CN116555050A - 一种扩繁莱氏绿僵菌Mr006的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物培养领域，确切地说是涉及一种莱氏绿僵菌的扩繁产孢方法及其应用。本发明通过将莱氏绿僵菌Mr006喷施在用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺（0.008ug/g）处理过的斜纹夜蛾2龄期活幼虫上引发感染，将感染莱氏绿僵菌Mr006孢子斜纹夜蛾2龄期幼虫集中至无菌盒中，置于温度为（27±1）℃、相对湿度（70±5）%、光周期14L:10D的人工气候箱，以人工饲料继续饲养至死亡或化蛹。观察虫体侵染情况，待第1次完全产孢后收集孢子，僵虫保湿后，继续扩繁培养再重复收取2次孢子，获得了最大产孢量。本发明通过利用斜纹夜蛾虫体作为莱氏绿僵菌扩繁培养基，达到了缩短产孢时间，提高孢子产量及孢子含量，更新生产工艺，扩展废料用途，降低生产成本的目的。

Description

一种扩繁莱氏绿僵菌Mr006的方法及其应用
技术领域
本发明涉及微生物培养领域，确切地说是涉及一种莱氏绿僵菌的扩繁产孢方法及其应用。
背景技术
现阶段，害虫对作物的危害是造成农业减产的重大因素之一。化学农药的长期大量使用在杀灭害虫的同时也带来了农产品药残超标，害虫抗性水平逐年上升，污染环境等一系列的副作用。鉴于此，生物防治被人们日益重视，利用昆虫病原微生物防治害虫是害虫生物防治的重要手段之一。与其他杀虫微生物相比，杀虫真菌具有易流行，对环境友好，不易产生抗药性等优点，在害虫的生物防治中占有重要地位。
莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)是一种在我国分布广泛的昆虫病原真菌，在自然界常常引发高强度的昆虫流行病，可侵染多种鳞翅目害虫，尤其对草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫、甜菜夜蛾等夜蛾科害虫的侵染力极高，具有较高的开发利用价值。然而，大部分真菌的研究工作都需要对真菌进行室内人工培养，且不同真菌对培养基的养分组成要求差异较大。菌株扩繁是影响应用前景的重要因素。目前莱氏绿僵菌发酵多采用廉价的麦麸、玉米粉、大米粉等农副产品为营养物质，以获得最大孢子产量，但产孢量仍有限。实验室中培养莱氏绿僵菌最常用的萨斯麦芽糖-酵母培养基和马铃薯培养基，但存在产孢率低、孢子萌发率低、产孢周期长和成本高、菌株退化较快等问题。
发明内容
本发明莱氏绿僵菌Mr006由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所生物防治团队从太和玉米种植区调查发现田间感染虫生真菌的草地贪夜蛾僵虫中分离鉴定获得。该莱氏绿僵菌Mr006已经公开在CN202210572361.8中，2022年5月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.40171。为了更好地开展对莱氏绿僵菌的相关研究，本发明对莱氏绿僵菌Mr006进行了进一步深入的研究，得出了扩繁莱氏绿僵菌Mr006的方法。
本发明通过选择草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、二化螟等试虫作为培养基质，用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺处理2龄期活虫，分析对莱氏绿僵菌Mr006产孢时间、产孢量、孢子含量的影响，最终分析得到了高效的莱氏绿僵菌Mr006孢子扩繁方法及其培养基。
本发明的一个方面，本发明提供了一种莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)莱氏绿僵菌Mr006孢子培养，获得孢子液；
(2)莱氏绿僵菌Mr006孢子扩繁，选择夜蛾科昆虫幼虫，用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺处理，喷施孢子液，集中至无菌盒中，以人工饲料继续饲养至死亡或化蛹，观察虫体侵染情况，待第1次完全产孢后收集孢子，僵虫保湿后，继续扩繁培养再重复收取1-2次孢子，获得最大产孢量。
本发明的一个方案，本发明所述莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法步骤(1)中孢子培养的包括：配制莱氏绿僵菌Mr006产孢的培养基；培养基灭菌及接种；发酵培养获得孢子液；
本发明的一个方案，本发明所述莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法步骤(2)中所述夜蛾科昆虫为草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫；优选所述夜蛾科昆虫为斜纹夜蛾。
本发明的一个方案，本发明莱氏绿僵菌Mr006产孢的培养基包括大米20份-60份；稻壳10份-20份；麦芽糖2份-4份；黄粉8份-16份；酵母粉2份-8份；水30份-60份；虫体冻干粉1份-2份；磷酸锌0.1份-0.2份；硫酸亚铁0.05份-0.15份；所述虫体冻干粉为草地贪夜蛾虫体冻干粉。
本发明的一个方案，本发明莱氏绿僵菌Mr006产孢的培养基包括大米40份、稻壳15份、麦芽糖3份、黄粉12份、酵母粉5份、水25份、草地贪夜蛾虫体冻干粉1.5份、磷酸锌0.15份、硫酸亚铁0.1份。
本发明的一个方案，本发明发酵培养获得孢子液包括28℃光照培养箱培养(16L/8D，光暗交替)，培养3d后；调整温度为24℃，光照(23L/1D，光暗交替)，继续培养，培养14d后，停止发酵，获得分生孢子粉，用吐温-80溶液将固体发酵培养基上收集的分生孢子洗下，配置成分生孢子液。
本发明的一个方案，本发明所述莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法步骤(2)中饲养条件为将虫体置于温度为27±1℃、相对湿度70±5％、光周期14L:10D的人工气候箱中饲养。
本发明的一个方案，本发明公开了一种莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法，所述方法包括(1)
将莱氏绿僵菌Mr006喷施在用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺(LC25值0.008ug/g)处理过的斜纹夜蛾2龄期活幼虫上引发感染；(2)将感染莱氏绿僵菌Mr006孢子斜纹夜蛾2龄期幼虫集中至无菌盒中，置于温度为27±1℃、相对湿度70±5％、光周期14L:10D的人工气候箱，以人工饲料继续饲养至死亡或化蛹，观察虫体侵染情况，待第1次完全产孢后收集孢子，僵虫保湿后，继续扩繁培养再重复收取2次孢子，获得了最大产孢量。
本发明的一个方案，本发明公开了一种夜蛾科昆虫的蛹期防治剂，所述防治剂含有莱氏绿僵菌Mr006扩繁孢子剩余的僵虫粉；优选的，所述僵虫粉为以斜纹夜蛾为试虫进行莱氏绿僵菌Mr006扩繁孢子剩余的僵虫粉碎制备得到的。优选的，所述夜蛾科昆虫草地贪夜蛾。
本发明的一个方案，本发明公开了莱氏绿僵菌Mr006扩繁孢子剩余的僵虫制备的僵虫粉在夜蛾科昆虫的蛹期防治剂中的应用。
有益效果
本发明选择草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、二化螟等试虫作为莱氏绿僵菌Mr006扩繁培养基质，分析对产孢时间、产孢量、孢子含量的影响，测试发现利用草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫对于莱氏绿僵菌Mr006扩繁产孢具有显著的效果，尤其是斜纹夜蛾活虫处理平均孢子含量最高，达13.5×109个/g，本发明的方法达到了缩短产孢时间，提高孢子产量及孢子含量，更新生产工艺，扩展废料用途，降低生产成本的目的，是一种值得大力发展和推广的方法。
具体实施方式
本发明材料和处理方法
莱氏绿僵菌Mr006，由本试验室分离自草地贪夜蛾僵虫，已经公开在CN202210572361.8中。
萨斯麦芽糖-酵母培养基(SMAY培养基)：麦芽糖4％，蛋白胨1％，酵母浸出粉1％，琼脂1.5％。
草地贪夜蛾虫体冻干粉：由实验室饲养的6龄幼虫经超低温冷冻干燥，加入液氮碾磨粉碎后获得。
95.3％氯虫苯甲酰胺原药：由富美实(上海)农业科技有限公司生产。
液体种子培养基：麦芽糖4％，蛋白胨1％，酵母浸出粉1％，硫酸锌0.15％，硫酸亚铁0.1％。固体发酵培养基：大米20份-60份；稻壳10份-20份；麦芽糖2份-4份；黄粉8份-16份；酵母粉2份-8份；水30份-60份；虫体冻干粉1份-2份；磷酸锌0.1份-0.2份；硫酸亚铁0.05份-0.15份；所述虫体冻干粉为草地贪夜蛾虫体冻干粉。
昆虫饲料：按草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、二化螟等5种试虫常规饲养条件要求配制。
产孢开始时间：幼虫被侵染过程中，僵化后虫体开始出现绿色粉状物时，立即挑出后在显微镜下检查，确定为分生孢子后，即确定为产孢开始时间。
孢子计数：将培养完成后收集的孢子粉从虫体上刮下或用孢子收集器收集后，直接称重，然后放入到100mL的锥形瓶中，加入含有0.05％吐温-80的无菌水，在磁力搅拌器上搅30min，使孢子充分分散，配成均匀孢子悬浮液，用血球板计数法确定孢子量。
实施例1优势试虫的筛选
根据草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、二化螟等5种试虫饲养条件，分别将幼虫饲养至2龄左右；进行侵染试验。利用SMAY培养基培养，获得莱氏绿僵菌Mr006孢子粉，设置浓度为1×107个/mL孢子悬浮液，选取上述生长一致的草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、二化螟2龄幼虫，共5个处理，每处理20头虫，4次重复。采用浸虫法用上述孢子悬浮液处理，以幼虫停止取食虫体僵化或表皮产孢为侵染标准，10天后检测幼虫侵染率。
经筛选发现，参见表1，莱氏绿僵菌Mr006对草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、玉米螟、棉铃虫、二化螟等5种2龄期试虫均具有侵染活力。当浓度为1×107孢子/毫升时，10天后侵染率分别为71.25％、81.25％、38.75％、68.75％、36.25％；对草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫的侵染率高于玉米螟、二化螟。由此可见，相对于螟蛾科害虫，莱氏绿僵菌Mr006对夜蛾科的侵染率更高，有利于孢子在虫体繁殖。
表1莱氏绿僵菌Mr006对5种幼虫的侵染率
另外，根据昆虫虫体生长特征，相同龄期夜蛾科草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫虫体要比螟蛾科玉米螟、二化螟体型大，单个虫体获得孢子数量潜力更强。因此，后续孢子扩繁试验选取草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫作为优势试虫。
实施例2：莱氏绿僵菌Mr006孢子培养和扩繁
选取大米40、稻壳15、麦芽糖0.3、黄粉15、酵母粉5、草地贪夜蛾虫体冻干粉1.5、磷酸锌0.15、硫酸亚铁0.1、水23.5制成培养原料；将混匀后原料静置浸泡4小时后，装袋121℃高压灭菌50分钟，待温度降到30℃后接入莱氏绿僵菌Mr006液体种子菌液，接种量10％，搅拌混匀后，先28℃光照培养箱培养(16L/8D，光暗交替)，培养3d后；调整温度为24℃，光照(23L/1D，光暗交替)，继续培养，培养14d后，停止发酵，获得分生孢子粉。用吐温-80溶液将固体发酵培养基上收集的分生孢子洗下，配置成107孢子/mL分生孢子液，备用。
死虫处理：选择草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫等3种2龄期试虫各80头，经121℃高压灭菌15分钟，获得死虫，分别喷施以上配置成的莱氏绿僵菌Mr006107孢子/mL分生孢子液，然后在分类集中至无菌盒中，置于温度为(27±1)℃、相对湿度(70±5)％、光周期14L:10D的人工气候箱。分别观察虫体侵染情况，待第1次完全产孢后收集孢子，僵虫保湿后，继续培养再重复收取2次孢子，以获得最大产孢量。
活虫处理：选择草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫等3种2龄期试虫各80头，分别喷施以上配置成的莱氏绿僵菌Mr006107孢子/mL分生孢子液，然后在分类集中至无菌盒中，置于温度为(27±1)℃、相对湿度(70±5)％、光周期14L:10D的人工气候箱，以人工饲料继续饲养至死亡或化蛹。分别观察虫体侵染情况，待第1次完全产孢后收集孢子，僵虫保湿后，继续培养再重复收取2次孢子，以获得最大产孢量。
活虫药剂处理：选择草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫等3种2龄期试虫各80头，分别用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺(LC25值依次为0.006、0.008、0.015ug/g)处理过后，喷施以上配置成的莱氏绿僵菌Mr006107孢子/mL分生孢子液，然后在分类集中至无菌盒中，置于温度为(27±1)℃、相对湿度(70±5)％、光周期14L:10D的人工气候箱，以人工饲料继续饲养至死亡或化蛹。分别观察虫体侵染情况，待第1次完全产孢后收集孢子，僵虫保湿后，继续培养再重复收取2次孢子，以获得最大产孢量。
结果：草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫3种2龄期试虫均可用于莱氏绿僵菌Mr006孢子扩繁，但不同处理间产孢时间、产孢量、孢子含量有差异。利用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺处理后幼虫，代谢下调，活动减缓，更有利于感染。参见表2结果表明，产孢时间缩短至4-7天，其中斜纹夜蛾处理最短为4-5天，其次为草地贪夜蛾5-6天、棉铃虫5-7天。草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫3种试虫均可收取3次孢子，平均产孢量活虫处理要高于死虫；其中第1次收取孢子量最高，两种处理后续孢子收取量均开始下降，死虫处理下降幅度高于活虫处理；斜纹夜蛾活虫药剂处理3次总平均产孢量最高，达1.76g/头，其次为斜纹夜蛾活虫1.69g/头，同一试虫活虫药剂处理高于活虫处理、死虫处理。草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫3种试虫平均孢子含量，活虫药剂处理高于活虫处理、死虫处理，斜纹夜蛾活虫药剂处理平均孢子含量最高，达14.3×109个/g，其次为斜纹夜蛾活虫处理13.5×109个/g、草地贪夜蛾活虫药剂处理12.6×109个/g。3种试虫中，斜纹夜蛾活虫药剂处理扩繁孢子的产孢时间、3次总平均产孢量、平均孢子含量结果均优于草地贪夜蛾、棉铃虫。收取孢子后的僵虫经保湿后仍可产孢，虫体本身亦可作为有机质，经粉碎后可加工成菌肥，用作害虫防治及作物生长。
表2莱氏绿僵菌Mr006虫体扩繁试验结果
而按照CN202210572361.8方法利用培养基质培养孢子需选择多种基质原料称重配比灭菌，原料无法重复利用，只能一次性收取孢子；以斜纹夜蛾等为试虫进行莱氏绿僵菌Mr006孢子扩繁只需饲养幼虫，可多次培养收取孢子，且亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺(LC25值0.008ug/g)处理过2龄期幼虫，产孢时间、3次总平均产孢量、平均孢子含量等指标结果均优于单独活虫及死虫处理。另外利用培养基质获得的孢子多与基质混合，分离难度较大，收集效率低，而虫体扩繁获得孢子，纯度较高，孢子易于虫体分离，只需人工抖落或者孢子收集器直接吸收，因此，以斜纹夜蛾为试虫进行莱氏绿僵菌Mr006孢子扩繁与利用培养基质培养孢子工序相对简单，易于操作。
实施例3：莱氏莱氏绿僵菌Mr006防治草地贪夜蛾
室内选择36盆无菌土，分别接入20头草地贪夜蛾老熟幼虫，即每个处理4盆，共80头蛹。将收取孢子后的斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、棉铃虫幼虫僵虫(活虫处理和死虫处理)粉碎至粉末状获得僵虫粉，按每盆用量10g，撒入僵虫粉，放入温室保湿隔离培养10天，检查每盆草地贪夜蛾蛹侵染率。
结果，参见表3，感染莱氏绿僵菌Mr006的草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫僵虫粉对草地贪夜蛾蛹均具有较好的侵染力。药后10天，斜纹夜蛾试虫3种处理的侵染率分别为46.25％、41.25％、48.75％，草地贪夜蛾试虫两种处理分别为37.25％、32.50％、41.25％；棉铃虫试虫两种处理分别为28.75％、26.25％、31.25％；同一试虫活虫药剂处理僵虫粉侵染力高于单独活虫及死虫处理，其中以斜纹夜蛾药剂处理最高。以亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺(LC25值0.008ug/g)处理过的斜纹夜蛾为试虫进行莱氏绿僵菌Mr006扩繁孢子剩余的僵虫粉，对草地贪夜蛾蛹的侵染效果更好，可用作蛹期草地贪夜蛾防治。
表3莱氏绿僵菌Mr006在草地贪夜蛾防治中的应用效果
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。

Claims (10)

1.一种莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
（1）莱氏绿僵菌Mr006孢子培养，获得孢子液；
（2）莱氏绿僵菌Mr006孢子扩繁，选择夜蛾科昆虫幼虫，用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺处理，喷施孢子液，集中至无菌盒中，以人工饲料继续饲养至死亡或化蛹，观察虫体侵染情况，待第1次完全产孢后收集孢子，僵虫保湿后，继续扩繁培养再重复收取1-2次孢子，获得最大产孢量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法步骤（1）中孢子培养的包括：配制莱氏绿僵菌Mr006产孢的培养基；培养基灭菌及接种；发酵培养获得孢子液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法步骤（2）中所述夜蛾科昆虫为草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、棉铃虫；优选所述夜蛾科昆虫为斜纹夜蛾。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基包括大米20份-60份；稻壳10份-20份；麦芽糖2份-4份；黄粉8份-16份；酵母粉2份-8份；水30份-60份；虫体冻干粉1份-2份；磷酸锌0.1份-0.2份；硫酸亚铁 0.05份-0.15份；所述虫体冻干粉为草地贪夜蛾虫体冻干粉。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述培养基包括大米40份、稻壳15份、麦芽糖3份、黄粉12份、酵母粉5份、水25份、草地贪夜蛾虫体冻干粉1.5份、磷酸锌0.15份、硫酸亚铁0.1份。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养获得孢子液包括28℃光照培养箱培养，光照条件为16L/8D，光暗交替，培养3d后；调整温度为24℃，光照条件为23L/1D，光暗交替，继续培养，培养14d后，停止发酵，获得分生孢子粉，用吐温-80溶液将固体发酵培养基上收集的分生孢子洗下，配置成分生孢子液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法步骤（2）中饲养条件为将虫体置于温度为27±1℃、相对湿度70±5%、光周期14L:10D的人工气候箱中饲养。
8.一种莱氏绿僵菌Mr006扩繁的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）
将莱氏绿僵菌Mr006喷施在用亚致死剂量氯虫苯甲酰胺酰胺（LC25值0.008ug/g）处理过的斜纹夜蛾2龄期活幼虫上引发感染；（2）将感染莱氏绿僵菌Mr006孢子斜纹夜蛾2龄期幼虫集中至无菌盒中，置于温度为27±1℃、相对湿度70±5%、光周期14L:10D的人工气候箱，以人工饲料继续饲养至死亡或化蛹，观察虫体侵染情况，待第1次完全产孢后收集孢子，僵虫保湿后，继续扩繁培养再重复收取2次孢子，获得了最大产孢量。
9.一种夜蛾科昆虫的蛹期防治剂，其特征在于，所述防治剂含有莱氏绿僵菌Mr006扩繁孢子剩余的僵虫粉；优选的，所述僵虫粉为以斜纹夜蛾为试虫进行莱氏绿僵菌Mr006扩繁孢子剩余的僵虫粉碎制备得到的；优选的，所述夜蛾科昆虫为草地贪夜蛾。
10.莱氏绿僵菌Mr006扩繁孢子剩余的僵虫制备的僵虫粉在夜蛾科昆虫的蛹期防治剂中的应用。
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