CN116535530A - 一种无定形纤维素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纤维素利用技术领域，具体涉及一种无定形纤维素的制备方法。处理使用硫酸以高固液比条件，反应结束后使用无水乙醇作为再生试剂，所制备纤维素样品具有较低聚合度和结晶度，其分子处于无定形结构。本发明制备的纤维素产物具有良好的酶解反应性能，在5 FPU/g‑纤维素的较低酶添加量下仅需12 h即可接近完全酶解糖化，其反应速率明显高于以水再生样品，为纤维素的高效酶解糖化利用提供了理论依据和技术参考。
Description
技术领域
本发明属于能源领域，具体涉及采用浓硫酸处理后由无水乙醇再生制备无定形纤维素的方法。
背景技术
随着不可再生的化石资源逐渐枯竭，寻找能够替代石油的新型材料迫在眉睫。纤维素作为植物的主要成分之一，其广泛存在于植物的细胞壁之中，是自然界中分布最广且数量最多的可再生能源，可用于替代石油生产各种产品。但是由于纤维素结构的限制，需要对其进行处理后才能够高效利用，这使得目前纤维素的利用量远不及自然合成量。酸处理方法因其成本低，操作方便，产品性能多样化等特点被广泛应用于纤维素的处理中。在使用酸处理纤维素时，酸使纤维素上的糖苷键断裂，进而促使纤维素大分子链断裂以及聚合度降低。硫酸溶液对于纤维素的处理效果已经被多位研究者所证[1-4]。高浓度的硫酸可以有效渗透纤维素结构，破坏晶体分子链的有序堆叠，使氢键断裂，从而降低纤维素的结晶度，提高其反应性能。
Xiang等人发现室温条件下用不同浓度硫酸溶液处理纤维素时，当硫酸浓度为65％的时候，纤维素会由纤维状结构变成胶状结构，在该条件下纤维素的结晶度大幅度降低，而在硫酸浓度低于65％的时候，并无此现象发生[5]。Ioelovich发现室温条件下，纤维素在质量分数为50％到60％的浓硫酸溶液中的溶解度随着硫酸浓度的升高而缓慢增大，但最大溶解度仅有30％。但当硫酸溶液浓度提升到65％时，纤维素完全溶解，溶解度有了一个巨大的跳跃。在65％硫酸溶液中溶解的纤维素经检测后发现其结晶度降低了68％[3]。
发展纤维素基材料和能源不仅有助于缓解能源与环境压力，而且符合可持续发展的理念。将其产业化的前提是纤维素的高效利用，硫酸处理作为一种有效的处理方法，在以往的研究中往往使用较大的用量达到处理效果，这势必带来高昂的成本，有必要进一步减少硫酸的用量以达到高效处理的目的。
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发明内容
本发明要解决的技术问题的是：本发明目的为降低硫酸处理纤维素时硫酸用量的同时，获得反应性能优良的无定形纤维素。
本发明采用的技术方案是：
一种无定形纤维素的制备方法，其包括如下步骤：使用70-74％硫酸处理纤维素后，将其加入无水乙醇中进行再生，然后使用无水乙醇进行洗涤，最后经过冷冻干燥后可获得结晶度较低的无定形纤维素。
优选地，所述硫酸处理纤维素中纤维素与硫酸按固液比为0.35-0.45g：1mL，所述硫酸的浓度为72％。
更优选地，所述硫酸处理纤维素中纤维素与硫酸按固液比为0.38-0.42g：1mL。
在具体实施方式中，使用硫酸处理纤维素具体是使用悬臂式搅拌机以300rpm的速度搅拌以促进纤维素和硫酸的混合和反应处理5-50min，优选为20-40min。更具体地，将纤维素与硫酸的混合物迅速转移到4℃预冷无水乙醇中以停止反应，同时使用悬臂式搅拌机将无水乙醇以400rpm的速度保持搅拌，以确保样品在乙醇中均匀分散；搅拌10分钟后，将混合物在室温下放置20-28小时后采用离心的方式进行固液分离。
进一步地，离心分离后，用无水乙醇反复洗涤纤维素样品，直至其PH值接近中性。
更进一步地，将无水乙醇反复洗涤过纤维素样品进行冷冻干燥后获得所制备纤维素样品，优选地将其置于密封袋中于常温保存。
本发明还提供利用所述的制备方法获得的无定形纤维素。
本发明也提供所述的无定形纤维素作为葡萄糖生产的底物中的应用，以及作为在作为微生物的营养素中的应用。
本发明相对于已有技术的效果及优势是：①改良条件为高固体条件(以往硫酸处理纤维素的固液比小于0.1g：1mL，本发明采用的条件为可高达0.4g：1mL)；②使用无水乙醇为再生剂获得无定形纤维素(反应性能优于从水中再生)，具体优势在于，样品微观结构十分粗糙，具有更低的聚合度以及结晶度，其分子结构表现为无定形状态，具有更高的可及性，在酶解过程中表现出更加优良的反应性。
附图说明
图1使用乙醇和水作为再生剂获得纤维素样品的聚合度。
图2使用不同再生试剂获得纤维素样品的扫描电镜图。
图3使用不同再生试剂获得纤维素样品的X射线衍射图。
图4使用不同再生试剂获得纤维素样品的结晶度。
图5使用不同再生试剂获得获得纤维素样品的FTIR图谱。
图6使用不同再生试剂获得纤维素样品的酶解结果。其中，左：无水乙醇；右：去离子水；酶解条件：2％固体加载量，5FPU/g纤维素，150rpm，50℃。
图7使用不同再生试剂获得纤维素样品在15FPU/g酶加载量时的酶解结果。左：无水乙醇；右：去离子水
具体实施方式
下面通过具体实施例和比较例，以及相关测试结果对本发明做进一步的阐述，以期更好的理解本发明，但不构成对本发明的限制。
实施例:无水乙醇再生
在室温下使用72％硫酸处理纤维素，称取10g纤维素以及量取25mL 72％硫酸，将硫酸缓慢倒入纤维素中，使用悬臂式搅拌机(IKA RW20 digital，德国)以300rpm的速度搅拌以促进纤维素和硫酸的混合和反应。处理5-30min后，将纤维素与硫酸的混合物迅速转移到125mL无水乙醇(4℃预冷)中以停止反应。使用悬臂式搅拌机将无水乙醇以400rpm的速度保持搅拌，以确保样品在乙醇中均匀分散。搅拌10分钟后，将混合物在室温下放置24小时后采用离心的方式进行固液分离。离心分离后，用无水乙醇反复洗涤纤维素样品，直至其PH值接近中性。将固体于-42℃冷冻干燥24h后获得所制备纤维素样品，将样品置于密封袋中于常温保存。处理后的样品根据其处理方法命名，即(纤维素与硫酸的比例)-(处理时间)-e。例如，样品1：2.5-20min-e是指纤维素与硫酸固液比为1：2.5条件下处理20分钟的样品。
对比例：去离子水再生[6]
在室温下使用72％硫酸处理纤维素，称取10g纤维素以及量取25mL 72％硫酸，使用悬臂式搅拌机(IKARW20 digital，德国)以300rpm的速度搅拌以促进纤维素和硫酸的混合和反应。处理5-30min后，将纤维素与硫酸的混合物迅速转移到去离子水(4℃预冷)中以停止反应。使用悬臂式搅拌机将去离子水以400rpm的速度保持搅拌，以确保样品在水中均匀分散。该步骤中所使用去离子水体积是前一步中使用72％硫酸体积的5倍。搅拌10分钟后，将混合物在室温下放置24小时后进行固液分离。离心分离后，用去离子水反复洗涤纤维素样品，直至其PH值接近中性。将固体于-42℃冷冻干燥48h后获得所制备纤维素样品，将样品置于密封袋中于常温保存。处理后的样品根据其处理方法命名，即(纤维素与硫酸的比例)-(处理时间)。例如，样品1：2.5-20min是指纤维素与硫酸固液比为1：2.5条件下处理20分钟的样品。
测试例:
一、聚合度测试
实施例与对比例样品的聚合度以其葡萄糖单体浓度与还原端浓度的比值表示。样品的葡萄糖单体浓度采用苯酚-硫酸法测定，将纤维素样品制成1.0g/L的悬浮液，取1mL悬浮液与1mL浓硫酸混合均匀后静置5min后，稀释五倍加入1mL的5％苯酚溶液，再次静置30min后在490nm处测定其吸光度，以0.1g/L的葡萄糖溶液作为标准计算样品的葡萄糖单体浓度。还原端摩尔浓度采用改进的BCA法测定[7]，将1mL浓度为0.5g/L的纤维素样品悬浮液加入试管中，加入1毫升BCA溶液(由五水硫酸铜、L-丝氨酸、2,2’-联喹啉-4,4’-二羧酸钠、无水碳酸钠和碳酸氢钠按比例溶于水中制成[7])混合均匀后在75℃下反应30min。冷却至室温后，在560nm处测量吸光度。以浓度为0.018g/L的葡萄糖溶液作为标准溶液计算纤维素样品中的还原端浓度。
聚合度测试结果如图1所示。从图中可以观察到，在硫酸处理5min后，使用无水乙醇再生的样品，其聚合度即从210骤降到26左右。而硫酸处理时间长的样品，纤维素的聚合度不再明显下降。硫酸处理30min后，样品的聚合度也仅仅下降到17。而使用去离子水再生时，Avicel PH101经短时间硫酸处理阶段(5min内)，聚合度从210降低到100左右。随着硫酸处理时间的延长，聚合度降低的速度变得越来越慢，在30min的硫酸酸处理后聚合度稳定在50左右。这说明再生试剂的选择对纤维素样品的聚合度有着重要影响，使用无水乙醇再生时可获得聚合度更低的样品，聚合度的降低对酶解产率有着积极的作用。
二、扫描电镜测试
将实施例与对比例所制备样品使用日立SU3500(Hitachi,日本)对纤维素样品的表面形态特征进行观察。将样品均匀地粘在导电胶带上，喷金2分钟后选取合适的放大倍数和电压进行扫描电镜观察，结果如图2所示。
以无水乙醇作为再生剂时，纤维素粒径大小变化不明显，从图中观察到随着处理时间的延长，纤维素样品的颗粒尺寸没有明显变化，而使用去离子水作为再生试剂时，纤维素样品颗粒尺寸对比原始Avicel PH101明显增大，随着处理时间延长，颗粒尺寸逐渐减小。样品颗粒尺寸的变化趋势反映了纤维素在再生过程中的团聚行为，这种趋势也与聚合度测试结果相一致。乙醇再生的样品对比Avicel PH101，粗糙度增加，随着处理时间的延长，粗糙的表面结构依然存在。水再生样品表面形态随着处理时间的延长由疏松多孔变为光滑紧凑且没有孔隙的片状结构，片状结构的占比也随着处理时间的延长而增加。在水中再生的纤维素样品具有光滑表面的原因可能是由于较高的自由链流动性[8]。
三、XRD测试
将实施例与对比例所制备样品使用XD-3多晶X射线衍射仪(普析，中国)在36kV和20mA条件下，使用Cu靶对样品进行XRD测试。2θ的扫描范围为5°至40°，扫描速度为2°/min，采样步宽为0.02°，结果如图3所示。
原始Avicel PH101样品的衍射出峰角度分别为14.6、16.3、22.4和34.3度，分别代表101,002和040的晶面衍射峰，这些峰是典型的纤维素Ⅰ出峰角度[9,10]。使用无水乙醇再生获得的样品没有明显的结晶特征峰，表现为非晶态结构，XRD结果显示所制备的纤维素样品为无定形纤维素。以水为再生剂的样品在22.4°处的纤维素Ⅰ特征峰消失，在19.8°和21.5°处出现两个新的宽峰以及12.1°处出现了一个新的小峰，这些为纤维素Ⅱ的特征峰[11]。随着硫酸处理时间的增加，这些新的特征峰峰在样品的XRD图谱上越来越明显，表明随着处理时间的增加，发生了由纤维素Ⅰ向纤维素Ⅱ的转变。
四、结晶度的计算
实施例与对比例所制备样品的结晶度(CrI)根据Segal等人和Azubuike等人[12,13]的方法计算，公式如下所示:
CrI(％）＝(I002-Iam)/I002×100
其中I002为主峰(002)的最大衍射强度(纤维素Ⅰ：2θ＝22.4°，纤维素II：2θ＝21.7°)，Iam为非晶态峰的强度(纤维素I：2θ＝18.0°，纤维素II：2θ＝16.0°)。
结晶度计算结果如图4所示，在使用无水乙醇再生时，纤维素的结晶度由初始的78.90％开始下降。样品1:2.5-5min-e的结晶度骤降为21.04％，随着处理时间的延长，样品的结晶度在小范围内逐渐下降，1:2.5-30min-e的结晶度为15.39％。对于以水为再生剂的样品，结晶度在处理后5分钟后下降到约38％。随着硫酸处理时间的延长，结晶度逐渐增大。对于结晶度的增加，其原因是Avicel PH101在硫酸中反应时间越长，纤维素链中渗透的硫酸就越多，这导致了纤维素内部更严重的损伤，这进一步使得硫酸处理后的再生过程中纤维素更大程度的发生再结晶行为。由于分子间和分子内氢键的裂解，纤维素的结晶区域在硫酸处理过程中被破坏[14,15]，当处理结束后加入再生试剂中时，再生剂与硫酸之间形成氢键，从而解放出纤维素链上的氢键位点，纤维素链将再次重新排列为一个聚集结构[8,16]。但纤维素链在聚集时并不能形成与先前完全一致的致密结晶结构，所以经过处理后的纤维素样品会表现出不同的XRD图谱，根据其聚集情况的不同表现出不同的纤维素晶型和结晶度。在使用不同再生试剂时，以无水乙醇再生的1：2.5-e系列表现出更低的结晶度，而当去离子水被用作再生试剂时，纤维素链更倾向于重新排列成一个有序的结构并形成结晶区域，使得样品具有较高的结晶度，这是因为水和硫酸之间强烈的氢键相互作用促进了纤维素链的聚集和重新排列。Tan等人使用离子液体处理纤维素时，同样发现从水中再生得到的纤维素与从乙醇中再生的纤维素存在这种差异[8]。由于去离子水的极性大于无水乙醇，所以水比乙醇更容易与硫酸形成氢键。此外，水的分子大小比乙醇小，与硫酸形成氢键时具有较少的空间阻碍。正是因为这种形成氢键能力的区别导致了分别在水和乙醇中再生获得的纤维素样品的差异。
五、FTIR测试
将4mg使用不同试剂再生的纤维素样品与480mg溴化钾粉末在研磨皿中充分研磨混合，在模具中以20MPa压力保持1分钟制成薄片。利用Spectrum 400光谱仪(PerkinElmer，美国)进行红外光谱采集测试，测试条件为：波数4000-400cm-1，分辨率为4cm-1，扫描次数为64次。
结果如图5所示。纤维素在在3348cm-1附近区域呈现为宽频带，这可以归结为-OH基团的拉伸振动，归因于纤维素链的分子间和分子内氢键[17]。从乙醇中再生的样品此处未出现明显变化，而水再生样品此处吸收峰随着处理时间的增加而增大说明水再生时纤维素发生了向纤维素Ⅱ的转化。在1429cm-1和1111cm-1处分别是CH2键和C-O键的拉伸振动[18]。经两种再生剂制得样品此处峰由强变弱，说明样品结晶区域的减少[19]。893cm-1和1163cm-1处分别表示单糖间的β-糖苷键和C-O-C键的不对称拉伸振动[20-22]，以水为再生剂的样品两个峰移至893cm-1和1156cm-1，表明纤维素Ⅱ结构的出现[19]，而乙醇再生样品这两处没有发生明显的变化。通过分析FTIR图谱可以得出结论，从乙醇中再生得样品随处理时间延长逐渐达到无定形状态，而从水中再生样品发生再结晶现象，晶型结构为纤维素Ⅱ型。
六、酶解实验测试
实施例与对比例所制备样品的酶解在2％(w/w)的固体加载量下进行，在低酶加载量5FPU/g纤维素条件下研究硫酸处理后纤维素样品结晶度、晶型等对样品酶解性能的影响，在工业生产常用的酶解载量15FPU/g纤维素条件下验证硫酸处理的效果，同时在体系中添加0.04g/L的盐酸四环素防止空气中微生物污染体系。酶解实验在50℃、150rpm的恒温摇床中进行，分别于0、3、6、12、24、36、48和72小时取出适量样品，在100℃下灭活10分钟后测定葡萄糖浓度。具体酶解过程参照NREL的标准操作程序[23]。
在5FPU/g纤维素条件下酶解结果如图6所示，1：2.5-5min-e酶解72h的葡聚糖转化率可以达到72.65％，这比使用水再生获得的1：2.5-5min高1.79％。随着硫酸处理时间的延长，纤维素样品的葡聚糖转化率逐渐上升，1：2.5-30min-e的转化率为80.19％，与1：2.5-30min(80.32％)十分接近。这说明使用不同再生试剂对同样处理条件获得纤维素样品的最终葡聚糖转化率影响非常微小。但通过实验结果我们也发现，不同试剂再生获得的样品的转化速率相差较多，所有使用无水乙醇再生获得的样品的转化速率都明显高于同样处理时间使用水再生的样品，在酶解12h后以乙醇为再生剂的样品转化速率都趋于平缓。以处理时间为5分钟为例，1：2.5-5min-e酶解24h后，葡萄糖产率达到67.40％，而1：2.5-5min酶解48h后产率仅达到61.52％。同样，处理时间为30分钟时，当酶解3h时1：2.5-30min-e的转化率为49.84％，相较于以水再生的样品高21.81％，酶解12h后，1：2.5-30min-e的转化率接近70％，而使用水再生的1：2.5-30min需要24h才可达到相似的效果。
图7为提高酶加载量至15FPU/g纤维素时的酶解结果。结果显示，随着酶加载量的提升，葡聚糖的转化速率进一步提升，1：2.5-30min-e在酶解3h时转化率即可达到70.92％。相同酶解时间下，1：2.5-30min的转化率只有42.77％。使用乙醇再生的所有处理时间样品的转化速率都有着明显的提升，在酶解6h后样品的转化速率开始趋于平缓，与以水再生的样品相类似的是，在72h的最终葡聚糖转化率较在低酶加载水平时没有明显提升，这说明在较低的酶加载水平下，足够使制备的纤维素样品表现出较好的酶解反应性。15FPU/g纤维素的酶解结果再次印证硫酸处理纤维素时，使用无水乙醇再生获得的样品比以水再生获得的样品具有更加优良的酶解反应性能。
Claims (10)
1.一种无定形纤维素的制备方法，其包括如下步骤：
使用70-74%硫酸处理纤维素后，将其加入无水乙醇中进行再生，然后使用无水乙醇进行洗涤，最后经过冷冻干燥后可获得结晶度较低的无定形纤维素。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸处理纤维素中纤维素与硫酸按固液比为0.35-0.45g：1 mL，所述硫酸的浓度为72%。
3.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述硫酸处理纤维素中纤维素与硫酸按固液比为0.38-0.42g：1 mL。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，使用硫酸处理纤维素具体是使用悬臂式搅拌机以300 rpm的速度搅拌以促进纤维素和硫酸的混合和反应处理5-50 min，优选为20-40 min。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将纤维素与硫酸的混合物迅速转移到4°C预冷无水乙醇中以停止反应，同时使用悬臂式搅拌机将无水乙醇以400 rpm的速度保持搅拌，以确保样品在乙醇中均匀分散；搅拌10分钟后，将混合物在室温下放置20-28小时后采用离心的方式进行固液分离。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，离心分离后，用无水乙醇反复洗涤纤维素样品，直至其PH值接近中性。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，将无水乙醇反复洗涤过纤维素样品进行冷冻干燥后获得所制备纤维素样品，优选地将其置于密封袋中于常温保存。
8.利用如权利要求1至7任一项所述的制备方法获得的无定形纤维素。
9.如权利要求8所述的无定形纤维素作为葡萄糖生产的底物中的应用。
10.如权利要求8所述的无定形纤维素作为在作为微生物的营养素中的应用。
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