CN116536378A - 一种重构罗望子多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗冻剂技术领域，具体涉及一种重构罗望子多糖及其制备方法和应用。本发明以天然罗望子多糖为原料，首先通过纤维素酶解聚处理使天然多糖致密的自聚集线圈展开，形成高度溶剂化的解聚长链分子，再通过β‑半乳糖苷酶去除一定含量的强亲水性侧链半乳糖，调节局部亲疏水比例驱动解聚多糖链组装形成大尺寸的纤维状超分子结构，以显著提高参与冰晶互作的表面性质和界面尺寸效应，使冰重结晶抑制活性相较于天然形式多糖具有突跃式的提升，突破了天然多糖抑冰剂活性弱的客观限制，对拓宽多糖的冷冻保护应用，开发出高活性多糖抑冰剂具有重要的理论和技术指导意义。

Description

一种重构罗望子多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于抗冻剂技术领域，具体涉及一种重构罗望子多糖及其制备方法和应用。

背景技术

冰重结晶主要是由能量驱动的奥斯特瓦尔德熟化过程，能量较高的小冰晶逐渐消失而大冰晶持续生长。在食品冻藏过程中，尤其在温度波动的情况下，因冰重结晶过程形成的大冰晶严重影响产品质量、功能和消费者接受度。因此，有效抑制冰重结晶对发展高质量冷冻食品至关重要。

传统小分子抗冻剂如蔗糖和山梨糖醇，虽然具有一定的抗冻效果，但由于甜味或高热量，不符合健康食品的消费理念，也不适合非甜型食品的应用。天然来源的抗冻蛋白已被证明在食品中具有优良的冰晶抑制能力，但实际应用受到来源少、生产成本高和健康风险的挑战。此外，研究发现一些天然多糖具有抑制冰晶生长的能力，因其具有广泛的可及性、再生性、无毒性和健康益处，受到领域内的广泛关注，是开发理想食品冷冻保护剂的潜在候选者。

罗望子多糖是从罗望子(TamarindusindicaL.)种仁中提取纯化的一种半乳糖木葡聚糖，具有良好的水合性和热震稳定性。据日本DspGokyo公司2014年的技术通报显示，罗望子多糖可以稳定冰淇淋中的冰晶尺寸，推荐其用于冷冻甜品稳定剂。针对罗望子多糖目前在国内外食品领域逐渐崛起的市场，申请人对该多糖抑制冰晶生长的能力进行了综合研究，发现罗望子多糖抑制冰晶生长和重结晶的能力尽管优于卡拉胶、瓜尔豆胶、羧甲基纤维素和黄原胶等一些已知的冷冻食品稳定剂，但冰重结晶抑制活性还远远不及天然抗冻蛋白和一些合成高分子如聚乙烯醇等高活性抗冻剂，其单纯作为抑冰剂并不具备开发和应用优势。此外，罗望子多糖具有粘度大、溶解效率低的特点，不利于在低粘度食品体系中应用。

在抑制冰晶生长和重结晶的前沿理论中，抑冰分子参与冰水互作的能力和合适的尺寸效应是两个至关重要的因素。大多数柔性结构的天然多糖在溶液中易通过氢键和疏水作用形成致密的自聚集体，分子链溶剂化程度低，无法形成有效的表面化学性质参与冰水互作，也无法在冰水界面形成可以有效阻碍冰晶快速生长的拥挤和尺寸效应。因此，目前已知报道的天然多糖均呈现抑冰活性不高的特点，也尚未有一种高活性的多糖抑冰剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重构罗望子多糖及其制备方法和应用，与天然罗望子多糖相比，所述重构罗望子多糖的粘度更低，且抑冰活性得到了显著提升。

本发明提供了一种重构罗望子多糖，所述重构罗望子多糖为长度大于300nm的纤维状超分子结构。

本发明还提供了上述技术方案所述的重构罗望子多糖的制备方法，包括如下步骤：

将罗望子多糖水溶液与纤维素酶混合后进行纤维素酶酶解，得到解聚罗望子多糖酶解液；

将所述解聚罗望子多糖酶解液进行灭酶处理后进行固液分离，将得到的上清液在截留摩尔质量为14kg/mol的条件下进行透析，得到截留液；

将所述截留液进行冻干，得到解聚罗望子多糖；

将所述解聚罗望子多糖复溶于水，得到解聚罗望子多糖水溶液；

将所述解聚罗望子多糖水溶液与β-半乳糖苷酶混合后进行β-半乳糖苷酶酶解，得到重构罗望子多糖酶解液，所述重构罗望子多糖酶解液中包括所述重构罗望子多糖。

优选的，所述β-半乳糖苷酶的用量为1500U/L；所述β-半乳糖苷酶酶解的时间为24～48h；所述β-半乳糖苷酶酶解的温度为25～37℃。

优选的，所述β-半乳糖苷酶酶解后还包括对所述重构罗望子多糖酶解液进行后处理；

所述后处理包括：将所述重构罗望子多糖酶解液进行灭酶处理后，将得到的混合物进行醇沉处理，得到沉淀产物；

将所述沉淀产物复溶于水后进行冻干，得到重构罗望子多糖。

优选的，所述纤维素酶的用量为200U/L；所述纤维素酶酶解的时间为2～4h；所述纤维素酶解的温度为室温。

优选的，所述罗望子多糖水溶液的浓度为1～3wt.％，pH值为5.0～5.5。

优选的，所述解聚罗望子多糖水溶液的浓度为1～3wt.％，pH值为4.5～5.0。

本发明还提供了上述技术方案所述的重构罗望子多糖或所述制备方法制备得到的重构罗望子多糖在作为抑冰剂中的应用。

本发明还提供了一种抑冰剂，所述抑冰剂包括上述技术方案所述的重构罗望子多糖或所述制备方法制备得到的重构罗望子多糖。

有益效果：

本发明提供了一种重构罗望子多糖，所述重构罗望子多糖为长度大于300nm的纤维状超分子结构。本发明通过纤维素酶对罗望子多糖进行一定程度解聚，降低了多糖的溶液粘度，使天然多糖致密的自聚集线圈展开，形成高度溶剂化的解聚长链分子；再通过β-半乳糖苷酶去除解聚罗望子多糖上约40％的强亲水侧链半乳糖调节到合适的局部亲疏水比例，驱动多糖链组装形成大尺寸的纤维状超分子结构，以显著提高参与冰晶互作的表面性质和阻碍界面冰晶快速生长的尺寸效应，使抑冰活性相较于天然形式多糖具有突跃式的提升，突破了天然多糖抑冰剂活性弱的客观限制，对拓宽多糖的冷冻保护应用，开发出高活性多糖抑冰剂具有重要的理论和技术指导意义。

进一步的，本发明采用两步酶法调控罗望子多糖分子重构，形成特定的自组装溶液结构，具有简单高效，绿色无害，成本低等优点，所制备得到的高活性多糖抑冰剂在生物和食品冷冻保护领域都具有广泛的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1中天然罗望子多糖和不同纤维素酶处理时间的解聚罗望子多糖的摩尔质量分布图；

图2为测试例1中冰重结晶抑制活性测定方法的仪器装置示意图；

图3为测试例1中天然罗望子多糖和阴性对照(聚乙二醇，PEG)在PBS体系中冰晶重结晶30min后的显微照片；

图4为测试例1中解聚罗望子多糖在PBS体系中冰晶重结晶30min后的显微照片；

图5为测试例1中天然罗望子多糖、解聚罗望子多糖在PBS体系中冰重结晶抑制活性的统计结果；

图6为实施例3中两步酶法诱导天然罗望子多糖分子重构的结构示意图；

图7为测试例2中解聚罗望子多糖(实施例2中制备)、β-半乳糖苷酶处理不同时间后多糖的单糖组成变化图；

图8为测试例2中解聚罗望子多糖、经β-半乳糖苷酶酶解后多糖侧链半乳糖的含量和半乳糖去除率的变化；

图9为测试例3中天然罗望子多糖多糖、解聚罗望子多糖和重构罗望子多糖在水溶液中的冷冻透射电镜图；

图10为测试例3中解聚罗望子多糖和重构罗望子多糖的粒径分布图；

图11为测试例4中重构罗望子多糖在PBS体系中冰晶重结晶30min后的冰晶显微照片；

图12为测试例4中PEG阴性对照、解聚罗望子多糖和重构罗望子多糖在PBS体系中冰重结晶抑制活性的统计结果；

图13为测试例5中解聚罗望子多糖和重构罗望子多糖在0.05MNaCl体系中冰晶重结晶30min后的冰晶显微照片；

图14为测试例5中PEG阴性对照、解聚罗望子多糖和重构罗望子多糖在0.05MNaCl体系中冰重结晶抑制活性的统计结果。

具体实施方式

本发明提供了一种重构罗望子多糖，所述重构罗望子多糖为长度大于300nm的纤维状超分子结构。

本发明还提供了上述技术方案所述的重构罗望子多糖的制备方法，包括如下步骤：

将罗望子多糖水溶液与纤维素酶混合后进行纤维素酶酶解，得到解聚罗望子多糖酶解液；

将所述解聚罗望子多糖酶解液进行灭酶处理后进行固液分离，将得到的上清液在截留摩尔质量为14kg/mol的条件下进行透析，得到截留液；

将所述截留液进行冻干，得到解聚罗望子多糖；

将所述解聚罗望子多糖复溶于水，得到解聚罗望子多糖水溶液；

将所述解聚罗望子多糖水溶液与β-半乳糖苷酶混合后进行β-半乳糖苷酶酶解，得到重构罗望子多糖酶解液，所述重构罗望子多糖酶解液中包括所述重构罗望子多糖。

本发明优选制备纯化罗望子多糖，所述纯化罗望子多糖优选为将罗望子多糖胶经乙醇沉淀得到，具体优选包括：将罗望子多糖胶与乙醇溶液混合沉淀，将得到的沉淀物复溶于水后进行冻干，得到所述纯化罗望子多糖。本发明所述乙醇溶液的体积百分含量优选为75～80％，更优选为75％。本发明所述混合沉淀的时间优选为12～24h，更优选为24h。本发明对所述复溶和冻干的操作没有特殊限定，采用本领域中常规复溶和冻干的步骤即可。本发明对所述罗望子糖胶的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售罗望子糖胶即可。本发明所述纯化罗望子多糖的重均摩尔质量优选大于1000kg/mol，更优选为1000～2500kg/mol。

得到所述纯化罗望子多糖后，本发明优选将所述纯化罗望子多糖与水混合，在搅拌条件下溶解，得到罗望子多糖水溶液。本发明所述溶解的温度优选为70～90℃，更优选为80℃。本发明对所述溶解的时间没有特殊限定，保证所述纯化罗望子多糖溶解完全即可。本发明对所述搅拌的具体操作没有特殊限定，采用本领域中常规搅拌条件即可。本发明所述罗望子多糖水溶液的浓度优选为1～3wt.％，更优选为1wt.％。

得到所述罗望子多糖水溶液后，本发明优选采用醋酸钠缓冲液调节所述罗望子糖水溶液的pH值至5.0～5.5，更优选为5.5。本发明所述醋酸钠缓冲液的浓度优选为1.0M；pH值优选为5.0～5.5，更优选为5.5。

调节所述罗望子糖水溶液的pH值后，本发明将调节pH值后的罗望子多糖水溶液与纤维素酶混合后进行纤维素酶酶解，得到解聚罗望子多糖酶解液。本发明所述纤维素酶的用量优选为200U/L。本发明所述纤维素酶酶解的时间优选为2～4h，更优选为4h；所述纤维素酶解的温度优选为室温。

得到所述解聚罗望子多糖酶解液后，本发明将所述解聚罗望子多糖酶解液进行灭酶处理后进行固液分离，得到上清液。本发明所述灭酶处理优选包括对所述解聚罗望子多糖酶解液进行煮沸，所述煮沸的时间优选为10min。本发明优选采用离心的方式进行所述固液分离，所述固液分离的方式和参数不做特殊限定，采用本领域中常规固液分离的手段即可。

得到所述上清液后，本发明将所述上清液在截留摩尔质量为14kg/mol的条件下进行透析，得到截留液。本发明优选采用透析袋进行所述透析，具体优选将所述透析袋在去离子水中进行所述透析。本发明所述透析的时间优选为24～72h，更优选为72h。本发明所述透析可以去除上清液中的盐和低摩尔质量的寡糖。

得到所述截留液，本发明将所述截留液进行冻干，得到解聚罗望子多糖。本发明对所述冻干的参数没有特殊限定，采用本领域中常规的冻干步骤即可。

本发明所述解聚罗望子多糖的重均摩尔质量优选为90～201kg/mol，更优选为90kg/mol。

得到所述解聚罗望子多糖后，本发明将所述解聚罗望子多糖复溶于水，得到解聚罗望子多糖水溶液。本发明所述解聚罗望子多糖水溶液的浓度优选为1～3wt.％，更优选为1wt.％。

得到所述解聚罗望子多糖水溶液后，本发明优选采用醋酸钠缓冲液调节所述解聚罗望子多糖水溶液的pH值至4.5～5.0，更优选为4.5。本发明所述醋酸钠缓冲液的浓度优选为1.0M；pH值优选为4.5～5.0，更优选为4.5。

调节所述解聚罗望子多糖水溶液的pH值后，本发明将调节pH值后的解聚罗望子多糖水溶液与β-半乳糖苷酶混合后进行β-半乳糖苷酶酶解，得到重构罗望子多糖酶解液。本发明所述β-半乳糖苷酶的用量优选为1500U/L。本发明所述β-半乳糖苷酶酶解的时间优选为24～48h，更优选为48h；所述β-半乳糖苷酶酶解的温度优选为25～37℃，更优选为37℃。

得到所述重构罗望子多糖酶解液后，本发明优选将所述重构罗望子多糖酶解液进行灭酶处理后，将得到的混合物进行醇沉处理，得到沉淀产物。本发明所述灭酶处理优选与上述技术方案中的灭酶处理相同，不再进行赘述。

本发明所述醇沉处理优选包括：将所述混合物与乙醇混合后沉淀，得到沉淀产物。本发明所述混合物与乙醇的体积比优选为1：(3～4)，进一步优选为1:3或1:4，更优选为1:3。

得到所述沉淀产物后，本发明优选将所述沉淀产物复溶于水后进行冻干，得到重构罗望子多糖。本发明对所述复溶和冻干的具体参数均没有特殊限定，采用本领域常规复溶和冻干参数即可。

本发明以罗望子多糖为原料，通过纤维素酶解聚降低多糖的溶液粘度，使直径约20nm的罗望子多糖自聚集球形线圈展开形成高度溶剂化的长链，有效提高多糖分子链的水合效应和表面反应性，进而提高其抑冰活性，在此基础上，再通过β-半乳糖苷酶去除解聚罗望子多糖上约40％的强亲水侧链半乳糖，调节局部亲疏水比例，驱动多糖链组装形成大尺寸的纤维状超分子结构，以显著提高参与冰晶互作的表面性质和界面尺寸效应，使抑冰活性相较于天然形式多糖具有突跃式的提升，较上述解聚罗望子多糖的抑冰活性有了进一步的提升，突破了天然多糖抑冰剂活性弱的客观限制。

基于上述技术优势，本发明还提供了上述技术方案所述的重构罗望子多糖或所述制备方法制备得到的重构罗望子多糖在作为抑冰剂中的应用。

本发明还提供了一种抑冰剂，所述抑冰剂包括上述技术方案所述的重构罗望子多糖或所述制备方法制备得到的重构罗望子多糖。

本发明所述抑冰剂的制备方法优选包括：将所述重构罗望子多糖复溶于溶剂，得到的重构罗望子多糖溶液即为所述抑冰剂。本发明所述溶剂优选包括但不限于水、PBS缓冲液或含盐离子水溶液。本发明对所述抑冰剂的浓度不做特殊要求，以所述重构罗望子多糖为活性成分制备得到的溶液均属于本发明的保护范围。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种解聚罗望子多糖的制备方法，步骤如下：

1、以市售天然罗望子多糖胶为原料，采用体积百分比为75％的乙醇水溶液沉淀24h，收集沉淀，复溶后冻干，得到纯化天然罗望子多糖。采用尺寸排阻色谱法对步骤1制备得到的纯化天然罗望子多糖的摩尔质量进行测定，结果如图1所示。

由图1可以得出：步骤1中得到的纯化天然罗望子多糖的重均摩尔质量约为2412kg/mol。

2、称取10g步骤1中制备得到的纯化天然罗望子多糖，将其分散在1L去离子水中，80℃下搅拌2h溶解，形成1wt％的罗望子多糖水溶液；采用1.0MpH值为5.5的醋酸钠缓冲液调节罗望子多糖水溶液的pH值至5.5后，添加200U/L的纤维素酶(购自Sigma生物试剂公司)，在25℃下酶解2h，得到解聚罗望子多糖酶解液；反应结束后将解聚罗望子多糖酶解液煮沸灭酶10min，冷却后10000rpm离心10min，收集上清液；采用截留摩尔质量为14kg/mol的再生纤维素透析袋将上清液透析72h，去除盐和低摩尔质量的寡糖，将截留液进行冷冻干燥后得到解聚的罗望子多糖。

采用尺寸排阻色谱法方法对步骤2制备得到的解聚罗望子多糖的摩尔质量进行测定，结果如图1中纤维素酶酶解2h对应的曲线所示。

由图1可以得出步骤2中200U/L纤维素酶水解2h所获得解聚罗望子多糖的摩尔质量约为201kg/mol。

测试例1

采用如图2所示的“Splatcooling”试验程序对罗望子多糖的冰重结晶抑制活性进行测定，具体步骤如下：采用1×PBS缓冲液(含0.137MNaCl)溶解样品，该缓冲液所含盐浓度可以确保溶液冻结后处于共晶态，避免活性测定出现假阳性。采用微量注射器吸取10μL样品，从1.5m的高度滴落到φ14mm的载玻片上，该载玻片放置在干冰预冷(-78℃)的铝金属块上。当液滴落到玻片的一瞬间，在玻片上形成一层薄薄的冰晶片。将该玻片迅速转移到装配Linkam冷台的显微镜下，在-8℃下观察冰晶生长过程30min，拍照，并采用ImageJ软件统计视野中的冰晶数量和面积。

样品情况具体如下：

1×PBS缓冲液(含0.137MNaCl)为溶剂分别将步骤1中制备得到的纯化天然罗望子多糖和步骤2制备得到的解聚罗望子多糖进行溶解，分别得到浓度为1～20mg/mL的纯化天然罗望子多糖溶液和浓度为1～30mg/mL的解聚罗望子多糖溶液；以1×PBS缓冲液为空白对照，以聚乙二醇(PEG)为阴性对照，分别对1～20mg/mL的纯化天然罗望子多糖溶液和浓度为1～30mg/mL的解聚罗望子多糖溶液进行“Splatcooling”试验，结果如图3、图4和图5所示；

由图3、图4和图5可以得出：相较于天然罗望子多糖，纤维素酶解2h的解聚罗望子多糖的冰重结晶抑制活性具有显著的提升。

实施例2

采用实施例1中的制备方法制备解聚罗望子多糖，区别在于纤维素酶的酶解时间为4h。

对比例1

采用实施例1中的制备方法制备解聚罗望子多糖，区别在于纤维素酶的酶解时间为12h。

按照实施例1中的尺寸排阻色谱法对实施例2和对比例1制备得到的解聚罗望子多糖的摩尔质量分布进行测定，结果如图1中纤维素酶酶解4h和纤维素酶酶解12h对应的曲线所示。按照实施例1中的“Splatcooling”试验对实施例2和对比例1制备得到的解聚罗望子多糖进行冰重结晶抑制活性测定，结果如图3、图4和图5所示。

由图1可以得出步骤2中200U/L纤维素酶酶解4h和12h所获得解聚罗望子多糖的摩尔质量分别为90kg/mol和20kg/mol。

由图3、图4和图5可以得出：水解4h所获得解聚罗望子多糖的抑冰活性略高于水解2h所获得的解聚罗望子多糖，但水解12h所获得解聚罗望子多糖的抑冰活性在低于20mg/mL的测试浓度时活性与天然多糖相比，并没有得到显著提升。

综合解聚罗望子多糖摩尔质量分布和抑冰活性得到具有最大抗冻活性的酶解条件是：纤维素酶添加量为200U/L，酶解时间为2h～4h，该酶解条件下解聚多糖的重均摩尔质量为90kg/mol～201kg/mol。

实施例3

一种重构罗望子多糖的制备方法，步骤如下，制备过程如图6所示：

称取10g实施例2中制备得到的解聚罗望子多糖，加入1L去离子水，搅拌溶解，得到解聚罗望子多糖水溶液；用1.0MpH值为4.5的醋酸钠缓冲液调节解聚罗望子多糖水溶液的pH值至4.5，添加1500U/L的β-半乳糖苷酶(购自Sigma生物试剂公司)，在37℃条件下搅拌反应24h后，煮沸灭酶10min，冷却后添加3倍体积的乙醇进行沉淀，收集沉淀产物后加1L去离子水复溶，冷冻干燥，获得半乳糖部分去除的解聚罗望子多糖。

实施例4

采用实施例3中的制备方法制备重构罗望子多糖，区别在于β-半乳糖苷酶的酶解时间为48h。

对比例2

采用实施例3中的制备方法制备重构罗望子多糖，区别在于β-半乳糖苷酶的酶解时间为1h。

对比例3

采用实施例3中的制备方法制备重构罗望子多糖，区别在于β-半乳糖苷酶的酶解时间为4h。

对比例4

采用实施例3中的制备方法制备重构罗望子多糖，区别在于β-半乳糖苷酶的酶解时间为12h。

测试例2

采用液相色谱脉冲安培检测(HPLC-PAD)对实施例2中制备得到的解聚罗望子多糖以及实施例3～4和对比例2～4中制备得到的重构罗望子多糖进行测定，结果如图7和图8所示。

由图7和图8可以得出：解聚罗望子多糖(重均摩尔质量为90kg/mol)经β-半乳糖苷酶酶解后，侧链半乳糖去除率随时间逐渐增大，其中酶解4h的半乳糖去除率为15％，酶解24h和48h的半乳糖去除率均约为40％。实施例3～4中制备得到的重构罗望子多糖的半乳糖去除率约为40％，且与实施例3中酶解24h相比，实施例4中酶解48h得到的重构罗望子多糖的半乳糖含量也没有进一步显著下降。

测试例3

通过冷冻电镜对实施例1中制备得到的纯化天然罗望子多糖、实施例2中制备得到的解聚罗望子多糖、实施例3中制备得到的重构罗望子多糖和对比例3中制备的重构罗望子多糖进行观察，具体为将实施例1中制备得到的天然罗望子多糖、实施例2中制备得到的解聚罗望子多糖、实施例3中制备得到的重构罗望子多糖和对比例3中制备的重构罗望子多糖溶于水分别形成10mg/mL的水溶液，玻璃化处理后进行观察，结果如图9所示，其中，在图9中天然多糖表示纯化的天然罗望子多糖(标尺为100nm)，解聚多糖表示实施例2中制备得到的解聚罗望子多糖(标尺为200nm)、40％侧链半乳糖去除表示实施例3中制备得到的重构罗望子多糖(标尺为200nm)、15％侧链半乳糖去除表示对比例3中制备得到的重构罗望子多糖(标尺为200nm)。

由图9可以得出：在10mg/mL浓度的水溶液中，天然罗望子多糖主要形成直径约20nm的球形线圈结构，解聚后冷冻电镜视野中无明显的结构化多糖分子，表明解聚罗望子多糖分子链很好地被溶剂化，均匀地分散在溶液中，15％侧链半乳糖去除的重构多糖形成少量不规则的纤维状结构和聚集，而40％侧链半乳糖去除的重构多糖在溶液中通过分子间缠绕自组装形成均匀的具体特定结构的纤维状超分子结构。

测试例4

通过动态光散射进一步对实施例2中制备得到解聚罗望子多糖、实施例3中制备得到的重构罗望子多糖和对比例3中制备的解聚罗望子多糖进行粒径分布测试，结果如图10所示，解聚多糖表示实施例2中制备得到的解聚罗望子多糖、40％侧链半乳糖去除表示实施例3中制备得到的重构罗望子多糖、15％侧链半乳糖去除表示对比例3中制备得到的重构罗望子多糖。

由图10可以得出：解聚罗望子多糖在溶液中形成均匀的分布，其流体动力学直径为300～400nm，15％侧链半乳糖去除制备得到的重构罗望子多糖仅形成少量的大尺寸的自组装体，而40％侧链半乳糖去除制备得到的重构罗望子多糖形成数量较多且分布均匀的超分子自组装体，其数均流体动力学直径分布为800～1200nm。

测试例4

采用测试例1中的方法对实施例3中制备得到的重构罗望子多糖的冰重结晶抑制活性进行测定，结果如图11所示；并以聚乙二醇(PEG)为阴性对照，对实施例2中制备得到的解聚罗望子多糖、实施例3中制备得到的重构罗望子多糖以及对比例3制备得到的重构罗望子多糖在不同浓度下相对于PBS缓冲溶液形成的冰晶颗粒面积进行测定并与空白对照组比较，结果如图12所示，其中解聚多糖表示实施例2中制备得到的解聚罗望子多糖、侧链去除40％表示实施例3中制备得到的重构罗望子多糖、侧链去除15％表示对比例3中制备得到的重构罗望子多糖。

由图11和图12可以得出，相较于天然罗望子多糖和解聚罗望子多糖，侧链去除40％制备得到重构罗望子多糖的冰重结晶抑制活性进一步得到显著提高，在30mg/mL浓度下抑制冰晶的面积仅为空白对照的6.23％。

测试例5

采用测试例1中的方法对实施例2中制备得到的解聚罗望子多糖、实施例3中制备得到的重构罗望子多糖以及对比例3制备得到的重构罗望子多糖在不同浓度下相对于0.05MNaCl溶液的空白对照组的抑制冰晶的面积进行测定，区别在于，其溶剂为0.05MNaCl溶液，结果如图13～14所示，其中解聚多糖表示实施例2中制备得到的解聚罗望子多糖、40％去除表示实施例3中制备得到的重构罗望子多糖、15％去除表示对比例3中制备得到的重构罗望子多糖。

由图13和图14可以得出：改变冰重结晶测试的溶液体系，在0.05MNaCl溶液体系测试中，重构罗望子多糖的抑冰活性显著提高，20mg/mL浓度下重构罗望子多糖抑制冰晶的面积仅为空白对照的3.5％。

根据测试结果可以得出：通过本发明获得的抑冰剂在不同测试体系中均具有明显提高的抑冰活性，但在不同溶液评价体系中抑制冰晶生长的实际效果有所不同，在低盐浓度的体系中由于溶液冷冻后形成的非冻结相体积更低，浓缩效应更高，因此抑冰效果更佳。

由以上实施例可以得出：与天然罗望子多糖相比，本发明提供的解聚罗望子多糖和重构罗望子多糖的抑冰活性均得到显著提高。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (9)

1.一种重构罗望子多糖，所述重构罗望子多糖为长度大于300nm的纤维状超分子结构。

2.权利要求1所述的重构罗望子多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将罗望子多糖水溶液与纤维素酶混合后进行纤维素酶酶解，得到解聚罗望子多糖酶解液；

将所述解聚罗望子多糖酶解液进行灭酶处理后进行固液分离，将得到的上清液在截留摩尔质量为14kg/mol的条件下进行透析，得到截留液；

将所述截留液进行冻干，得到解聚罗望子多糖；

将所述解聚罗望子多糖复溶于水，得到解聚罗望子多糖水溶液；

将所述解聚罗望子多糖水溶液与β-半乳糖苷酶混合后进行β-半乳糖苷酶酶解，得到重构罗望子多糖酶解液，所述重构罗望子多糖酶解液中包括所述重构罗望子多糖。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶的用量为1500U/L；所述β-半乳糖苷酶酶解的时间为24～48h；所述β-半乳糖苷酶酶解的温度为25～37℃。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述β-半乳糖苷酶酶解后还包括对所述重构罗望子多糖酶解液进行后处理；

所述后处理包括：将所述重构罗望子多糖酶解液进行灭酶处理后，将得到的混合物进行醇沉处理，得到沉淀产物；

将所述沉淀产物复溶于水后进行冻干，得到重构罗望子多糖。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述纤维素酶的用量为200U/L；所述纤维素酶酶解的时间为2～4h；所述纤维素酶解的温度为室温。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述罗望子多糖水溶液的浓度为1～3wt.％，pH值为5.0～5.5。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述解聚罗望子多糖水溶液的浓度为1～3wt.％，pH值为4.5～5.0。

8.权利要求1所述的重构罗望子多糖或权利要求2～7任一项所述制备方法制备得到的重构罗望子多糖在作为抑冰剂中的应用。

9.一种抑冰剂，其特征在于，所述抑冰剂包括权利要求1所述的重构罗望子多糖或权利要求2～7任一项所述制备方法制备得到的重构罗望子多糖。