CN116531310A - 粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在制备用于改善皮肤状况产品中的应用 - Google Patents
粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在制备用于改善皮肤状况产品中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在制备用于改善皮肤状况产品中的应用。结果表明，粘液玫瑰单胞菌DL‑1、胞外多糖粗品或纯品分别在促进细胞增殖、改善皮肤屏障、增强皮肤保湿、增强皮肤抗菌能力、更新老化角质和抗衰老等方面至少一项具有优异效果，适用于制备改善皮肤相关功能的产品。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在制备用于改善皮肤状况产品中的应用。
背景技术
皮肤作为人体最大的器官，是内部器官与外界环境的第一道保护屏障，是人体抵御物理、化学、生物等各种外部致病因素的第一线防线。随着生活水平的不断提高，人们对皮肤的干燥、衰老等造成的皮肤问题越发重视，常使用相关功效护肤品或药物进行皮肤护理。
人体皮肤微生态是有细菌、真菌、病毒和螨虫等各种微生物与皮肤组织、细胞各种分泌物等共同组成的生态系统。皮肤常驻菌群参与皮肤皮脂代谢，维持皮肤表面酸碱度，分解角质，为皮肤抵抗外界病原体入侵起到了生物屏障作用，皮肤益生菌的代谢产物对宿主有直接或间接的保护作用，能够改善皮肤表面有益菌株的多样性，改善皮肤状况。
通过从健康人皮肤中筛选得到的皮肤共生菌菌株及其分泌物胞外多糖，具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明要解决的问题在于提供粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在制备同时兼具改善皮肤屏障、保湿、增强皮肤抗菌能力、更新老化角质和抗衰老的产品中的应用。
所述粘液玫瑰单胞菌分类号为粘液玫瑰单胞菌(Roseomonas mucosa)，菌株号为DL-1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No.25967。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所保藏中心，邮编100101。该菌株是发明人于2021年11月从健康人皮肤筛选得到的皮肤共生菌菌株。所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖通过如下方法制备得到：将粘液玫瑰单胞菌接种于R2A培养基中，25-37℃活化12-24h，将活化的粘液玫瑰单胞菌转接于发酵培养基中，30-37℃培养24-36h得到发酵液，将发酵液经除菌、除蛋白和无水乙醇沉淀后获得胞外多糖粗品，再经过DEAE离心交换树脂分离纯化后得到胞外多糖纯品。
其中，R2A培养基组分为：酵母浸出粉0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酪蛋白水解物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，可溶性淀粉0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，无水硫酸镁0.024g/L，丙酮酸钠0.3g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2。
优选地，所述发酵培养基配方如下：碳源10-100g/L，氮源1-30g/L，无机盐0.01-50g/L，pH5.0-9.0，所述溶剂为水。
其中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种几种的组合，优选为蔗糖、葡萄糖、乳糖、柠檬酸和淀粉中的任意一种或几种的组合；所述氮源为酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合，优选为蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为氯化钠、硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。
在一个优选的实施方式中，发酵培养基组分为胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH值7.3。
实验表明，粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在改善皮肤屏障，在保湿、增强皮肤抗菌能力、更新老化角质和抗衰老等方面效果优异。
具体地，本申请提出了粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖制剂在改善皮肤细胞状况的产品中的应用。
所述粘液玫瑰单胞菌DL-1具有下述性质：
菌落形态学特征
在R2A培养基32℃培养16-24h后显微镜观察到菌落为单菌落，形态如图1A所示。该分类为红螺菌目，醋杆菌科，球杆状，属于革兰氏阴性菌，产红色色素，形态呈粘液状，且单个、成对或短链状排列，具有鞭毛能够运动。在上述培养基中32℃培养12h菌体可以大量生长，其生长的温度范围是5-40℃，最适温度为30-35℃，生长的pH范围是5.0-9.5，最适pH为6.5-7.5。能在LB、R2A、TSB、BAB等培养基中正常生长。
16S rDNA序列分析
16S rDNA序列长度1464bp。将16S rDNA序列和GeneBank数据库中的相关种进行比较，菌株DL-1与粘液玫瑰单胞菌相似性达到99.86％。所以认定本发明的菌株为粘液玫瑰单胞菌(Roseomonas mucosa)，菌株号为DL-1，并保藏在中国普通微生物菌种管理中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No.25967。
在一个具体的实施方式中，通过如下步骤制备粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖粗品：将粘液玫瑰单胞菌DL-1接种在TSB培养基中32℃培养24h，通过3000-5000rpm离心10min除菌，加入1倍体积无水乙醇后在4℃过夜得到沉淀，利用去离子水复溶后，进行冻干干燥得到胞外多糖粗品(R.mucosa DL-1Unpurified EPS，DL-U-EPS)。
本申请制备得到的粘液玫瑰单胞菌胞外多糖粗品的重均分子量为1100-2000kDa，包含岩藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、核糖。
具体地，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖粗品的单糖组成为：岩藻糖：阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：甘露糖：核糖＝0.32:0.75:6.14:1.78:52.55:37.04:1.43。
在一个具体的实施方式中，通过如下步骤制备粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖：将粘液玫瑰单胞菌DL-1接种在TSB培养基中32℃培养24h，通过3000-5000rpm离心10min除菌，加入1/2体积的sevage试剂除蛋白后，加入1倍体积无水乙醇后在4℃过夜得到胞外多糖粗糖沉淀，利用去离子水复溶后，通过DEAE-52分离纯化后进行冻干干燥得到胞外多糖纯品(R.mucosa DL-1EPS，EPS)。
本申请制备得到的粘液玫瑰单胞菌胞外多糖纯品的重均分子量为3000-3500Da，包含阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。
具体地，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖的单糖组成为：阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：核糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸：甘露糖醛酸：古罗糖醛酸＝0.50～0.6:1.3～1.5:1.3～2:72-78:4-7:9-11:0.9-1.1:0.5-2.4:0.6-1.4:0.6-1.4:0.9-1.7。
具体地，所述改善皮肤屏障为恢复细胞活力和/或正调控屏障修护相关基因的表达、促进HaCaT细胞的增殖；所述屏障修护相关基因包括IVL和OVOL1中的至少一种。
具体地，在一些实施例中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，对所述的粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖的促进细胞增殖效果进行研究。结果表明，所述的粘液玫瑰单胞菌可促进HaCaT角质细胞增殖。
具体地，在一些实施例中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调细胞的屏障修复相关基因IVL和OVOL1的表达，改善皮肤屏障。
所述保湿为正调控保湿相关基因AQP3的表达。
所述增强皮肤抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括银屑病素S100A7、β-防御素4DEFB4和cathelicidin家族抗菌肽LL-37中的至少一种。具体地，在一些实施例中，本发明以HaCaT角质细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调抗菌肽相关基因S100A7、DEFB4和LL-37的表达，增强皮肤抗菌能力。
为了探究所述的粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖的抗衰老效果，本发明对细胞衰老相关的指标进行了测定，所述的指标包括细胞外基质合成、细胞外基质降解、细胞抗氧化、细胞免疫调节因子、细胞凋亡、细胞自噬、抑制细胞凋亡以及细胞生长因子中的至少一个。
所述抗衰老包括如下①～④中所示至少一种：
①、正调控细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括丝氨酸棕榈转移酶基因SPTSSA、莫霍克蛋白基因MKX和信号转导蛋白基因SMAD3中的至少一种；
②、正调控抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达；
③、正调控细胞抗氧化相关基因NRF2的表达；
④、正调控细胞生长因子相关基因的表达；所述细胞生长因子相关基因包括FGF1、FGF2和HGF中的至少一种。
具体地，在一些实施例中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调细胞外基质合成相关基因SPTSSA、SMAD3和MKX的表达，促进细胞外基质的合成。
具体地，在一些实施例中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调抗氧化相关基因NRF2的表达，增强细胞的抗氧化能力
具体地，在一些实施例中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达，抑制细胞凋亡。
具体地，在一些实施例中，本发明以HFF成纤维细胞为受试对象，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调成纤维细胞生长因子相关基因FGF1、FGF2、HGF的表达，促进细胞生长。
所述更新老化角质包括上调降解桥粒蛋白相关基因KLK5和/或上调调节角质细胞分化相关基因CD44的表达。具体地，在一些实施例中，所述粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可以上调UVB诱导的HaCaT细胞的降解桥粒蛋白相关基因KLK5的表达；上调调节角质细胞分化相关基因CD44的表达，所述的粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖可促进老化角质细胞间的桥粒蛋白降解使老化角质细胞脱落，同时调节角质细胞分化更新角质细胞。
本发明进一步提供了改善皮肤状况的产品，其原料包括R.mucosa DL-1及其胞外多糖。
具体地，所述的产品包括以下至少一项：
所述粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂。
所述粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1胞外多糖粗品及纯品制剂。
更进一步的，所述产品的剂型包括膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的至少一种，本发明对此不做限定。
本发明还提供了改善皮肤状况的方法，包括：使用本发明所述的产品。所述的产品的使用方法包括内服或外用，所述外用包括涂抹、外敷、熏蒸或注射，本发明对此不做限定。
本发明提供的粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在改善皮肤屏障、保湿、增强皮肤抗菌能力、更新老化角质和抗衰老等方面具有优异的效果，适用于制备改善皮肤相关功能的食品、药品、化妆品等。
附图说明
图1为粘液玫瑰单胞菌生物学特征；A：菌落形态，B：革兰氏染色，C：扫描电子显微照片，D：16S rRNA序列的系统发育树分析；
图2为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS洗脱曲线；
图3为标准样品离子色谱图；
图4为胞外多糖粗品和胞外多糖纯品样品离子色谱图；
图5为胞外多糖粗品和胞外多糖纯品样品散射光谱图；
图6为粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖对皮肤屏障修护相关因子内皮蛋白基因IVL、OVO样转录因子1基因OVOL1表达的作用，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001；
图7为粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖对皮肤保湿相关的水通道蛋白3基因AQP3表达的作用，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001；
图8为粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖对HaCaT细胞的增殖作用，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001；
图9为粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖对H2O2诱导的HFF细胞氧化模型对细胞外基质相关的丝氨酸棕榈转移酶基因SPTSSA、莫霍克蛋白基因MKX和信号转导蛋白基因SMAD3表达的作用，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001；
图10为粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖对H2O2诱导的HFF细胞氧化模型对抗氧化相关的核因子E2相关因子2基因NRF2，以及对抑制细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因BCL-2表达的作用，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001；
图11为粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖对H2O2诱导的HFF细胞氧化模型对细胞生长因子相关的成纤维细胞生长因子基因FGF1、FGF2、肝细胞生长因子基因HGF表达的作用，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001；
图12为粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖的上调HaCaT细胞抗菌肽相关基因银屑病素S100A7、β-防御素4DEFB4、cathelicidin家族抗菌肽LL-37表达的作用，
*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001；
图13为粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖对UVB诱导的HaCaT细胞光老化模型对降解桥粒蛋白相关基因激肽释放酶5基因KLK5，跨膜粘附糖蛋白CD44的表达的作用，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001。
具体实施方式
实施例1粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖的制备。
(一)粘液玫瑰单胞菌DL-1的培养
将4℃斜面保存的粘液玫瑰单胞菌DL-1活化，接种于种子培养基(即活化培养基)上，活化温度为32℃，活化时间为16h。将种子发酵液10％接种于发酵培养基中，转速为200rpm，32℃培养24h得发酵液，发酵液活菌数量可达到5×109CFU/mL以上。
所述活化培养基为R2A培养基，培养基组分为：酵母浸出粉0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酪蛋白水解物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，可溶性淀粉0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，无水硫酸镁0.024g/L，丙酮酸钠0.3g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2。所述发酵培养基组分为胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH值7.3。
其中，粘液玫瑰单胞菌DL-1是发明人从健康人皮肤筛选得到的皮肤共生菌。粘液玫瑰单胞菌DL-1具有下述性质：
1)菌落形态学特征
在R2A培养基32℃培养16-24h后显微镜观察到菌落为单菌落，形态如图1A所示。对其进行革兰氏染色，结果如图1B所示，球杆状，属于革兰氏阴性菌，通过电镜扫描，形态如图1C所示，可见分泌大量生物膜，具有鞭毛能够运动。在上述培养基中32℃培养12h菌体可以大量生长，产红色色素，形态呈粘液状，且单个、成对或短链状排列。其生长的温度范围是5-40℃，最适温度为30-35℃，生长的pH范围是5.0-9.5，最适pH为6.5-7.5。能在LB、R2A、TSB、BAB等培养基中正常生长。
2)16S rDNA序列分析
16S rDNA序列长度1464bp。将16S rDNA序列和GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树如图1D所示。结果表明：菌株DL-1与粘液玫瑰单胞菌相似性达到99.86％。所以认定本发明的菌株为粘液玫瑰单胞菌(Roseomonasmucosa)，该分类为红螺菌目，醋杆菌科，菌株号为DL-1，并保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No.25967。
(二)粘液玫瑰单胞菌DL-1的活菌制剂
将上述发酵液离心(9000rpm,5min)后将菌体重悬至TSB中得到活菌制剂，活菌数量达到1×106CFU/mL。
(三)粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖的制备
将上述得到的发酵液离心(3000-4000rpm,10min)除菌，将1倍体积的发酵液加入2倍体积的sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1，体积比)中，重复2-3次以去除蛋白，然后加入1倍体积无水乙醇，在4℃过夜离心(3000-4000rpm,10min)得到胞外多糖粗品沉淀，利用去离子水复溶后，进行冻干干燥得到胞外多糖粗品(R.mucosa DL-1Unpurified EPS，DL-U-EPS)，分别测定胞外多糖粗品单糖组成、分子量。
将胞外多糖粗品晾干后，利用去离子水复溶。利用硫酸-苯酚法测定约5-6g胞外多糖粗品进行DEAE离心交换树脂分离纯化，洗脱曲线如图2所示，收集0.2M NaCl洗脱组分进行冻干后，分别测定胞外多糖纯品单糖组成、分子量。
胞外多糖单糖测定方法如下：Thermo ICS5000离子色谱系统(ICS5000，ThermoFisher Scientific，USA)，利用电化学检测器对混标和样本单糖组分进行分析检测。分别准确称取本项目所需标准品后，加入水配成10mg/mL标准溶液母液单标，然后取适量标准品母液单标混合配制成最高指标浓度为60μg/mL、50μg/mL或40μg/mL的标准品混标，根据以下浓度梯度配制成上机所需系列标准品。
表1.单糖混标梯度浓度信息
*标准品主要来自sigma公司
采用DionexTMCarboPacTMPA20(150*3.0mm，10μm)液相色谱柱；进样量为5μl。流动相A(H2O)，流动相B(0.1M NaOH)，流动相C(0.1M NaOH，0.2M NaAc)，流速0.5ml/min；柱温为30℃；洗脱梯度：0min A相/B相/C相(95：5：0，V/V)，26min A相/B相/C相(85：5：10，V/V)，42min A相/B相/C相(85：5：10，V/V)，42.1min A相/B相/C相(60：0：40，V/V)，52min A相/B相/C相(60：40：0，V/V)，52.1min A相/B相/C相(95：5：0，V/V)，60min A相/B相/C相(95：5：0，V/V)。
标准品测定结果如图3所示，13个标准品均为单峰。胞外多糖粗品样本色谱图如图4A所示，根据标准品保留时间和样本浓度的标准曲线进行计算，确定胞外多糖粗品DL-U-EPS单糖组成为岩藻糖：阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：甘露糖：核糖＝0.32:0.75:6.14:1.78:52.55:37.04:1.43。
胞外多糖纯品样本色谱图如图4B所示，根据标准品保留时间和样本浓度的标准曲线进行计算，确定胞外多糖纯品单糖组成为阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：核糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸：甘露糖醛酸：古罗糖醛酸＝0.51:1.47:1.8:73.98:4.67:9.96:0.94:2.33:1.35:1.32:1.67。
胞外多糖分子量测定方法如下：色谱系统采用的是凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统，液相系统为U3000(Thermo,USA)，示差检测器为Optilab T-rEX(Wyatttechnology，CA，USA)，激光光散射检测器为DAWN HELEOSⅡ(Wyatt technology，CA，USA)。采用凝胶排阻色谱柱(Ohpak SB-805HQ(300×8mm)，Ohpak SB-804HQ(300×8mm)和OhpakSB-803HQ(300×8mm)串联。柱温45℃，进样量100μL，流动相A(0.02％ NaN3，0.1M NaNO3)，流速0.4mL/min，洗脱梯度：等度，100min。胞外多糖粗品结果如图5A所示，样品保留时间分别为32.5min、47.5min、58.5min和64min，根据马克-霍温克方程进行计算，每个吸收峰对应的重均分子量分别为3677.4kDa,283.4kDa,20.6kDa和3.8kDa。胞外多糖纯品结果如图5B所示，样品保留时间为63.5min，根据马克-霍温克方程进行计算，其重均分子量为3000Da，检测为单峰，确定为胞外多糖纯品。
实施例2粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖促进HaCaT屏障修复相关基因表达实验。
将HaCaT细胞铺在含2mL含有10％FBS和的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为1×105cell/well，过夜培养养至细胞贴壁。分别加入实施例1中得到的粘液玫瑰单胞菌DL-1的活菌制剂1×106CFU/mL，胞外多糖粗品DL-U-EPS及胞外多糖纯品EPS浓度分别为0.5μg/mL(U-EPS-L，EPS-L)和5μg/mL(U-EPS-H，EPS-H)，对照组加入等体积培养基。培养24h后，将上述收集的细胞采用TRIZOL试剂盒提取HaCaT细胞总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，利用SYBR Green试剂盒在ABI Prism 7900实时定量PCR仪上进行检测IVL和OVOL1 mRNA表达水平。以β-actin作为内参，分别以添加等体积培养基处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，目的基因的mRNA的相对表达量根据2－ΔΔCt计算。
如图6所示，粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖具有上调皮肤屏障修护相关因子内皮蛋白基因IVL、OVO样转录因子1基因OVOL1表达的作用，基因表达上调1.41～3.16倍，其中低剂量胞外多糖粗品DL-U-EPS对IVL的上调效果最佳，P<0.0001；低剂量胞外多糖纯品EPS对OVOL1上调效果最佳，P<0.01。表明粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖具有促进皮肤屏障修复的作用。
实施例3粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖上调HaCaT保湿相关基因表达实验。
将HaCaT细胞铺在含2mL含有10％FBS和的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为1×105cell/well，过夜培养养至细胞贴壁。分别加入实施例1中得到的粘液玫瑰单胞菌DL-1的活菌制剂1×106CFU/mL，胞外多糖粗品DL-U-EPS及胞外多糖纯品EPS浓度分别为0.5μg/mL(U-EPS-L，EPS-L)和5μg/mL(U-EPS-H，EPS-H)，对照组加入等体积培养基。培养24h后，将上述收集的细胞采用TRIZOL试剂盒提取HaCaT细胞总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，利用SYBR Green试剂盒在ABI Prism 7900实时定量PCR仪上进行检测AQP3 mRNA表达水平。以β-actin作为内参，分别以添加等体积培养基处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，目的基因的mRNA的相对表达量根据2－ΔΔCt计算。
如图7所示，粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖具有上调保湿相关的水通道蛋白3基因AQP3的作用，基因表达上调2.49～3.70倍，其中低剂量及高剂量胞外多糖粗品均有显著上调AQP3的作用，P值分别为P<0.0001及P<0.001。表明粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖具有促进皮肤保湿的作用。
实施例4粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖促进HaCaT细胞的增殖。
将HaCaT细胞铺在含100uL含有10％FBS和的DMEM培养基的96孔培养板中，其中细胞浓度为3×104cell/well，过夜培养养至细胞贴壁。分别加入实施例1中得到的粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖粗品DL-U-EPS及胞外多糖纯品EPS浓度分别为0.5μg/mL(U-EPS-L，EPS-L)和5μg/mL(U-EPS-H，EPS-H)，对照组加入等体积培养基。培养24h。向每孔加入10μl的CCK-8溶液，培养1小时，检测450nm处吸光度A，按照计算公式：细胞增殖率＝(实验组A-对照组A)/对照组A*100％。
如图8所示，粘液玫瑰单胞菌胞外多糖具有促进HaCaT角质细胞增殖的作用。增殖率为13.8％～48.33％。
实施例5粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖调节氧化损伤HFF细胞外基质/抗氧化/抑制细胞凋亡/细胞生长因子/细胞凋亡相关基因表达实验。
将HFF细胞铺在含2mL含有15％FBS和的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为3×105cell/well，过夜培养养至细胞贴壁。每孔加入终浓度为200μM的H2O2进行刺激，37℃静置1h。弃掉原培养基，PBS清洗两次，加入2mL新培养基。分别加入实施例1中得到的粘液玫瑰单胞菌DL-1的活菌制剂1×106CFU/mL，胞外多糖粗品U-EPS及胞外多糖纯品浓度分别为0.5μg/mL(U-EPS-L，EPS-L)和5μg/mL(U-EPS-H，EPS-H)，对照组加入等体积培养基。培养4h后，将上述收集的细胞采用TRIZOL试剂盒提取HFF细胞总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，利用SYBR Green试剂盒在ABI Prism 7900实时定量PCR仪上进行检测细胞外基质合成相关基因(SPTSSA、MKX和SMAD3)、抗氧化基因NRF2、抑制细胞凋亡基因(BCL-2)、细胞生长因子相关基因(FGF1、FGF2和HGF)mRNA表达水平。以β-actin作为内参，分别以添加等体积培养基处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，目的基因的mRNA的相对表达量根据2－ΔΔCt计算。
如图9-11所示，粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖可以上调HFF细胞外基质合成相关的丝氨酸棕榈转移酶基因SPTSSA的转录水平，其中胞外多糖粗品高剂量处理组(U-EPS-L)、胞外多糖纯品低剂量处理组(EPS-L)和粘液玫瑰单胞菌DL-1处理组具有显著性差异。粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖上调莫霍克蛋白基因MKX的转录水平，其中胞外多糖粗品高剂量和低剂量处理组和粘液玫瑰单胞菌DL-1处理组具有显著性差异。粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖粗品具有上调信号转导蛋白基因SMAD3的转录水平，其中胞外多糖粗品高剂量处理组和粘液玫瑰单胞菌DL-1处理组具有显著性差异。粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖可以上调抗氧化相关的核因子E2相关因子2基因NRF2，上述基因基因表达上调1.20～3.54倍，其中胞外多糖粗品处理组和粘液玫瑰单胞菌DL-1处理组具有显著性差异。粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖具有上调细胞凋亡相关的B淋巴细胞瘤-2基因BCL-2的转录水平，其中胞外多糖粗品高剂量处理组、胞外多糖纯品高低剂量处理组和粘液玫瑰单胞菌DL-1处理组具有显著性差异。粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖具有上调细胞生长因子基因FGF1，其中粘液玫瑰单胞菌DL-1处理组具有显著性差异。粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖具有上调细胞生长因子基因FGF2的转录水平，其中胞外多糖粗品处理组、胞外多糖纯品高剂量处理组和粘液玫瑰单胞菌DL-1处理组具有显著性差异。粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖具有上调肝细胞生长因子基因HGF的转录水平，其中胞外多糖粗品处理组和粘液玫瑰单胞菌DL-1处理组具有显著性差异(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001)。通过测定粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖对细胞衰老相关的上述指标(细胞外基质、抗氧化、抑制细胞凋亡、细胞生长因子和细胞凋亡相关基因表达)的影响，结果表明粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖具有抗衰老的作用。
实施例6粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖的上调HaCaT细胞抗菌肽相关基因表达实验。
将HaCaT细胞铺在2mL含有10％FBS和的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为1×105cell/well，过夜培养养至细胞贴壁。分别加入实施例1中得到胞外多糖粗品DL-U-EPS及胞外多糖纯品EPS浓度分别为0.5μg/mL(U-EPS-L，EPS-L)和5μg/mL(U-EPS-H，EPS-H)，对照组加入等体积培养基。2h后每孔加入终浓度为200ng/ml的LPS溶液，培养24h后，将上述收集的细胞采用TRIZOL试剂盒提取HaCaT细胞总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，利用SYBR Green试剂盒在ABI Prism 7900实时定量PCR仪上进行检测S100A7、DEFB4、LL-37mRNA表达水平。以β-actin作为内参，分别以添加等体积培养基处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，目的基因的mRNA的相对表达量根据2－ΔΔCt计算。
如图12所示，粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖具有促进抗菌肽相关基因银屑病素S100A7、β-防御素4DEFB4、cathelicidin家族抗菌肽LL-37表达的作用，基因表达上调1.071～1.867倍，其中粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖纯品效果最为显著(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，****P<0.0001)。该结果表明粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖具有增强皮肤抗菌能力的作用。
实施例7粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖的调节HaCaT细胞更新老化角质相关基因表达实验。
将HaCaT细胞铺在含2mL含有10％FBS和的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为1×105cell/well，过夜培养养至细胞贴壁。分别加入实施例1中得到的粘液玫瑰单胞菌DL-1的活菌制剂1×106CFU/mL，胞外多糖粗品DL-U-EPS及胞外多糖纯品EPS浓度分别为0.5μg/mL(U-EPS-L，EPS-L)和5μg/mL(U-EPS-H，EPS-H)，对照组加入等体积培养基。对孔内细胞进行总剂量为40mj/cm2的紫外线光老化实验。培养4h后，将上述收集的细胞采用TRIZOL试剂盒提取HaCaT细胞总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，利用SYBRGreen试剂盒在ABI Prism 7900实时定量PCR仪上进行检测KLK5和CD44 mRNA表达水平。以β-actin作为内参，分别以添加等体积培养基处理组为对照(基因相对表达倍数F＝1)，目的基因的mRNA的相对表达量根据2－ΔΔCt计算。
如图13所示，粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖具有有上调降解桥粒蛋白相关基因激肽释放酶5基因KLK5，跨膜粘附糖蛋白CD44的表达，基因表达量上调23.60～73.12倍，其中低剂量的胞外多糖粗品处理组及胞外多糖纯品EPS(低剂量和高剂量)均有显著上调KLK5及CD44的作用，且P值均小于0.0001，有显著性差异。因此粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖可促进老化角质细胞间的桥粒蛋白降解使老化角质细胞脱落，同时调节角质细胞分化更新角质细胞，具有抗衰老的作用。
Claims (10)
1.粘液玫瑰单胞菌及其胞外多糖在制备用于改善皮肤状况的产品中的应用，其中，所述粘液玫瑰单胞菌分类号为粘液玫瑰单胞菌（Roseomonas mucosa），菌株号为DL-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No. 25967，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖通过如下方法制备得到：将粘液玫瑰单胞菌接种于R2A培养基中，25-37℃活化12-24 h，将活化的粘液玫瑰单胞菌转接于发酵培养基中，30-37 ℃培养24-36 h得到发酵液，将发酵液经除菌、除蛋白和无水乙醇沉淀后获得胞外多糖粗品，再经过DEAE离心交换树脂分离纯化后得到胞外多糖纯品。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在应用时，粘液玫瑰单胞菌胞外多糖以粗品或纯品的形式应用。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善皮肤状况包括改善皮肤屏障、保湿、增强皮肤抗菌能力、更新老化角质和抗衰老中的至少一种。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，粘液玫瑰单胞菌胞外多糖粗品重均分子量为1100-2000 kDa；粘液玫瑰单胞菌胞外多糖纯品的重均分子量为3000-3500 Da。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述改善皮肤屏障为恢复细胞活力和/或正调控屏障修护相关基因的表达、促进HaCaT细胞的增殖；所述屏障修护相关基因包括IVL和OVOL1中的至少一种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保湿为正调控保湿相关基因AQP3的表达。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述增强皮肤抗菌能力包括上调抗菌肽相关基因的表达，所述抗菌肽相关基因包括银屑病素S100A7、β-防御素4 DEFB4和cathelicidin家族抗菌肽LL-37中的至少一种。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抗衰老包括如下①～④中所示至少一种：
①、正调控细胞外基质相关基因的表达；所述细胞外基质相关基因包括丝氨酸棕榈转移酶基因SPTSSA、莫霍克蛋白基因MKX和信号转导蛋白基因SMAD3中的至少一种；
②、正调控抑制细胞凋亡相关基因BCL-2的表达；
③、正调控细胞抗氧化相关基因NRF2的表达；
④、正调控细胞生长因子相关基因的表达；所述细胞生长因子相关基因包括FGF1、FGF2和HGF中的至少一种。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述更新老化角质包括上调降解桥粒蛋白相关基因KLK5和/或上调调节角质细胞分化相关基因CD44的表达。
10.根据权利要求1-9任一项所述的应用，其特征在于，所述产品形式为膏霜类、乳液类、油剂类、水剂类、凝胶类、粉剂类、冻干类中的任意一种。
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