CN116535470A - 具有抗结核分枝杆菌活性的多肽、制备方法及其应用 - Google Patents

具有抗结核分枝杆菌活性的多肽、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供具有抗结核分枝杆菌活性的多肽、制备方法及其应用，属于生物技术领域。本发明所述多肽的制备方法，包括如下步骤：（1）制备直链多肽，所述直链多肽的序列如SEQ ID NO:1；（2）所述直链多肽中两个半胱氨酸残基的巯基与N,N’‑双(2‑羟乙基)对苯二甲酰胺进行脱水缩合反应，得到所述多肽。本发明多肽对细胞毒性小且高效抗结核分支杆菌。

Description

具有抗结核分枝杆菌活性的多肽、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及具有抗结核分枝杆菌活性的多肽、制备方法及其应用。
背景技术
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是一种广泛存在于自然界的小分子多肽，具有独特的抗菌机制，包括裂解病原菌生物膜、与胞内靶点结合诱导死亡等。因抗菌谱广、不易产生耐药性的特点，抗菌肽被认为是潜在的抗生素替代品，有望运用于畜牧生产、医疗卫生等领域。BMAP-27是一种众所周知的肽，来源于牛，具有由阳离子NH2形成的两亲性α螺旋末端。它已被证明对细菌、真菌、病毒和寄生虫均具有强大的杀伤活性。但BMAP-27具有一定的细胞毒性，因此无法作为药物应用。BMAP-18由牛源性天然抗菌肽BMAP-27改造而来，保留具有α螺旋结构的N端序列的同时去除C端疏水尾巴以降低细胞毒性，可用于治疗皮肤粘膜的细菌感染
由于乙胺丁醇和异烟肼、利福平等治疗结核病的常用药治疗周期长，且对产生耐药性的病原菌无治疗效果，因此结核病至今仍对人类安全及畜牧业发展产生着巨大的威胁与损害。
结核病病原包括结核分枝杆菌等。现有技术中缺乏副作用小且效果好的抗结核分枝杆菌的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种对细胞毒性小且高效抗结核分支杆菌的多肽。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
具有抗结核分枝杆菌活性的多肽，结构式如下：
本发明还提供所述多肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备直链多肽，所述直链多肽的序列如SEQ ID NO:1；
(2)所述直链多肽中两个半胱氨酸残基的巯基与N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺进行脱水缩合反应，得到所述多肽。
在本发明中，直链多肽与N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺的摩尔比为1：7-15。
在本发明中，步骤(2)中所述直链多肽和N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺分别溶于相应溶剂中，然后再混合，进行脱水缩合反应。
在本发明中，直链多肽的溶剂为三氟乙酸和盐酸胍的混合溶液、尿素水溶液、乙腈、PBS缓冲液中的一种；N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺的溶剂为水、乙腈、甲醇和DMF中的一种。
在本发明中，所述尿素水溶液的浓度为4-8mol/L。
在本发明中，所述直链多肽在溶剂中的浓度1mmol/L-8mmol/L，N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺在溶剂中的浓度为15mmol/L-80mmol/L。
在本发明中，步骤(2)反应中加入酸反应调节剂；所述酸反应调节剂为三氟乙酸；直链多肽溶液与酸反应调节剂之间的体积比为1:1～1:3。
在本发明中，步骤(2)中反应温度为0-40℃，反应时间为0-10min。
本发明还提供所述多肽在制备抗结核分枝杆菌的药物中的应用。
与多肽BMAP-18相比，多肽SAH4的有益效果如下：SAH4对小鼠巨噬细胞的细胞毒性较BMAP-18有明显下降，SAH4的细胞毒性IC50值是400μM，BMAP-18是150μM，因此安全性显著提高，副作用减少；在最小抑菌试验中，SAH4在25μM的浓度下具有很强的抗BCG细菌感染作用，而相同条件下，BMAP-18的最小抑菌浓度为300μM，抑菌能力仅为SAH4的十二分之一；在BMAP-18中加入浓度为5μg/mL的胰蛋白酶，30min后多肽全部被水解，而SAH4在同样环境中，30min后仍有66.68％未被水解，1h后还可剩下43.82％的部分。多肽SAH4，是一种抗菌肽，在后抗生素时代以其独特的作用方式可以在规避耐药性副作用的同时达到治疗疾病的作用，因此具有非常广泛的应用前景，极具研究价值。
附图说明
图1制备多肽SAH4的反应原理。
图2是粗品直链多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH的色谱图。
图3是多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH的质谱图。
图4是N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽的制备色谱图。
图5是N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽的质谱图。
图6显示了各浓度SAH4及BMAP-18作用于RAW264.7细胞的细胞存活率，横坐标为浓度，单位是μM，纵坐标是细胞存活率，单位是％。
图7是SAH4及BMAP-18在RAW264.7细胞上IC50值的拟合结果。
图8是RP-HPLC检测BMAP-18在胰蛋白酶(5μg/mL)环境中不同时间的多肽剩余情况的色谱图，图A的反应时间为0min，图B的反应时间为15min，图C的反应时间为30min。
图9是RP-HPLC检测SAH4在胰蛋白酶(5μg/mL)作用下不同时间的多肽剩余情况的色谱图，图A的反应时间为0min，图B的反应时间为15min，图C的反应时间为30min，图D的反应时间为60min。
具体实施方式
本申请中的BCG细菌是减毒牛型结核分枝杆菌，ATCC编号是bio-77983，购自中国兽医药品监察所。
下面结合附图详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1多肽SAH4的筛选及制备
1.多肽SAH4的筛选
BMAP-18序列(由N端到C端)为：G-R-F-K-R-F-R-K-K-F-K-K-L-F-K-K-L-S-OH(Gly-Arg-Phe-Lys-Arg-Phe-Arg-Lys-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Ser-OH)。通过将随机两个位点氨基酸进行点突变为半胱氨酸后环化等方式对BMAP-18进行改造，最终发现多肽SAH4在减小了细胞毒性的同时，具有高效抗结核分枝杆菌的效果。如图1，具体改造方法如下：将BMAP-18第7、11位的氨基酸突变为半胱氨酸，得到G-R-F-K-R-F-C-K-K-F-C-K-L-F-K-K-L-S-OH(Gly-Arg-Phe-Lys-Arg-Phe-Cys-Lys-Lys-Phe-Cys-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Leu-Ser-OH)，然后再与N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺进行脱水缩合反应，形成环肽，结构如下：
2.多肽SAH4的制备
(1)直链多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH的制备
采用Fmoc固相合成多肽：GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH。
偶联第一个氨基酸：称取0.2mmolWang树脂加入带有沙星的固相反应柱中，用DMF洗涤2次后，用DMF溶胀树脂30min。称取383.4mg(1mmol)的Fmoc-Ser(tBu)-OH和142.11mg(1mmol)的Oxyma(2-肟氰乙酸乙酯)，用DMF溶解，然后加入0.25g(2mmol)的DIC(N,N'-二异丙基碳二亚胺)，激活3min后加入到用DMF溶胀后的树脂中，室温下进行偶联反应1h。以茚三酮检测反应终点，如树脂无色透明则终止反应，如树脂显色则延长反应1h。反应结束，抽除反应液，DMF洗涤树脂三次后脱Fmoc保护基：加入淹没树脂的浓度为20％的哌啶水溶液，玻璃棒搅拌，反应3分钟后抽掉哌啶溶液，DMF洗涤树脂3次，再次加入淹没树脂的浓度为20％的哌啶水溶液，反应4分钟后抽掉反应液，DMF洗涤树脂3-5次。
按照偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH的方法，偶联第二个保护性氨基酸
采用上述方法，由C端到N端依次偶联剩余氨基酸。最终得到多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH树脂。
将多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH树脂用DMF洗涤3次，用DCM(二氯甲烷)洗涤2次，真空抽干后，将多肽从树脂上进行切割反应，具体方法如下：加入裂解液，室温反应1h，过滤树脂，收集滤液，再用少量裂解液重复切割一次，合并两次的滤液。将滤液缓慢加入冰乙醚中，沉淀、离心，弃去上清液，得到粗品直链多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH。其中，裂解液是体积比为95:2.5:2.5的TFA(三氟乙酸)、TIS(三异丙基硅烷)和H2O的混合溶液。
将粗品直链多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH冻干，冻干方法如下：液氮冻成固体，然后悬挂于冻干机中冻干，得到固体粉末。采用LC-MS鉴定直链多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH，色谱图如图2，质谱图如图3，质谱数据如下：
M＝2263.89,found:1132.83[M+2H+]2+,755.67[M+3H+]3+,567.17[M+4H+]4+,454.00[M+5H+]5+。直链多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH结构式如下：
直链多肽的序列(SEQ ID NO:1)：GRFKRFCKKFCKLFKKLS。
(2)采用N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺修饰装订直链多肽中两个半胱氨酸残基
将粗品直链多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH与N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺在酸性条件下直接反应，可得装订环肽，减少操作过程，提高生产效率，同时减少有机溶剂的使用。具体步骤如下：
步骤一：取粗品直链多肽GRFKRFC7KKFC11KLFKKLS-OH溶解在体积比为1:1的TFA(三氟乙酸)和盐酸胍的混合溶液中，得到2mmol/L的多肽溶液；将N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺溶解于水中，得到20mmol/L的N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺水溶液。
步骤二：在室温(25℃)条件下，在2mmol/L的多肽溶液中加入无水三氟乙酸，随后加入20mmol/L的N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺水溶液，在室温(25℃)条件下反应1分钟，得到N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽粗品。其中，多肽溶液、无水三氟乙酸和N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺水溶液的体积比为1:1:1。
步骤三：N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽粗品经半制备高效液相色谱纯化，条件如下：流动相：A:含有0.1％(体积百分浓度)TFA的H2O，B:含有0.1％(体积百分浓度)TFA的乙腈，洗脱程序：0-30min，流动相B0到60％，每分钟2％B的增量；色谱柱：WatersC18，流速：15mL/min，检测波长：214nm。由图4可见，制备的N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽纯度高。
将纯化后的N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽冻干，冻干方法如下：液氮冻成固体，然后悬挂于冻干机中冻干，冻干得到固体粉末。采用质谱鉴定纯化后的N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽，见图5，质谱数据如下：
M＝2479.36,found:1240.42[M+2H+]2+,826.75[M+3H+]3+,620.08[M+4H+]4+,496.33[M+5H+]5+。
N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽的结构式如下：
将N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺修饰的多肽记为多肽SAH4。
实施例2CCK-8法检测SAH4及BMAP-18作用于RAW264.7细胞的细胞存活率
用CCK-8法，即WST(化学名称：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二硫苯基)-2H-四唑单钠盐)比色试验来确定SAH4和BMAP-18对RAW264.7细胞的毒性。具体方法如下：在96孔板中，每孔铺1×105个RAW264.7细胞，每个实验孔中分别加入100μL浓度为3.125μM至200μM的连续稀释的多肽SAH4水溶液，在37℃、5％的CO2条件下孵育24小时。设置阳性对照孔，以DMEM完全培养基替代多肽SAH4水溶液，其他同实验孔；另设空白孔，没有铺细胞，仅加入DMEM完全培养基。孵育后，每孔加入10μL的CCK-8反应液(北京索莱宝)，并在37℃下再孵育2小时。最后，用酶标仪(Synersymx,Biotek)检测450nm处的吸光度，以检测细胞活力。根据公式细胞存活率＝(实验孔吸光度-空白孔吸光度)/(阳性对照孔吸光度-空白孔吸光度)*100％，计算出相对于阳性对照孔的细胞存活率。
另外，采用相同方法检测浓度为3.125μM至200μM的连续稀释的BMAP-18水溶液处理后，细胞的存活率。
由图6可见：在各个浓度梯度下，SAH4的细胞毒性较BMAP-18均有明显下降，且SAH4浓度在50μM内时，对RAW264.7细胞不具有明显细胞毒性(细胞存活率＞90％)，BMAP-18浓度在25μM内，对RAW264.7细胞不具有明显细胞毒性(细胞存活率＞90％)。
实施例3SAH4及BMAP-18在RAW264.7细胞上IC50值的拟合结果
在96孔板中，每孔铺1×105个RAW264.7细胞，每个实验孔中分别加入浓度为3.125μM至200μM的连续稀释的多肽SAH4水溶液100μL，在37℃、5％的CO2条件下孵育24小时。设置阳性对照孔，以DMEM完全培养基替代多肽SAH4水溶液，其他同实验孔。孵育后，每孔加入10μL的CCK-8反应液(北京索莱宝)，并在37℃下再孵育2小时。最后，用酶标仪(Synersymx，Biotek)检测450nm处的吸光度。阳性对照孔的OD值为B0，添加了抗菌肽的实验孔的OD值为B，B/B0称为抑制率。在抑制率为50％时所对应的抗菌肽的浓度称为IC50。IC50的数值越小，说明抗菌肽的细胞毒性越强。以抗菌肽浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，制作折线图，通过拟合，得到IC50。
采用相同方法，得到BMAP-18在RAW264.7细胞上的IC50。
由图7可见，SAH4及BMAP-18对RAW264.7细胞的IC50值分别为400μM与150μM，结果显示SAH4的细胞毒性显著弱于BMAP-18。
实施例4MIC试验测定SAH4抑制BCG细菌生长的能力
考察各浓度SAH4对BCG细菌的抑菌效果。以7H9培养基为溶剂将SAH4在6.25-3200μM范围内进行梯度稀释，得到各浓度的SAH4溶液。以7H9培养基为溶剂将BMAP-18在6.25-3200μM范围内进行梯度稀释，得到各浓度的BMAP-18溶液。以7H9培养基为溶剂将利福平、异烟肼和乙胺丁醇分别在25-12800μM范围内进行梯度稀释，得到各浓度的利福平溶液、异烟肼溶液和乙胺丁醇溶液。将各药物的溶液通过0.22μm的过滤器过滤以去除细菌。
设置SAH4试验组，在每个离心管中，分别加入各浓度的SAH4溶液0.1mL，然后加入1.5×107cfu/mL的BCG细菌0.1mL；设置阳性对照，以7H9培养基替代SAH4溶液，其他同SAH4试验组；设置阴性对照，以相同体积的超纯水替代BCG细菌，其他同SAH4试验组。另外设置BMAP-18试验组、利福平试验组、异烟肼试验组、乙胺丁醇试验组，同SAH4试验组，不同之处仅在于，采用BMAP-18、利福平、异烟肼或乙胺丁醇替代SAH4溶液。将各离心管在37℃下培养7d后，加入刃天青指示剂并作用2d，观察颜色变化。两天后，若培养基为蓝色，表示离心管中没有细菌，说明该浓度的药物具有抑菌效果；若培养基为紫色和红色，表示离心管中有存活的细菌，说明该浓度的药物无抑菌效果。
结果见表1。SAH4的最小抑菌浓度分别为25μM，显著低于BMAP-18、利福平、异烟肼和乙胺丁醇，说明SAH4的抑菌能力较BMAP-18有显著提升。
表1各药物的最小抑菌浓度
药物 最小抑菌浓度
SAH4 25μM
BMAP-18 300μM
利福平 400μM
异烟肼 800μM
乙胺丁醇 800μM
实施例5胰蛋白酶试验测定SAH4及BMAP-18抗蛋白酶水解的能力
以PBS(pH7.4)为溶剂分别配制4mg/ml的SAH4水溶液和10μg/ml的胰蛋白酶水溶液，取该胰蛋白酶溶液250μl加入250μl的SAH4溶液中，在冰浴中进行反应。于反应后不同时间取样，通过RP-HPLC检测SAH4的分解情况。RP-HPLC色谱条件如下：使用C18反相Bio-Rad分析柱，250×4mm，30nm孔径，7μm粒径；在0-40分钟，使用10-90％的乙腈水溶液线性梯度洗脱，乙腈和水中都含有0.1％的三氟乙酸(w/v)，流速为1.2mL/min。
另外，采用上述相同方法，以4mg/ml的BMAP-18水溶液替换SAH4水溶液，检测胰蛋白酶对BMAP-18的水解情况。
SAH4与胰蛋白酶作用不同时间段，通过RP-HPLC测定剩余的多肽量。由表2、图8和图9可见，SAH4被胰蛋白酶处理15min、30min、60min后，残留多肽分别占比为：84.84％、66.68％、43.82％，而BMAP-18被胰蛋白酶处理15min后，多肽仅剩余17.76％，处理30min后，多肽几近被完全水解。由此可见SAH4的抗蛋白酶水解能力较BMAP-18有显著增强。
表2 SAH4和BMAP-18在胰蛋白酶的作用下残留多肽情况
注：表2中残留多肽的计算方法：以初始反应0min多肽HPLC峰面积计为100％，采用如下公式计算残留多肽：残留多肽的RP-HPLC峰面积/初始多肽的RP-HPLC峰面积*100％。

Claims (10)

1.具有抗结核分枝杆菌活性的多肽，结构式如下：
2.权利要求1所述多肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)制备直链多肽，所述直链多肽的序列如SEQ ID NO:1；
(2)所述直链多肽中两个半胱氨酸残基的巯基与N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺进行脱水缩合反应，得到所述多肽。
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于直链多肽与N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺的摩尔比为1：7-15。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于步骤(2)中所述直链多肽和N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺分别溶于相应溶剂中，然后再混合，进行脱水缩合反应。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于直链多肽的溶剂为三氟乙酸和盐酸胍的混合溶液、尿素水溶液、乙腈、PBS缓冲液中的一种；N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺的溶剂为水、乙腈、甲醇和DMF中的一种。
6.根据权利要求5所述制备方法，其特征在于所述尿素水溶液的浓度为4-8mol/L。
7.根据权利要求6所述制备方法，其特征在于所述直链多肽在溶剂中的浓度1mmol/L-8mmol/L，N,N’-双(2-羟乙基)对苯二甲酰胺在溶剂中的浓度为15mmol/L-80mmol/L。
8.根据权利要求7所述制备方法，其特征在于步骤(2)反应中加入酸反应调节剂；所述酸反应调节剂为三氟乙酸；直链多肽溶液与酸反应调节剂之间的体积比为1:1～1:3。
9.根据权利要求8所述制备方法，其特征在于步骤(2)中反应温度为0-40℃，反应时间为0-10min。
10.权利要求1所述多肽在制备抗结核分枝杆菌的药物中的应用。
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