CN116559315A - 一种牡丹花uplc-ms特征色谱指纹图谱的建立方法及其所含16个特征组分含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种牡丹花UPLC‑MS特征色谱指纹图谱的建立方法，包括1）制备混合对照品溶液：2）制备供试品溶液：3）分别对混合对照品溶液、供试品溶液进行色谱和质谱检测，记录混合对照品溶液、供试品溶液的DAD色谱图和MS质谱图，将记录的供试品溶液的色谱图加载到中药色谱指纹图谱相似度评价软件，以开始时间为2、结束时间为33对图谱进行数据剪切，以S1为参照图谱，经过多点校正、全谱峰匹配，生成UPLC对照特征指纹图谱。本发明能全面反映不同品种牡丹花化学成分特征的分析方法，并评价和鉴别各品种牡丹花样品的内在质量，从而为进一步合理开发利用该植物资源提供了新的化学物质基础。

Description

一种牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法及其所含 16个特征组分含量测定方法
技术领域
本发明属于图谱技术领域，具体涉及一种牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)为毛茛科芍药属多年生落叶灌木，素有“花中之王”的美誉，分布于我国大部分地区，特别是在洛阳、菏泽、铜陵、彭州等地有大量种植。除了作为一种观赏植物外，牡丹根皮部位是一味著名的中药—丹皮，具有清热凉血、活血散瘀的作用(李凯,周宁,李赫宇.牡丹花、牡丹籽成分与功能研究进展[J].食品研究与开发,2012,33(3):228-230.)。另《本草纲目》记载，牡丹花也是一味传统中药材，味苦、性平，具有清热解毒的功效，主治血中伏火、燥热，而牡丹籽在民间常用于治疗腰腿疼痛。并且，牡丹籽油已于2011年被国家卫生监督局列为新资源食品，其富有不饱和脂肪酸、植物甾醇及微量元素等多种具有生理活性的物质，营养价值突出，具有抗氧化，降血脂，保肝，防晒等多种保健功能(侯天兰,王顺利,米生权,等.牡丹籽油营养成分和功能作用研究进展[J].中国油脂,2021,4608:51-55+71.董丽梅,赵秀娟,刘姚,等.油用牡丹不同部位化学成分与开发利用研究进展[J].现代食品科技,2021,3710:348-361.张凯月,贺春玲,侯小改,等.油用牡丹经济价值和景观生态价值研究现状[J].中国农学通报,2019,3510:66-71.)。现代药理研究表明，牡丹具有降血糖、抗炎、镇痛、抑菌、调节心血管系统、抗肿瘤、清除自由基、抗氧化等作用(王新娣,石晓峰,王斌利,等.牡丹化学成分的研究进展[J].中成药,2018,01(40):177-182.)。
近年来，随着牡丹产业的发展，作为生产丹皮的副产品—牡丹花、牡丹叶、牡丹籽的功能活性价值也越来越引起人们的关注和重视。当前，有关牡丹化学成分的研究主要集中在根部，成分类型有黄酮类、酚及酚苷类、单萜及其苷类、三萜及其苷类、芪类、有机酸类、挥发油类、微量元素等(李媛媛,郑艳,黄军祥,等.牡丹皮的综合利用现状与产业发展分析[J].现代中药研究与实践,2012,026(004):83-85.)，而牡丹花作为牡丹的主要副产物，也富含有芍药苷、儿牡丹素类、黄酮类、多酚、多糖等具有抗氧化、抑菌抗炎、除臭等功能活性成分，且产量大，如将这一资源充分拓宽利用，进一步增加牡丹产业资源的附加值，将具有极大的经济和社会效益。
随着各种新型高效分离分析技术的发展，许多微量成分及新的或者难以分离鉴定的成分将会不断被发现，同时，中药指纹图谱作为一种现代鉴定分析技术，不仅可以全面、整体地反映出中药材化学物质的种类与数量，而且还可以作为鉴别和控制药材质量的主要依据，为药材质量评价提供科学指导。当前，有关牡丹花的化学成分物质基础研究和质量控制研究较少。如华梅等(华梅,原晓龙,王毅,杨卫,陈剑,马惠芬,呼延丽,杨宇明,王娟.牡丹花瓣高效液相色谱指纹图谱研究[J].西部林业科学,2018,47(01):52-58.)采用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱技术，对9个不同引种牡丹鲜花瓣样品中化学成分进行分析、分离，标定出6个共有峰，可作为鉴别引种地牡丹花瓣质量的主要依据。闫慧娇(闫慧娇,王志伟,赵恒强,耿岩玲,赵伟,王晓.菏泽牡丹花HPLC特征图谱研究及8种成分的测定[J].中草药,2017,48(09):1866-1871.)等建立了丹凤牡丹花的HPLC指纹图谱，标定共有峰l4个，并归属了8个成分，但其将牡丹鲜花50℃烘干处理，易造成成分的损失和转化。张国强等(张国强,李运,潘建忠,邱国玉,石晓峰,李志俊,马趣环,程显隆.紫斑牡丹花粉HPLC特征图谱及4个成分含量测定[J].药物分析杂志,2019,39(11):2020-2027.)采用HPLC法建立了紫斑牡丹花粉的特征图谱，标定出16个共有峰，指认4个成分并对其含量进行测定，可作为紫斑牡丹花粉质量控制和含量测定方法。但是，以上方法均采用对照品的保留时间指认色谱峰，专属性和准确度较低。
当前，丹凤牡丹已被国家卫计委批准为新食品原料(卫生部2013年第10号)，其他品种是否也具有潜在的可开发为新食品原料的价值。本研究建立的方法也旨在通过比较12个不同品种牡丹花的化学物质基础的差异性、特征性，为后期进一步研究不同品种牡丹花功能活性价值提供研究基础，也为有效开发丹凤牡丹花的替代品种提供科学指导，具有重要意义。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术缺陷，提供一种牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法。本发明采用超高效液相色谱(UPLC)技术建立多个不同品种牡丹花的特征指纹图谱，并分别采用对照品保留时间、UV光谱、质谱三方面指认、表征色谱峰，以期获得更加快速、准确、简便、高效，能全面反映不同品种牡丹花化学成分特征的分析方法，通过图谱鉴定，相似度评价，主成分分析，聚类分析模式识别方法鉴别不同品种牡丹花检材，并通过筛选的特征指标成分建立基于UPLC-MS/MS技术的含量测定方法来评价和鉴别各品种牡丹花样品的内在质量，从而为进一步合理开发利用该植物资源提供了新的化学物质基础，为进一步深入研究不同品种牡丹花的药用、食用、饲用、妆用价值提供科学依据，也为有效开发“新食品原料-丹凤牡丹花”的替代品种奠定理论基础。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，具体包括如下步骤：
1)制备混合对照品溶液：
分别精密称定16个特征组分没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、芍药苷、1,3,6-MTG、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚适量，用溶剂溶解，配成对照品母液；分别精密量取对照品母液适量置于容量瓶中，用上述溶剂定容至刻度，混匀，得到混合对照品溶液；
2)制备供试品溶液：
精密称定不同品种牡丹花粉样品0.4-0.6g于具塞锥形瓶中，加入40-60mL的甲醇-乙醇-水混合液，称定重量，超声提取，再次称定重量，用甲醇-乙醇-水混合液补足损失的重量，摇匀，过有机滤膜，置于进样瓶，待测；
3)分别对混合对照品溶液、供试品溶液进行色谱和质谱检测，记录混合对照品溶液、供试品溶液的DAD色谱图，UV光谱图和MS质谱图，将记录的供试品溶液的色谱图加载到中药色谱指纹图谱相似度评价软件，以开始时间为2、结束时间为33对图谱进行数据剪切，以S1为参照图谱，经过多点校正、全谱峰匹配，生成UPLC对照特征指纹图谱。
具体的，步骤1)中，所述溶剂为甲醇。
进一步的，步骤1)所述混合对照品溶液中，没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、芍药苷、1,3,6-MTG、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚的质量浓度分别为8.52μg/ml、9.12μg/ml、7.72μg/ml、8.32μg/ml、8.44μg/ml、8.04μg/ml、7.96μg/ml、8.20μg/ml、8.80μg/ml、8.08μg/ml、8.36μg/ml、8.16μg/ml、8.28μg/ml、8.72μg/ml、7.68μg/ml、7.80μg/ml。
具体的，步骤2)中，牡丹花粉样品经下述步骤获得：将不同品种牡丹鲜花，分离花蕊和花萼，分别放在A4纸上于冷冻干燥机中冷冻干燥(-55～-80℃，72h，真空度＜10Pa)，取出后，将花瓣单独粉碎成粉末，过筛，即得到牡丹花粉。
进一步的，步骤2)中，精密称定不同品种牡丹花粉样品0.5g于具塞锥形瓶中，加入50mL的甲醇-乙醇-水混合液，称定重量，室温下超声提取25-35min，超声过程中放入冰块，使其尽量保持室温超声提取，完成后再次称定重量，用甲醇-乙醇-水混合液补足损失的重量，摇匀，过0.22μm有机滤膜；所述甲醇、乙醇、水的体积比可以为3-5:2-4:3，进一步优选为4:3:3。
具体的，步骤3)中色谱条件为：色谱柱：Agilent prosell 120SB C18，流动相梯度洗脱：乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)：0～8min，2％A→12％ A；8～11min，12％A→16％ A；11～15min，16％A→20％ A；15～20min，20％A→25％ A；20～24min，25％A→45％ A；24～30min，45％A→65％ A；30～33min，65％A→90％ A；33min～36min，90％A→2％ A；36～40min，2％A；流速：0.4mL/min，进样量：2μl，柱温：30℃，波长：270(±2)nm。
具体的，步骤3)中质谱条件为：离子源：ESI源，扫描模式：多反应监测模式和全扫描模式(MRM和SCAN)，正负模式：ESI+-，干燥气温度：350℃，喷雾气压力：275.8kPa，干燥气流速：11L/min，毛细管电压：4.0kV(ESI+)、3.5kV(ESI-)。
进一步的，步骤3)中所述全谱峰匹配出22个共有色谱峰，依据对照品溶液的DAD色谱图，UV光谱图和MS质谱图将其中16个共有峰色谱指认为：没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、芍药苷、1,3,6-MTG、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚。
由于超高效液相色谱(UPLC)技术具有超高压力、超高线流速的分离能力，能够实现在极短的时间内实现多个化合物的分离。针对于天然产物组成复杂的特点，本发明采用UPLC超强的分离能力联合质谱丰富的化合物的结构信息进行天然产物化学及物质构成鉴定和分析，再结合对照品的保留时间和UV光谱信息，鉴定出待测供试品溶液中的特征峰位置，使得定性结果更加精准、可靠。
上述牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，还包括步骤4)，利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行分析，计算供试品溶液与S1参照图谱的相似度，当相似度不低于0.9时，则认为与S1具有较高的相似度。反之，当相似度低于0.9时，则认为与S1具有较低的相似度。
上述牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，还包括步骤5)，利用PCA分析对不同品种牡丹花检材指纹图谱进行主成分分析，两个主成分累计贡献达到46.36％，包含了几乎一半的信息，其中第1主成分贡献率为28.97％，第2主成分特征值为17.39％，以第1、2主成分进行投影，得到主成分投影图。利用HCA分析对不同品种牡丹花检材的指纹图谱数据进行聚类分析。以供试品溶液中共有峰的相对峰面积、保留时间和相似度为数据基础，应用SPSS 26.0统计分析软件，选用组间联接法，平方欧式距离为测量区间，选定样品数，进行系统聚类分析，根据聚类树状图和类间距离进行样品分类。
本发明还提供了一种牡丹花中16个特征组分含量测定方法，其包括如下步骤：
1)制备混合对照品溶液：同权利要求1；再用初始流动相逐级稀释配制成系列混合标准溶液，流动相的初始比例：乙腈：0.1％甲酸水＝2:98(体积比)；
2)制备供试品溶液：
3)将系列混合标准溶液进行色谱和质谱检测，记录峰面积，以各混合标准溶液的浓度为横坐标，混合标准溶液中各特征组分的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；将供试品溶液进行色谱和质谱检测并记录各特征组分的峰面积，代入标准曲线，计算出各特征组分的含量。
牡丹花中16个特征组分含量测定方法中，涉及的步骤1)制备混合对照品溶液、以及步骤2)制备供试品溶液，参照上述牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱建立方法中的步骤1)制备混合对照品溶液、以及步骤2)制备供试品溶液进行，此处不再赘述。
本发明还提供了一种鉴别不同品种牡丹花质量的方法，对其中所含的黄酮类、多酚类、单萜及其苷类和芳香酸类16种代表性指标化合物进行UPLC-MS/MS含量测定。其将大波斯菊苷和苯甲酰氧化芍药苷作为赵粉牡丹的鉴别质量标志物，将苯甲酸作为海黄牡丹的鉴别质量标志物，将野漆树苷作为肉芙蓉牡丹的鉴别质量标志物，将山奈酚作为丹凤牡丹的鉴别标志物，将氧化芍药苷作为香玉牡丹的鉴别质量标志物，将芍药苷和牡丹皮苷C作为黑夫人牡丹的鉴别质量标志物，将1,2,3,6-MTG和苯甲酰氧化芍药苷作为首案红牡丹的鉴别质量标志物，将芍药内酯苷、1,2,3,6-MTG、大波斯菊苷和野漆树苷作为景玉牡丹的鉴别质量标志物，将没食子酸、芍药苷、1,3,6-MTG、1,2,3,6-MTG和1,2,3,4,6-MTG作为洛阳红牡丹的鉴别质量标志物；将没食子酸、1,2,3,4,6-MTG和紫云英苷作为旭港牡丹的鉴别质量标志物，将没食子酸甲酯、没食子酸乙酯和1,2,3,4,6-MTG作为花王牡丹的鉴别质量标志物。
本发明涉及一种牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，首先制备混合对照品溶液、供试品溶液，采用超高效液相色谱质谱联用技术(UPLC-MS)对混合对照品溶液和供试品溶液分别进行定性分析，并记录混合对照品溶液和供试品溶液的DAD色谱图，UV光谱图和MS质谱图。然后将记录的供试品溶液的DAD色谱图加载到中药色谱指纹图谱相似度评价软件中，以开始时间为2、结束时间为33对图谱进行数据剪切，以S1为参照图谱，经过多点校正、全谱峰匹配，生成UPLC-DAD对照特征指纹图谱，并进行特征峰指认和归属验证。最后以供试品溶液中共有峰的相对峰面积、保留时间和相似度为数据基础，应用SPSS统计分析软件，利用“降维”思想，借助正交变换，将分量相关的原随机变量转化成分量不相关的新随机变量，把多个指标转化为几个互补相关的综合指标，进行PCA分析，以第1、2主成分进行投影，得到主成分投影图，分析描述原始多个变量之间的相关关系；再选用组间联接法，平方欧式距离为测量区间，进行系统HCA分析，根据聚类树状图和类间距离进行样品分类。本发明中所建立的不同品种牡丹花样品的UPLC指纹图谱方法，能全面反映不同品种牡丹花新的化学成分物质基础特征，能显著评价和多角度鉴别各品种牡丹花的内在质量，从而为深入研究不同品种牡丹花的药用、食用、饲用、妆用价值提供科学依据，也为有效开发“新食品原料-丹凤牡丹花”的替代品种奠定理论基础，具有重要意义。
和现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本研究建立了12个不同品种牡丹花的UPLC-MS特征色谱指纹图谱，通过文献查阅，实验室现有标准品库筛查以及质谱、光谱鉴定共初步筛查出26个成分，结合12个不同品种牡丹花样品发现仍然有22个共有峰，并进一步通过质谱，光谱，保留值定性验证归属了16个成分。通过对仪器的精密度进行考察，同时也对样品的稳定性与重现性进行了考察，结果良好。同时，采用相似度评价软件对导入的12个品种牡丹花瓣的样品特征色谱指纹图谱进行了相似度分析，并采用SPSS软件进行聚类分析和主成分分析。结果显示：12个品种牡丹花化学成分物质基础呈现出明显的差异性，与S1样品相似度较高的分别是S2、S3、S4、S9样品，相似度达到0.9以上，与S1样品相似度较低的依次是S11，S12和S10样品，相似度不到0.8，与S9(丹凤)样品相似度较高的是S2(肉芙蓉，0.985)和S3(香玉，0.979)。通过主成分分析可知：样品可以划分二类，将S1-S9归为第一类，第二类为S10、S11、S12。其中，第一类类别内差别显著，结合花色角度分析，S7和S8相似且花色均为黄色，S3和S9差异较小且花色均为白色间有粉红，S1和S2差异最小且花色均为粉红色；第二类类别差异较小，但S11与S10、S12呈现离散趋势，说明洛阳红牡丹相较于黑夫人和首案红品种牡丹还是有明显的区别，且与花色相比结果一致。通过聚类分析可知：当类间距离为5时，样品可以分为4类，S1、S2、S3、S4、S9为一类，S5、S6、S7、S8为一类，S10、S12归为一类，S11单独为一类；当类间距离为12.5时，样品可以分为2类，S10、S11、S12归为一类，其余归为一类，该结果与主成分分析所划分的分类一致。
本研究建立的牡丹花UPLC-MS特征指纹图谱可以有效的区分和鉴别牡丹花样品，通过不同品种间牡丹花化学成分物质基础的差异可以更加全面的反映牡丹花的质量，也为不同种类或批次的牡丹花样品提供一种可靠的鉴别方法，后期需要进一步对样品的特征成分进行含量精确测定以进一步比较其间的差异性，为深入研究和开发不同牡丹花的功能价值提供数据和方法参考，也为有效开发“新食品原料-丹凤牡丹花”的替代品种奠定理论基础。
附图说明
图1为MRM模式下混合对照品溶液的紫外色谱图(a:DAD图)和总离子流图(b:TIC图)；其中，1：没食子酸；2：没食子酸甲酯；3：氧化芍药苷；4：芍药内酯苷；5：没食子酸乙酯；6：芍药苷；7：1,3,6-MTG；8：苯甲酸；9：1,2,3,6-MTG；10：1,2,3,4,6-MTG；11：紫云英苷；12：大波斯菊苷；13：野漆树苷；14：牡丹皮苷C；15：苯甲酰氧化芍药苷；16：山奈酚；
图2为混合对照品溶液的UV光谱图；图中1至16所代表的化合物同上图1所示；
图3为多反应监测模式(MRM)模式下S1样品的紫外色谱图(a:DAD图)和总离子流图(b:TIC图)；图中1至16所代表的化合物同上图1所示；
图4为选择不同色谱柱的色谱峰图；
图5为不同波长下混合对照品溶液的紫外图谱；
图6为270nm波长下黄冠样品的DAD图谱(a:有参比(Ref＝360,100)，b:无参比(Ref＝off))；
图7为不同提取溶剂的色谱峰对比图(a:70％乙醇,b:30％甲醇,c:50％甲醇,d:70％甲醇,e:90％甲醇)；
图8为不同体积比例的提取溶剂的色谱峰对比图(A:甲醇:乙醇:水＝1:6:3,B:甲醇:乙醇:水＝2:5:3,C:甲醇:乙醇:水＝3:4:3,D：甲醇:乙醇:水＝4:3:3,E:甲醇:乙醇:水＝5:2:3,F:甲醇:乙醇:水＝6:1:3)；
图9为牡丹花S1样品的UPLC对照特征指纹图谱；
图10为12种牡丹花样品(S1-S12)的UPLC-MS特征指纹图谱；
图11为12种牡丹花样品(S1-S12)的PCA投影图；
图12为12种牡丹花样品(S1-S12)的HCA树状图；
图13为16个目标测定的特征组分的MRM谱图，图中1至16所代表的化合物同上图1所示。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步地详细介绍，但本发明的保护范围并不局限于此。
1材料与方法
1.1仪器设备
Agilent G6460C UPLC-MS/MS型三重四级杆液质串联系统(美国安捷伦科技有限公司)配DAD检测器；
Dura-CYL型杜瓦罐及氮气瓶(Chart)(河南源正科技发展有限公司)；
ME20型万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司)；
AUW220D型十万分之一电子天平(日本岛津公司)；
FW-80型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；
KQ-500E型超声波提取仪(昆山市超声仪器有限公司)；
CTFD-18S型真空冷冻干燥机(青岛永合创信电子科技有限公司)。
1.2药品与试剂
没食子酸(批号21012903，99.48％)，没食子酸乙酯(批号21060303，99.66％)，没食子酸甲酯(批号17092604，≥98％)，芍药内酯苷(批号21031706，98.75％)，槲皮苷(批号21032404，98.64％)，野漆树苷(批号17061305，≥98％)，芹菜素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(大波斯菊苷，批号19010203，≥98％)，氧化芍药苷(批号21092304，99.42％)，牡丹皮苷C(批号22031809，99.02％)苯甲酰氧化芍药苷(批号220317，98.02％)，芍药苷(批号20030203，98.11％)购置于成都普菲德生物技术有限公司；
1,2,3,4,6-五-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(1,2,3,4,6-MTG，批号DSTDW000102，99.33％)，1,3,6-三-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(1,3,6-MTG，批号DST210308-053，98.41％)，紫云英苷(批号DSTDZ000102，99.02％)，购置于成都德思特生物技术有限公司；
1,2,3,6-四-O-没食子酰-β-D-葡萄糖(1,2,3,6-MTG，批号PCS3258-220301，99.9％)，购置于成都植标化纯生物技术有限公司；
苯甲酸(批号100419-201703，99.9％)，山奈酚(批号110881-201611，95.5％)，购置于中国食品药品检定研究院；
甲醇、乙腈、甲酸为LC/MS级纯；超纯水：娃哈哈矿泉水；其他试剂为分析纯；
12个不同品种牡丹花分别为：赵粉(S1，粉红色)、肉芙蓉(S2，粉红色)、香玉(S3，白色间有粉红)、景玉(S4，粉白色)，旭港(S5，红色)，花王(S6，玫红色)，海黄(S7，黄色)、黄冠(S8，黄色)、丹凤(S9，玉白色间有粉红)、黑夫人(S10，深紫红色)，洛阳红(S11，紫红色)，首案红(S12，深紫红色)。
1.3方法
1.3.1色谱条件
色谱柱：Agilent prosell 120SB C18(2.1×100mm,2.7μm)；流动相梯度洗脱：乙腈(A)-0.1％甲酸水(B)：0～8min，2％A→12％ A；8～11min，12％A→16％ A；11～15min，16％A→20％ A；15～20min，20％A→25％ A；20～24min，25％A→45％ A；24～30min，45％A→65％ A；30～33min，65％A→90％A；33min～36min，90％A→2％ A；36～40min，2％A，流速：0.4mL/min，进样量：2μl，柱温：30℃，波长：270nm(无参比)。
1.3.2质谱条件
离子源：ESI源，扫描模式：多反应监测模式和全扫描模式(MRM和SCAN)，正负模式：ESI+-，干燥气温度：350℃，喷雾气压力：275.8kPa，干燥气流速：11L/min，毛细管电压：4.0kV(ESI+)、3.5kV(ESI-)，用于定性定量分析的离子对，驻留时间、碰撞能量及碎裂电压见下表1。
表1待测物的质谱分析参数
1.3.3样品的制备
取12个品种牡丹鲜花，分离花蕊和花萼，分别放在A4纸上于冷冻干燥机中冷冻干燥(-55～-80℃，72h，真空度＜10Pa)，取出后，将花瓣单独采用粉碎机将其粉碎成粉末，过2号筛，得到牡丹花粉样品。放置于密封袋中，备用。
1.3.4混合对照品溶液的制备
精密称定16个标准品(没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、芍药苷、1,3,6-MTG、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚)2.00mg，置于10ml棕色量瓶中，加入5ml色谱甲醇配成对照品母液，备用。
分别精密量取对照品母液0.5ml，置于25ml容量瓶中，稀释至刻度，制备成质量浓度分别为8.52μg/ml、9.12μg/ml、7.72μg/ml、8.32μg/ml、8.44μg/ml、8.04μg/ml、7.96μg/ml、8.20μg/ml、8.80μg/ml、8.08μg/ml、8.36μg/ml、8.16μg/ml、8.28μg/ml、8.72μg/ml、7.68μg/ml、7.80μg/ml。混合对照品溶液。
1.3.5供试品溶液的制备
精密称定12个品种牡丹花样品0.5g于具塞锥形瓶中，加入50mL的甲醇-乙醇-水混合液(甲醇、乙醇、水的体积比为4:3:3)，称定重量，室温(25℃)下超声提取30min，超声过程中放入冰块，使其尽量保持室温超声提取，完成后再次称定重量，用甲醇-乙醇-水混合液补足损失的重量，摇匀，用0.22μm有机滤膜过滤到进样小瓶，即得供试品溶液。
2 结果与讨论
2.1 方法学考察
2.1.1专属性
在“1.3.1”与“1.3.2”的色谱条件和质谱条件下进行检测，含16个特征组分(标准品)的混合对照品溶液的紫外色谱图(DAD图，见图1中a)，总离子流图(TIC图，见图1中b)和UV光谱图(见图2)。编号为S1的赵粉牡丹花样品的典型总离子流色谱图(TIC图)和紫外色谱图(DAD图)见图3。由图可知：样品中各色谱峰间分离度较好，且目标峰处几乎无干扰，再加上MS检测器进一步定性，专属性更强，表明本方法具有较好的专属性。
2.1.2精密度试验
称取编号为S1的牡丹花瓣粉样品，按照“1.3.5”的条件制备供试品溶液，用移液枪吸取供试品溶液2μl，然后按照“1.3.1”和“1.3.2”的色谱、质谱条件进样，连续进样6次，记录色谱图。
计算响应相对较高的11个组分(没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、没食子酸乙酯、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、苯甲酰氧化芍药苷)的相对保留时间RSD，结果为0.03％-0.25％，其相对峰面积RSD的结果为0.14％-1.55％，表明仪器具有良好的精密度，具体结果见表2。
表2精密度试验(n＝6)
2.1.3稳定性试验
称取编号为S1的牡丹花瓣粉样品，按照“1.3.5”的条件制备供试品溶液，平行制备3份，通过移液枪吸取供试品溶液2μl，分别在0h、1h、2h、4h、8h、12h、24h按“1.3.1”和“1.3.2”的色谱、质谱条件进样测定，记录色谱图。
计算响应相对较高的11个组分(没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、没食子酸乙酯、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、苯甲酰氧化芍药苷)的相对峰面积RSD的结果分别为0.15％-3.03％、1.31％-3.67％、0.12％-3.61％、0.44％-3.45％、0.15％-3.68％、0.40％-4.67％、0.03％-4.10％、0.12％-2.97％、0.42％-3.74％、0.24％-3.02％，0.42％-3.46％。表明供试品溶液在室温、避光条件下放置24h具有良好的的稳定性，详细结果见表3。因此，在室温、避光条件下储存，本试验经甲醇、乙醇和水混合溶剂提取获得的牡丹花提取物可稳定保存，可以更好地指导短期内牡丹花提取物检材的取样、运输、保存及鉴定。
表3稳定性试验(n＝3)
2.1.4重复性试验
取6份编号为S1的赵粉牡丹花瓣粉样品，按照“1.3.5”的条件制备供试品溶液，用移液枪吸取供试品溶液2.0μL，然后按照“1.3.1”和“1.3.2”的色谱、质谱条件进样，记录色谱图。
计算响应相对较高的11个组分(没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、没食子酸乙酯、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、苯甲酰氧化芍药苷)的相对保留时间RSD，结果为0.06％-0.20％，其相对峰面积的RSD，结果为1.04％-4.04％，表明该方法具有良好的重复性，详见表4。
表4重复性试验(n＝6)
2.2质谱条件的优化
没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯在优化过程中，正负模式均可满足要求；氧化芍药苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷，1,2,3,6-MTG在优化过程中，负模式下(ESI-)的离子化效率远远大于正模式(ESI+)；芍药苷、1,2,3,4,6-MTG在优化过程中，正负模式下均不好，但相对ESI+模式稍好，且较易得到[M+Na]+的前级母离子峰，不易得到[M+H]+离子峰，即使出现[M+H]+离子峰，但是丰度较低，不易得到二级碎片离子，满足不了后期定性定量要求，1,3,6-MTG在优化过程中，ESI-模式下相对较好，易得[M-H]+，而ESI+模式下易得[M+Na]+的前级母离子峰，[M+H]+离子丰度较低，也难以得到二级碎片离子；芍药内酯苷，苯甲酸，紫云英苷，大波斯菊苷，野漆树苷和山奈酚在优化的过程中，ESI+模式条件下的离子丰度明显较强。
以上16种目标组分化合物为黄酮类、多酚类、单萜及其苷类和芳香酸类化合物，其结构及理化性质各有差异，同时考虑流动相中含有酸性介质，可以进一步增强ESI+模式下的离子化效率，经过大量实验综合分析，选择正-负双模式条件下进行定性和定量研究，其中，氧化芍药苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷，1,2,3,6-MTG选择ESI-模式下进行扫描，其余组分选择ESI+模式下扫描。经优选得出每个化合物对应的子离子分别为：没食子酸81.1、109.0、152.9、127.0；没食子酸甲酯153.0、107.0、126.0、79.1；氧化芍药苷137.0、92.9、465.0、292.5；芍药内酯苷117.1、145.0、117.1、137.0；没食子酸乙酯127.1、152.9、119.1、70.7；芍药苷341.0、219.0、342.1；1,3,6-MTG174.9、319.0、386.7；苯甲酸79.1、77.1、51.1、45.1；1,2,3,6-MTG617.0、169.0、465.0、313.0；1,2,3,4,6-MTG471.1、793.2；紫云英苷287.0、85.0、69.1、153.0；大波斯菊苷271.0、153.0、119.0、67.1；野漆树苷271.0、152.9、119.0、433.0；牡丹皮苷C 281.0、137.0、120.9、93.0；苯甲酰氧化芍药苷137.0、93.0、120.9、377.3；山奈酚69.1、153.0、121.0、77.1。其中，筛选一个丰度最高的作为定量子离子，一个较高的作为定性子离子。即得出：没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、芍药苷、1,3,6-MTG、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚用于定量分析的离子对分别为：171.0→109.0、185.0→153.0、495.2→137.0、481.2→105.0、199.1→127.1；503.0→341.0；659.1→174.9；123.0→79.1；787.1→617.0；963.1→793.2；449.0→287.0；433.0→271.0；579.2→271.0；599.2→281.0；599.2→137.0；287.0→69.1；用于定性分析的离子对分别为：171.0→81.1、185.0→107.0、495.2→92.9、481.2→133.0、199.1→152.9；503.0→219.0；659.1→319.0；123.0→77.1；787.1→169.0；963.1→471.1；449.0→85.0；433.0→153.0；579.2→152.9；599.2→137.0；599.2→93.0；287.0→153.0。
2.3色谱柱的选择
本实验选择Agilent Eclipse plus C18(4.6×100mm,3.5μm)、Agilent prosell120EC C18(2.1×100mm,2.7μm)、Agilent Eclipse SB C18(2.1×100mm,1.8μm)和Agilentprosell 120SB C18(2.1×100mm,2.7μm)四种色谱柱考察分离效果。
结果发现，使用Prosell 120SB C18色谱柱时色谱峰分离效果最好，柱压较低，峰形尖锐对称，尤其是10-12min和15-17min出峰效果显著，见图4。同时，选用超高效液相色谱柱建立色谱指纹图谱大大缩短了分析时间，提高了分析效率。因此，本实验选用Agilentprosell 120SB C18超高效液相色谱柱作为最佳色谱柱。
2.4流动相的选择
在选择流动相时，选用甲醇-水为流动相时，根据生成的色谱图发现其色谱峰的峰宽值较大，而且保留时间较长，洗脱压力较大，选用超高效液相色谱建立指纹图谱其色谱柱的耐受性较差。选用乙腈-水为流动相时，通过色谱图发现其具有较好的洗脱能力，然后在水相中加入了少量甲酸(0.1％，pH＝3-4)，根据色谱图发现其色谱峰的峰形与之前相比更加尖锐，并且增加了响应值和离子化效率。但是过多的加入甲酸缓冲液(0.2％，pH＝2-3)时，将会抑制负模式扫描下的离子响应值。此外，采用梯度洗脱方式可以充分的洗脱出提取成分，为指纹图谱的建立提供有力保障，同时还可以洗脱出更多的杂质，以防止后续样品的干扰，进一步提高了专属性和灵敏度。
因此，本实验选用乙腈-0.1％甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，其色谱峰的峰形较好，出峰时间合适，干扰因子较少。
2.5柱温和流速的选择
25℃、30℃、35℃、40℃是本实验选择的四个柱温。试验发现：柱温增加，会使出峰时间提前，相邻峰的分离度随着柱温增加而减小，响应值也会随之增大。在灵敏度满足的情况下，通过综合分析最终选用30℃为最佳柱温。
在流速选择时，通过比较发现：伴随着流速的增加，分析时间将会进一步缩短，但是目标成分的分离度会越来越小，特别是极性相近的成分(如大波斯菊苷和野漆树苷等)特别容易重合，达不到理想的分离效果，而且质谱中进入了较高的流速会降低离子化效率。此外，由于流速较大，干燥气流和压力也需要增大，导致重现性变差，同时增加了成本。因此最终选用了0.4mL/min为最佳分析流速。
2.6检测波长的选择
本实验考察了254nm、230nm、270nm、360nm和90-400nm的检测波长，通过全扫描确定最佳检测波长。结果发现(见图5)：在270nm条件下，色谱峰显示的信息较为全面，同时目标成分有较好的分离度和响应灵敏度，因此本实验选用270nm作为检测波长。然而，经过样品测定发现：海黄和黄冠样品的色谱图(见图6)中均出现倒峰(负峰)，去除参比(Ref＝360,100)后倒峰消失，这可能是因为样品溶液的背景值比流动相吸收响应值低造成的，也可能是不同紫外波长下，溶剂等响应程度不一样导致吸收差异较大引起的。因此，最终选择270nm，无参比进样。
2.7提取溶剂的选择
通过查阅文献资料了解到，牡丹花中含有大量的水溶性杂质，因考虑到环境三废的影响，所以选择了甲醇或乙醇作为提取溶剂。在选用提取溶剂时，首先本实验选用了4种不同体积浓度(30％、50％、70％、90％)的甲醇水溶液进行提取，结果发现(见图7)：随着甲醇溶剂体积比例的增加，各色谱峰的响应信号逐渐增强，但是个别峰(如1,2,3,4,6-MTG等成分)在到90％比例下信号又开始下降，因此选用70％甲醇水溶液作为提取溶剂进一步摸索最佳提取比例。
接着又选用毒性更低的70％乙醇水溶液作为提取溶剂进行摸索。试验发现：没食子酸乙酯和1,2,3,4,6-MTG成分信号响应值高于70％甲醇，但是未提取出没食子酸甲酯成分。
为了能够将更多的牡丹花成分提取出来，更加全面的反映牡丹花的化学成分物质基础，本试验最后选用不同体积比的甲醇:乙醇:水(6:1:3，5:2:3，4:3:3，3:4:3，2:5:3，1:6:3)三种溶剂混合液来提取牡丹花样品。结果发现(见图8)：随着乙醇溶剂比例的增加，野漆树苷、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷成分的响应呈现先增强后减弱，大波斯菊苷呈现先减弱后增强，没食子酸甲酯逐渐减弱，没食子酸乙酯逐渐增强。
综合考虑，选择甲醇:乙醇:水＝4:3:3(体积比)时，提取成分响应信号较为合适，由此建立的色谱指纹图谱能够更加全面地反映牡丹花的质量，而且选择比例稍高的甲醇能够相对减少质谱中的背景干扰。因此，最终选用甲醇:乙醇:水＝4:3:3(体积比)作为最佳提取溶剂。
2.8提取方法的选择
冷凝回流提取和超声提取是本实验选用的两种提取方法。试验结果发现：选用冷凝回流法提取效率稍高，但提取时间至少1h以上，效率低，不同的时间对提取的效率也有影响，同时设备装置要求也较高。而超声提取时间短，效率高，快速简捷，对于温度的要求不需要太严格，而且相比回流提取也不会造成某些不稳定成分因受温度的影响而发生转化。因此，考虑到经济性，本实验选用超声提取的方法。
2.9特征成分的鉴定
本研究通过文献查阅、实验室现有标准品库筛查以及质谱鉴定对牡丹花瓣提取物(S1)进行系统化学成分表征指认和归属验证，共计初步鉴定出以下26个特征化学成分，详见表5。
鉴于样品中成分含量高低以及标准品市场获得难易程度，我们又从中选定16个成分作为对照品，通过质谱、保留时间、紫外、光谱等定性手段对鉴定出的特征组分进行了进一步的指认和归属表征。结果表明：12个品种牡丹花中明确含有16种成分，并可以筛选作为质量控制指标进行质量评价和功能活性验证。
表5特征成分的鉴定
2.10 12个品种牡丹花指纹图谱的建立及相似度评价
2.10.1特征指纹图谱建立及分析
称取编号S1-S12的牡丹花样品，按“1.3.3和1.3.5”方法制备成供试品溶液。采用“1.3.1的色谱条件和1.3.2的质谱条件”，分别对混合对照品溶液、供试品溶液进行色谱和质谱检测，记录混合对照品溶液、供试品溶液的DAD色谱图和MS质谱图，将记录的供试品溶液的DAD色谱图加载到中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012年版)中，以开始时间为2、结束时间为33对图谱进行数据剪切，以S1为对照特征指纹图谱，经过多点校正、全谱峰匹配，生成S1样品的UPLC-DAD对照特征指纹图谱(图9)和12种牡丹花样品的UPLC-DAD特征指纹图谱(图10)。结果表明：12种牡丹花样品的特征图谱差异性明显，但仍然有22个共有峰(色谱图)，指认出16个色谱峰。
通过特征图谱的比较，全谱峰匹配出22个共有峰，依据对照品溶液的DAD色谱图和MS质谱图将其中16个共有峰色谱进一步指认为：没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、芍药苷、1,3,6-MTG、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚。16个成分的色谱峰在各品种样品中均能检出，但是7号色谱峰1,3,6-MTG，在S1，S3，S4，S5，S6，S7样品中响应极低，为痕量检出(定量限以下)，14号色谱峰牡丹皮苷C，在S5和S8样品中响应也较低，16号色谱峰山奈酚在S7，S8和S12号样品中响应较低。各品种牡丹花样品16个成分响应差异明显，可作为12个品种牡丹花的质量控制指标，通过含量测定可进一步比较其间的差异性，从而进行质量鉴别和评价。
2.10.2相似度评价
利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件(2012版)进行分析，计算12种牡丹花样品(S1-S12)与对照特征指纹图谱(S1)的相似度，当相似度不低于0.9时，则认为与S1具有较高的相似度。反之，当相似度低于0.9时，则认为与S1具有较低的相似度。各样品相似度的结果见表6。
表6 12种牡丹花指纹图谱相似度
表6的结果表明：与S1样品相似度较高的样品分别是S3(0.978)、S4(0.953)、S9(0.946)、S2(0.905)号样品，达到0.9以上，说明各色谱峰之间规律性较强。其余样品则具有与S1较低的相似度，其中与S1样品相似度最低的依次是S11(0.459)、S12(0.653)和S10(0.744)样品。与S9(丹凤)样品相似度较高的是S2(肉芙蓉，0.985)和S3(香玉，0.979)。由此可以判别出不同品种之间的牡丹花瓣的化学成分物质基础呈现出显著性差异。后期将对样品的特征成分含量进行准确测定以进一步比较其间的差异性。
2.10.3PCA分析
对12个品种牡丹花样品指纹图谱进行PCA分析，以第1、2主成分进行投影，得到主成分投影图，见图11。两个主成分累计贡献可以达到46.36％，接近50％，包含了几乎一半的信息，其中第1主成分贡献率为28.97％，第2主成分特征值为17.39％，说明同一科植物不同种属之间呈现不同程度的关联性和相似性。由于12个品种牡丹花均来自河南洛阳产地，产地自然环境相似，但是品种不一，差异显著，总体可以划分二类，将S1-S9归为第一类，第二类为S10、S11、S12。其中，第一类类别内差别显著，结合花色角度分析，S7和S8相似且花色均为黄色，S3和S9差异较小且花色均为白色间有粉红，S1和S2差异最小且花色均为粉红色；第二类类别差异较小，但S11与S10、S12呈现离散趋势，说明洛阳红牡丹相较于黑夫人和首案红品种牡丹还是有明显的区别，且与花色相比结果一致。
2.10.4HCA分析
以12个品种牡丹花样品的共有峰的相对峰面积、保留时间和相似度为数据基础，应用SPSS 26.0统计分析软件，选用组间联接法，平方欧式距离为测量区间，样品数＝12时，进行系统聚类分析。
根据聚类树状图(见图12)，当类间距离为5时，样品可以分为4类：S1、S2、S3、S4、S9为一类，S5、S6、S7、S8为一类，S10、S12归为一类，S11单独为一类。当类间距离为12.5时，样品可以分为2类，S10、S11、S12归为一类，其余归为一类，该结果与主成分分析所划分的分类一致。
上述结果表明：本研究建立的牡丹花UPLC-MS特征指纹图谱可以有效的区分和鉴别牡丹花样品，可为全面评价牡丹花的质量提供参考依据。
2.11不同牡丹花瓣中16个特征组分的含量测定
2.11.1系统适应性试验
精密称定16个标准品(没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、芍药苷、1,3,6-MTG、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚)2.00mg，分别置于10ml棕色量瓶中，加入5mL色谱甲醇分别配成单一对照品母液，定容，摇匀，备用。然后分别精密吸取适量单一对照品母液，配制成浓度约为40.00或20.00μg/ml的混合标准溶液，再用初始流动相逐级稀释配制成系列混合标准溶液。流动相的初始比例：乙腈：0.1％甲酸水＝2:98；其中，没食子酸分别为：21.19、8.48、4.24、2.12、1.06、0.42、0.21μg/mL；没食子酸甲酯分别为：22.34、8.94、4.47、2.23、1.12、0.45、0.22μg/mL；氧化芍药苷分别为：19.19、7.68、3.84、1.92、0.96、0.38、0.19μg/mL；芍药内酯苷分别为：41.08、16.43、8.22、4.11、2.05、0.82、0.41μg/mL；没食子酸乙酯分别为：21.03、8.41、4.21、2.10、1.05、0.42、0.21μg/mL；芍药苷分别为：39.44、15.78、7.89、3.94、1.97、0.79、0.39μg/mL；1,3,6-MTG分别为：19.58、7.83、3.92、1.96、0.98、0.39、0.20μg/mL；苯甲酸分别为：40.96、16.38、8.19、4.10、2.05、0.82、0.41μg/mL；1,2,3,6-MTG分别为：21.56、8.62、4.31、2.16、1.08、0.43、0.22μg/mL；1,2,3,4,6-MTG分别为：20.06、8.03、4.01、2.01、1.00、0.40、0.20μg/mL；紫云英苷分别为：20.70、8.28、4.14、2.07、1.03、0.41、0.21μg/mL；大波斯菊苷分别为：19.99、8.00、4.00、2.00、1.00、0.40、0.20μg/mL；野漆树苷分别为：20.29、8.11、4.06、2.03、1.01、0.41、0.20μg/mL；牡丹皮苷C分别为：21.59、8.63、4.32、2.16、1.08、0.43、0.22μg/mL；苯甲酰氧化芍药苷分别为：18.82、7.53、3.76、1.88、0.94、0.38、0.19μg/mL；山奈酚分别为：18.62、7.45、3.72、1.86、0.93、0.37、0.19μg/mL。
分别精密吸取上述系列混合标准溶液和编号为S1的赵粉牡丹花供试品溶液各2.0μL，按“1.3.1”与“1.3.2”项下色谱条件和质谱条件进样测定，16个目标测定组分与其相邻色谱峰的分离度较好，理论塔板数(N)分别为8510、223200、303370、622710、100150、567830、251840、469070、985470、1266220、1268470、1288490、1502250、1630930、1416510、3829190，除了1号没食子酸之外，其余组分N值远远大于7000，同时方法的进样量较小，降低了色谱峰宽，进一步增加了柱效，由此说明本实验所采用的UPLC方法和超高效色谱柱柱效很高，分离能力强，分离效果较好。此外，本试验还采用动态MRM模式进行扫描，定性，定量更加精准，系统适应性更强，目标待测物无干扰。DAD和TIC色谱图分别见图1和图3。16个目标测定组分的MRM谱图见图13。2.11.2线性关系及检测限
精密吸取上述“2.11.1”项下配制的系列混合标准溶液。按照“1.3.1”与“1.3.2”项下色谱和质谱条件分别进样2.0μL，测定峰面积。以各混合标准溶液的浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，混合标准溶液中各特征组分的峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归分析并绘制标准曲线，以测定峰面积约为噪声3倍(S/N＝3)时的进样量为检测下限(LOD)，峰面积约为噪声10倍(S/N＝10)时的进样量为定量下限(LOQ)。结果表明，16个目标测定组分在选定的浓度范围内，线性关系良好，检测限低，稳定性好，准确性更高。详见表7。
表7外标法测定线性关系、LOD和LOQ
2.11.3精密度试验
精密吸取混合对照品溶液(含没食子酸2.12μg·mL-1、没食子酸甲酯2.23μg·mL-1、氧化芍药苷1.92μg·mL-1、芍药内酯苷4.11μg·mL-1、没食子酸乙酯2.10μg·mL-1、芍药苷3.94μg·mL-1、1,3,6-MTG 1.96μg·mL-1、苯甲酸4.10μg·mL-1、1,2,3,6-MTG 2.16μg·mL-1、1,2,3,4,6-MTG 2.01μg·mL-1、紫云英苷2.07μg·mL-1、大波斯菊苷2.00μg·mL-1、野漆树苷2.03μg·mL-1、牡丹皮苷C 2.16μg·mL-1、苯甲酰氧化芍药苷1.88μg·mL-1、山奈酚1.86μg·mL-1)2.0μL，依“1.3.1”与“1.3.2”项下色谱和质谱条件连续进样6次，测得16个目标测定组分峰面积的RSD为0.12％-1.10％，结果表明仪器精密度良好，详见表8。
表8精密度试验(n＝6)
注：1：没食子酸；2：没食子酸甲酯；3：氧化芍药苷；4：芍药内酯苷；5：没食子酸乙酯；6：芍药苷；7：1,3,6-MTG；8：苯甲酸；9：1,2,3,6-MTG；10：1,2,3,4,6-MTG；11：紫云英苷；12：大波斯菊苷；13：野漆树苷；14：牡丹皮苷C；15：苯甲酰氧化芍药苷；16：山奈酚
2.11.4稳定性试验
精密称取编号为S1的赵粉牡丹花0.50g，按“1.3.5”项下方法制备供试品溶液，平行制备3份，精密吸取2.0μL，按“1.3.1”与“1.3.2”项下色谱和质谱条件分别在0、1、2、4、8、12、24h进样测定，测得16个目标测定组分的稳定性分别为97.99％-99.89％、98.52％-100.60％、99.03％-99.84％、97.20％-100.03％、98.81％-100.38％、99.57％-99.90％、96.68％-108.79％、98.83％-100.19％、98.91％-100.68％、99.80％-100.18％、99.14％-100.29％、99.43％-100.06％、98.27％-99.96％、97.31％-99.58％、98.61％-100.22％、96.72％-100.43％，RSD均小于7％，表明供试品溶液在24h内的稳定性良好，详见表9。
表9稳定性试验(n＝3)
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2.11.5重复性试验
精密称取编号为S1的赵粉牡丹花样品0.50g，平行制备6份，按“1.3.5”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取2.0μL，按“1.3.1”与“1.3.2”项下色谱和质谱条件进样测定，测得16个目标测定组分的平均含量依次分别为2179.92、669.45、712.60、175.42、355.31、1644.41、14.67、629.28、362.11、7493.55、4138.31、4380.96、7466.67、160.54、847.24、75.65mg·kg-1，RSD为0.39％-3.14％，表明此方法重复性良好，详见表10。
表10重复性试验
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注：1：没食子酸；2：没食子酸甲酯；3：氧化芍药苷；4：芍药内酯苷；5：没食子酸乙酯；6：芍药苷；7：1,3,6-MTG；8：苯甲酸；9：1,2,3,6-MTG；10：1,2,3,4,6-MTG；11：紫云英苷；12：大波斯菊苷；13：野漆树苷；14：牡丹皮苷C；15：苯甲酰氧化芍药苷；16：山奈酚
2.11.6添加回收试验
精密称取编号为S1的赵粉牡丹花0.25g，置锥形瓶中，精密加入含有16个目标测定组分的低、中、高三种浓度的混合对照溶液适量，制备质控样本，每个添加值平行制备3份，按供试品制备项下方法进行处理，分别精密吸取2.0μL，按“1.3.1”与“1.3.2”项下色谱和质谱条件进样测定，由标准曲线算实测浓度并计算实测值，以(实测值-本底值)/添加值×100％计算回收率和精密度，结果见表11。数据显示，该方法的回收率依次分别为100.79％～101.17％、98.99％～102.30％、95.68％～101.30％、99.70％～107.73％、99.69％～103.32％、99.54％～100.95％、105.69％～109.19％、93.06％～98.32％、96.43％～96.77％、97.11％～99.56％、98.99％～99.97％、95.60％～99.21％、99.68％～103.76％、100.84％～111.22％、100.35％～105.34％、103.58％～115.22％，RSD在0.89％～7.67％之间，均小于10％。结果表明，该试验条件下有16个目标测定组分在样品中的添加回收率符合要求，方法精密度较好。
表11添加回收试验(n＝3)
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2.11.7含量测定及结果分析
精密称取12个品种的牡丹花样品0.50g,平行制备3份，按“1.3.5”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取2.0μL。按“1.3.1”与“1.3.2”项下色谱和质谱条件进样测定并记录各特征组分的峰面积，代入标准曲线方程计算出牡丹花样品中16个特征组分的含量，结果见表12。
表12含量测定结果(n＝3)
注：1：没食子酸；2：没食子酸甲酯；3：氧化芍药苷；4：芍药内酯苷；5：没食子酸乙酯；6：芍药苷；7：1,3,6-MTG；8：苯甲酸；9：1,2,3,6-MTG；10：1,2,3,4,6-MTG；11：紫云英苷；12：大波斯菊苷；13：野漆树苷；14：牡丹皮苷C；15：苯甲酰氧化芍药苷；16：山奈酚。TR：痕量定性检出。
通过对12个品种的牡丹花(S1-S12)中16个成分的含量测定发现，各品种样品中均含有16个成分且含量差异性明显，含量依次分别在0.98-3.80mg·g-1、0.30-3.34mg·g-1、0.19-1.75mg·g-1、0.012-0.32mg·g-1、0.20-0.62mg·g-1、0.42-5.61mg·g-1、0.014-0.044mg·g-1、0.32-2.02mg·g-1、0.36-1.23mg·g-1、5.23-14.12mg·g-1、0.75-7.69mg·g-1、1.32-4.77mg·g-1、4.31-9.48mg·g-1、0.0049-0.20mg·g-1、0.041-0.86mg·g-1、0.012-0.74mg·g-1之间，12个品种中芍药内酯苷、1,3,6-MTG、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚含量相对较低，特别是1,3,6-MTG，S11含量最高(0.044mg·g-1)，S1，S3，S4，S5，S6，S7痕量定性检出(定量限以下)，其余含量水平相当。没食子酸在S11和S5样品中含量最高，分别达到3.80mg·g-1和3.75mg·g-1，没食子酸甲酯在S6(3.34mg·g-1)样品中含量最高，氧化芍药苷在S3(1.75mg·g-1)样品中含量最高，芍药内酯苷在S4(0.32mg·g-1)样品中含量最高，没食子酸乙酯在S6(0.62mg·g-1)中含量最高，芍药苷在S10(5.51mg·g-1)和S11(5.61mg·g-1)中的含量较高，苯甲酸在S7(2.02mg·g-1)中的含量最高，1,2,3,6-MTG在S4、S11、S12中的含量较高且相当，分别达到1.22、1.23和1.15mg·g-1，1,2,3,4,6-MTG在S5中的含量最高，高达14.12mg·g-1，其次为S6和S11(12.61mg·g-1，12.50mg·g-1)，紫云英苷在S5中的含量最高，达到7.69mg·g-1，大波斯菊苷在S4(4.77mg·g-1)中的含量较高，其次是S1(4.34mg·g-1)，野漆树苷在S2(9.52mg·g-1)中的含量最高，其次是S4(9.48mg·g-1)，牡丹皮苷C在S10中的含量较高，但是在S5和S8中有检出低于定量限，苯甲酰氧化芍药苷在S1(0.86mg·g-1)和S12(0.71mg·g-1)中含量较高，山奈酚在S9(0.74mg·g-1)中含量最高，S7中含量最低，仅为0.012mg·g-1。此结果是否与花粉采集、储存关联，同时花蕊和花心当中是否也含有此类成分，还有待进一步的研究和比较。
综上比较分析，大波斯菊苷和苯甲酰氧化芍药苷可以作为赵粉牡丹的鉴别质量标志物，苯甲酸可以作为海黄牡丹的鉴别质量标志物，野漆树苷可以作为肉芙蓉牡丹的鉴别质量标志物，山奈酚可以作为丹凤牡丹的鉴别标志物，氧化芍药苷可以作为香玉牡丹的鉴别质量标志物，芍药苷和牡丹皮苷C可以作为黑夫人牡丹的鉴别质量标志物，1,2,3,6-MTG和苯甲酰氧化芍药苷可以作为首案红牡丹的鉴别质量标志物，芍药内酯苷、1,2,3,6-MTG、大波斯菊苷和野漆树苷可以作为景玉牡丹的鉴别质量标志物，没食子酸、芍药苷、1,3,6-MTG、1,2,3,6-MTG和1,2,3,4,6-MTG可以作为洛阳红牡丹的鉴别质量标志物；没食子酸、1,2,3,4,6-MTG和紫云英苷可以作为旭港牡丹的鉴别质量标志物，没食子酸甲酯、没食子酸乙酯和1,2,3,4,6-MTG可以作为花王牡丹的鉴别质量标志物。
3结论
本研究建立了12个品种牡丹花瓣的UPLC-MS特征色谱指纹图谱，其分离度和重复性良好，能够较好地反映不同品种牡丹花中化学成分的特征。首先通过文献查阅，实验室现有标准品库筛查以及质谱定性初步筛查出26个成分，然后通过指纹全谱峰匹配发现12个不同品种牡丹花样品中仍然有22个共有峰，并通过对照品保留时间，质谱和光谱三方面进一步验证归属了16个成分。通过对仪器的精密度进行了考察，同时也对样品的稳定性与重现性进行了考察，结果良好。同时，采用相似度评价软件对导入的12个品种牡丹花瓣的样品特征色谱指纹图谱进行了相似度分析，并采用SPSS软件进行PCA和HCA分析。结果显示，12个品种牡丹花化学成分物质基础呈现出明显的差异性，与S1样品相似度较高的分别是S2，S3，S4，S9样品，相似度达到0.9以上，与S1样品相似度较低的依次是S11，S12和S10样品，相似度不到0.8，与S9(丹凤)样品相似度较高的是S2(肉芙蓉，0.985)和S3(香玉，0.979)。通过PCA分析可知样品可以划分二类，将S1-S9归为第一类，第二类为S10、S11、S12。其中，第一类类别内差别显著，结合花色角度分析，S7和S8相似且花色均为黄色，S3和S9差异较小且花色均为白色间有粉红，S1和S2差异最小且花色均为粉红色；第二类类别差异较小，但S11与S10、S12呈现离散趋势，说明洛阳红牡丹相较于黑夫人和首案红品种牡丹还是有明显的区别，且与花色相比结果一致。通过HCA分析可知，当类间距离为5时，样品可以分为3类，S1，S2，S3，S4，S9为一类，S5，S6，S7，S8为一类，S10，S11，S12归为一类；当类间距离为12.5时，样品可以分为2类，S10、S11、S12归为一类，其余归为一类，该结果与主成分分析所划分的分类一致。
因此，本研究建立的牡丹花UPLC-MS特征指纹图谱可以有效的区分和鉴别牡丹花样品，通过不同品种间牡丹花瓣新的化学成分物质基础特征的差异可以更加全面的反映牡丹花的质量，也为不同种类或批次的牡丹花样品提供一种可靠的鉴别方法。同时，本研究建立了16个目标组分(包含5类组分：黄酮类、多酚类、单萜及其苷类，酚酸类和芳香酸类化合物)的UPLC-MS/MS含量测定方法，采用UPLC技术分离，保留时间、MS离子对和DAD数据同时定性，采用MS离子来定量，定性、定量结果更加精准、高效，通过比较12个牡丹品种中16个组分间含量的差异来进一步筛选出质量标志物，为不同品种牡丹花的质量控制和标准建立提供数据和方法参考，也为深入研究和开发牡丹花的功能价值提供研究基础，具有科学指导意义。

Claims (10)

1.一种牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备混合对照品溶液：
分别精密称定16个特征组分没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、芍药苷、1,3,6-MTG、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚适量，用溶剂溶解，配成对照品母液；分别精密量取对照品母液适量置于容量瓶中，用上述溶剂定容至刻度，混匀，得到混合对照品溶液；
2）制备供试品溶液：
精密称定不同品种牡丹花样品0.4-0.6 g于具塞锥形瓶中，加入40-60 mL的甲醇-乙醇-水混合液，称定重量，超声提取，再次称定重量，用甲醇-乙醇-水混合液补足损失的重量，摇匀，过有机滤膜，置于进样瓶，待测；
3）分别对混合对照品溶液、供试品溶液进行色谱和质谱检测，记录混合对照品溶液、供试品溶液的DAD色谱图，UV光谱图和MS质谱图，将记录的供试品溶液的色谱图加载到中药色谱指纹图谱相似度评价软件，以开始时间为2、结束时间为33对图谱进行数据剪切，以S1为参照图谱，经过多点校正、全谱峰匹配，生成UPLC对照特征指纹图谱。
2.如权利要求1所述牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤1）中，所述溶剂为甲醇；所述混合对照品溶液中，没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、芍药苷、1,3,6-MTG、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚的质量浓度分别为8.52μg/ml、9.12μg/ml、7.72μg/ml、8.32μg/ml、8.44μg/ml、8.04μg/ml、7.96μg/ml、8.20μg/ml、8.80μg/ml、8.08μg/ml、8.36μg/ml 、8.16μg/ml、8.28μg/ml、8.72μg/ml、7.68μg/ml、7.80μg/ml。
3.如权利要求1所述牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤2）中，牡丹花粉样品经下述步骤获得：将不同品种牡丹鲜花，分离花蕊和花萼，分别放在A4纸上于冷冻干燥机中冷冻干燥，取出后，将花瓣单独粉碎成粉末，过筛，即得到牡丹花粉。
4.如权利要求3所述牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤2）中，精密称定不同品种牡丹花粉样品0.5 g于具塞锥形瓶中，加入50 mL 的甲醇-乙醇-水混合液，称定重量，室温下超声提取25-35min，再次称定重量，用甲醇-乙醇-水混合液补足损失的重量，摇匀，过0.22μm有机滤膜；所述甲醇、乙醇、水的体积比为3-5:2-4:3。
5.如权利要求1所述牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤3）中色谱条件为：色谱柱：Agilent SB C18，流动相梯度洗脱：乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)：0~8min，2%A→12% A; 8~11min，12%A→16% A; 11~15min，16%A→20% A; 15~20min，20%A→25% A; 20~24min，25%A→45% A; 24~30min，45%A→65% A；30~33min，65%A→90% A; 33min~36min，90%A→2% A；36~40min，2%A；流速：0.4 mL/min，进样量：2 μL，柱温：30℃，波长：270（±2）nm；
步骤3）中质谱条件为：离子源：ESI源，扫描模式：多反应监测模式和全扫描模式（MRM和SCAN），正负模式：ESI+-，干燥气温度：350℃，喷雾气压力：275.8 kPa，干燥气流速：11 L/min，毛细管电压：4.0kV（ESI+）、3.5 kV（ESI-）。
6.如权利要求1所述牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤3）所述全谱峰匹配出22个共有色谱峰，依据对照品溶液的DAD色谱图，UV光谱图和MS质谱图将其中16个共有峰色谱进一步指认为：没食子酸、没食子酸甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酸乙酯、芍药苷、1,3,6-MTG、苯甲酸、1,2,3,6-MTG、1,2,3,4,6-MTG、紫云英苷、大波斯菊苷、野漆树苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、山奈酚。
7.如权利要求1所述牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，还包括步骤4），利用中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行分析，计算供试品溶液与S1参照图谱的相似度，当相似度不低于0.9时，则认为与S1具有较高的相似度。
8.如权利要求1所述牡丹花UPLC-MS特征色谱指纹图谱的建立方法，其特征在于，还包括步骤5），利用主成分分析（PCA）对不同品种牡丹花检材指纹图谱进行主成分分析，利用聚类分析（HCA）对不同品种牡丹花检材的指纹图谱数据进行聚类分析；以供试品溶液中共有峰的相对峰面积、保留时间和相似度为数据基础，应用SPSS统计分析软件，选用组间联接法，平方欧式距离为测量区间，选定样品数，进行系统聚类分析，根据聚类树状图和类间距离进行样品分类。
9.一种牡丹花中16个特征组分含量测定方法，包含5类组分：黄酮类、多酚类、单萜及其苷类，酚酸类和芳香酸类化合物，其特征在于，包括如下步骤：
1）制备混合对照品溶液：同权利要求1；再用初始流动相逐级稀释配制成系列混合标准溶液；
2）制备供试品溶液：同权利要求1；
3）将系列混合标准溶液进行色谱和质谱检测，记录峰面积，以各混合标准溶液的浓度为横坐标，混合标准溶液中各特征组分的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线；将供试品溶液进行色谱和质谱检测并记录各特征组分的峰面积，代入标准曲线，计算出各特征组分的含量。
10.一种鉴别不同品种牡丹花质量的方法，其特征在于，将大波斯菊苷和苯甲酰氧化芍药苷作为赵粉牡丹的鉴别质量标志物，将苯甲酸作为海黄牡丹的鉴别质量标志物，将野漆树苷作为肉芙蓉牡丹的鉴别质量标志物，将山奈酚作为丹凤牡丹的鉴别标志物，将氧化芍药苷作为香玉牡丹的鉴别质量标志物，将芍药苷和牡丹皮苷C作为黑夫人牡丹的鉴别质量标志物，将1,2,3,6-MTG和苯甲酰氧化芍药苷作为首案红牡丹的鉴别质量标志物，将芍药内酯苷、1,2,3,6-MTG、大波斯菊苷和野漆树苷作为景玉牡丹的鉴别质量标志物，将没食子酸、芍药苷、1,3,6-MTG、1,2,3,6-MTG和1,2,3,4,6-MTG作为洛阳红牡丹的鉴别质量标志物；将没食子酸、1,2,3,4,6-MTG和紫云英苷作为旭港牡丹的鉴别质量标志物，将没食子酸甲酯、没食子酸乙酯和1,2,3,4,6-MTG作为花王牡丹的鉴别质量标志物。
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