，收集含有木脂素化合物的洗脱液Ⅰ；将收集的含有木脂素化合物的洗脱液Ⅰ进行Diaion HP20SS柱层析，采用体积比为0～100％甲醇-水混合溶液依次进行梯度洗脱，再次收集含有木脂素化合物的洗脱液Ⅱ。
6.根据权利要求2所述一种具有抗炎活性的木脂素化合物的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述高效液相色谱进行分离的参数为：Matena Dimensions C18色谱柱，所述Matena Dimensions C18色谱柱的填料的粒度为5μm，所述Matena Dimensions C18色谱柱的柱温为40℃。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的木脂素化合物，及药学上可接受的载体和/或辅料。
8.根据权利要求7所述一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、口含片、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂或控释剂。
9.一种药物组合物的应用，其特征在于，将如权利要求7或8所述的药物组合物用于制备具有抗炎活性的药物。
10.一种具有抗炎活性的木脂素化合物的应用，其特征在于，将如权利要求1所述的木脂素化合物用于制备具有抗炎活性的药物。
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