CN116617269A - 粘液玫瑰单胞菌活菌制剂及胞外多糖在制备用于缓解uvb导致的皮肤损伤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种皮肤共生菌粘液玫瑰单胞菌活菌制剂在缓解UVB导致的皮肤损伤中的应用，并进一步提出了基于其制备得到的胞外多糖在UVB导致的皮肤损伤中的应用。结果表明，在UVB引起角质形成细胞炎症模型中，粘液玫瑰单胞菌DL‑1活菌制剂及其胞外多糖对UVB引起的角质形成细胞凋亡具有保护效应，可以降低UVB引起的氧化应激和炎症反应，减少UVB引起的细胞凋亡，同时粘液玫瑰单胞菌DL‑1活菌制剂及其胞外多糖可以缓解UVB引起的C57/BL6小鼠背部的表皮增厚、炎症浸润等急性损伤。粘液玫瑰单胞菌DL‑1活菌制剂及其胞外多糖对UVB诱导的急性皮肤损伤有较好的修复作用，在对抗UVB引起的相关疾病具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种皮肤共生菌粘液玫瑰单胞菌活菌制剂及胞外多糖在制备用于缓解UVB导致的皮肤损伤的药物中的应用。
背景技术
随着大气污染逐年加重，臭氧层遭到严重破坏，辐射到地球表面紫外线显著增加，影响人们的生活质量。日光中UVB可以引起日晒伤、色沉和皮肤鳞状细胞癌等一系列皮肤病。皮肤上角质形成细胞(HaCaT)是表皮的主要组成细胞，HaCaT细胞是UVB在表皮的主要作用靶点，UVB几乎全部被HaCaT细胞吸收，可以诱导HaCaT细胞产生过量的活性氧(ROS)，破坏自身抗氧化防御系统，引起脂质过氧化反应，影响相关信号传导通路，损伤细胞结构或功能。UVB辐照会促使其分泌白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-1β(IL-1β)等多种炎症因子介导炎症反应，调节免疫应答以及诱导细胞凋亡等细胞生理活动，继而造成皮肤不良表现，如红斑、红肿、松弛、干燥、脱屑，并出现色素沉着等。
发明内容
发明目的：为了解决UVB导致的皮肤损伤的问题，本发明提供了一种皮肤共生菌粘液玫瑰单胞菌(R.mucosa)活菌制剂和胞外多糖在制备用于缓解UVB导致的皮肤损伤的药物中的应用。
本发明进一步提供了粘液玫瑰单胞菌活菌制剂和胞外多糖的制备方法。
本发明更进一步地提供了皮肤共生菌粘液玫瑰单胞菌活菌制剂和胞外多糖在缓解UVB导致的HaCaT细胞和小鼠急性背部损伤的炎症因子转录水平检测和病理生理状态的作用。
具体地，本发明提出了粘液玫瑰单胞菌活菌制剂在制备用于缓解UVB导致的皮肤损伤的药物中的应用，所述粘液玫瑰单胞菌活菌制剂通过如下方法制备得到：将粘液玫瑰单胞菌接种于R2A培养基中，25-37℃活化12-24h，将活化的粘液玫瑰单胞菌转接于发酵培养基中，30-37℃培养24-36h得到发酵液，将发酵液离心后将菌体重悬于给药溶剂后即得活菌制剂；其中，所述给药溶剂为丙三醇、丙二醇中的任意一种。
所述粘液玫瑰单胞菌分类号为粘液玫瑰单胞菌(Roseomonas mucosa，亦记为R.mucosa)，菌株号为DL-1已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No.25967。该菌株是发明人于2021年11月从健康人皮肤筛选得到的皮肤共生菌菌株。
其中，R2A培养基组分为：酵母浸出粉0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酪蛋白水解物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，可溶性淀粉0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，无水硫酸镁0.024g/L，丙酮酸钠0.3g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2。
优选地，所述发酵培养基配方如下：碳源10-100g/L，氮源1-30g/L，无机盐0.01-50g/L，pH5.0-9.0，所述溶剂为水。
其中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种几种的组合，优选为蔗糖、葡萄糖、乳糖、柠檬酸和淀粉中的任意一种或几种的组合；所述氮源为酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合，优选为蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为氯化钠、硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。
在一个优选的实施方式中，发酵培养基组分为胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH值7.3。
所述活菌制剂中粘液玫瑰单胞菌活菌数为1×106-1×109CFU/mL。
优选地，粘液玫瑰单胞菌活菌数为1×105-1×107CFU/mL；更优选地，粘液玫瑰单胞菌活菌数为1×105-1×106CFU/mL。
研究结果表明，所述粘液玫瑰单胞菌活菌制剂降低UVB照射导致的HaCaT细胞的氧化应激水平和细胞凋亡。
所述粘液玫瑰单胞菌活菌制剂改善UVB辐照诱导的C57BL/6小鼠背部皮肤皮损，包括红斑、水肿、渗出及结痂，抑制UVB辐照引起的背部皮损处的角质形成细胞凋亡，并降低皮损处炎症因子转录水平。
本发明进一步提出了粘液玫瑰单胞菌胞外多糖在制备用于缓解UVB导致的皮肤损伤的药物中的应用，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖通过如下方法制备得到：将粘液玫瑰单胞菌CGMCC 25967接种于R2A培养基中，25-37℃活化12-24h，将活化的粘液玫瑰单胞菌转接于发酵培养基中，30-37℃培养24-36h得到发酵液，将发酵液经除菌、除蛋白、无水乙醇沉淀、DEAE离心交换树脂分离纯化得到胞外多糖。
具体地，通过3000-5000rpm离心10min除菌，加入1/2体积的sevage试剂除蛋白3次后，加入1倍体积无水乙醇后在4℃过夜得到胞外多糖粗糖沉淀，利用去离子水复溶后，通过DEAE-52分离纯化后进行冻干干燥得到胞外多糖(后文R.mucosa DL-1EPS，DL-EPS均具有相同含义)。
所述胞外多糖的重均分子量为3000-3500Da，其单糖组成包含阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。
在一些具体的实施方式中，所述胞外多糖的单糖组成为：阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：核糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸：甘露糖醛酸：古罗糖醛酸＝0.50～0.6:1.3～1.5:1.3～2:72-78:4-7:9-11:0.9-1.1:0.5-2.4:0.6-1.4:0.6-1.4:0.9-1.7。
本申请研究发现，粘液玫瑰单胞菌胞外多糖在缓解UVB引起的相关疾病、光老化和晒后修复中同样具有较好的应用前景。
具体地，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖降低UVB辐照导致的HaCaT细胞的氧化应激和凋亡，降低UVB辐照诱导的HaCaT细胞炎症因子的转录水平；所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖抑制UVB辐照导致的I型干扰素IFN-β的转录水平升高；所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖改善UVB辐照诱导的C57BL/6小鼠背部皮肤红斑、水肿、渗出及结痂，抑制UVB辐照引起的背部皮损处的角质形成细胞凋亡，并降低皮损处炎症因子转录水平。
具体地，胞外多糖DL-EPS在细胞模型的用量为0.5-4.5mg/mL，局部外用治疗UVB诱导的C57/BL6急性模型的用量为0.1-0.5mg/cm2。
其中，所述粘液玫瑰单胞菌活菌制剂和胞外多糖可与不含抗生素类药物及护肤产品配合使用，也可单独使用。
有益效果：本申请提出了皮肤共生菌粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS可以拮抗UVB辐照诱导的HaCaT细胞氧化应激反应，同时可降低50mJ/cm2UVB诱导的HaCaT细胞的炎症因子转录水平，降低50mJ/cm2 UVB诱导的HaCaT细胞凋亡，有效缓解430mJ/cm2 UVB诱导的C57BL/6小鼠肉眼皮损和镜下皮损病理下改变，可抑制430mJ/cm2UVB诱导的C57BL/6小鼠皮损处IL-1处、IL-6和TNF-处重要炎症因子的转录。本发明中所述的皮肤共生菌R.mucosa活菌制剂和胞外多糖对UVB导致的表皮角质形成细胞的凋亡有一定保护效应，从而改善UVB导致的急性皮肤炎症。
附图说明
图1为粘液玫瑰单胞菌生物学特征；A：菌落形态，B革兰氏染色，C：扫描电子显微照片，D：16S rRNA序列的系统发育树分析；
图2为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖DL-EPS洗脱曲线；
图3为标准样品离子色谱图；
图4为胞外多糖DL-EPS样品离子色谱图；
图5为胞外多糖DL-EPS样品散射光谱图；
图6为皮肤共生菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS对HaCaT细胞毒性的影响结果图；
图7为皮肤共生菌R.mucosa DL-1的活菌制剂对50mJ/cm2 UVB辐照诱导的活性氧的影响结果图；
图8为R.mucosa DL-1胞外多糖DL-EPS对50mJ/cm2 UVB辐照诱导的活性氧的影响结果图；
图9为皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖DL-EPS对50mJ/cm2 UVB辐照诱导的HaCaT细胞主要炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α及IFN-β转录水平的影响结果图(显著性标记：*，P<0.05；**，P<0.01，***，P<0.001；****，P<0.0001)
图10为皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖DL-EPS对50mJ/cm2 UVB辐照诱导的HaCaT细胞凋亡影响结果图；
图11为粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS对430mJ/cm2 UVB辐照诱导的C57BL/6小鼠背部肉眼皮损和镜下皮损病理的影响；
图12为粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS对430mJ/cm2 UVB辐照诱导的C57BL/6小鼠背部皮损处炎症因子转录水平的影响结果图(显著性标记：*，P<0.05；**，P<0.01，***，P<0.001；****，P<0.0001)；
图13为粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS对430mJ/cm2 UVB辐照诱导的C57BL/6小鼠背部表皮角质形成细胞凋亡的影响结果图(蓝色，DAPI；红色，PI；绿色，Pan Cytokeratin)。
具体实施方式
实施例1粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的发酵。
将4℃斜面保存的粘液玫瑰单胞菌DL-1活化，接种于种子培养基(即活化培养基)上，活化温度为32℃，活化时间为16h。将种子发酵液10％接种于发酵培养基中，转速为200rpm，32℃培养24h得发酵液，发酵液活菌数量可达到5×109CFU/mL以上。
所述活化培养基为R2A培养基，培养基组分为：酵母浸出粉0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酪蛋白水解物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，可溶性淀粉0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，无水硫酸镁0.024g/L，丙酮酸钠0.3g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2。所述发酵培养基组分为胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH值7.3。
其中，粘液玫瑰单胞菌DL-1是发明人从健康人皮肤筛选得到的皮肤共生菌。粘液玫瑰单胞菌DL-1具有下述性质：
1)菌落形态学特征
在R2A培养基32℃培养16-24h后显微镜观察到菌落为单菌落，形态如图1A所示。对其进行革兰氏染色，结果如图1B所示，球杆状，属于革兰氏阴性菌，通过电镜扫描，形态如图1C所示，可见分泌大量生物膜，具有鞭毛能够运动。在上述培养基中32℃培养12h菌体可以大量生长，产红色色素，形态呈粘液状，且单个、成对或短链状排列。其生长的温度范围是5-40℃，最适温度为30-35℃，生长的pH范围是5.0-9.5，最适pH为6.5-7.5。能在LB、R2A、TSB、BAB等培养基中正常生长。
2)16S rDNA序列分析
16S rDNA序列长度1464bp。将16S rDNA序列和GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树如图1D所示。结果表明：菌株DL-1与粘液玫瑰单胞菌相似性达到99.86％。所以认定本发明的菌株为粘液玫瑰单胞菌(Roseomonasmucosa)，该分类为红螺菌目，醋杆菌科，菌株号为DL-1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No.25967。
实施例2粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS的制备。
将实施例1中的发酵液离心(9000rpm,10min)后将菌体重悬至丙二醇中得到活菌制剂，活菌数量达到1×109CFU/mL。
将实施例1中的发酵液离心(3000-4000rpm,10min)除菌，将1倍体积的发酵液加入2倍体积的sevage试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)中，重复2-3次以去除蛋白，然后加入1倍体积无水乙醇，在4℃过夜离心(3000-4000rpm，10min)得到胞外多糖粗品沉淀，晾干后，利用去离子水复溶。利用硫酸-苯酚法测定约5-6g胞外多糖粗品进行DEAE离心交换树脂分离纯化，洗脱曲线如图2所示，收集0.2M NaCl洗脱组分进行冻干后，分别测定胞外多糖DL-EPS单糖组成、分子量。
胞外多糖DL-EPS单糖测定方法如下：Thermo ICS5000离子色谱系统(ICS5000，Thermo Fisher Scientific，USA)，利用电化学检测器对混标和样本单糖组分进行分析检测。分别准确称取本项目所需标准品后，加入水配成10mg/mL标准溶液母液单标，然后取适量标准品母液单标混合配制成最高指标浓度为60μg/mL、50μg/mL或40μg/mL的标准品混标，根据以下浓度梯度配制成上机所需系列标准品。
表1.单糖混标梯度浓度信息
*标准品主要来自sigma公司
采用DionexTMCarboPacTMPA20(150*3.0mm，10μm)液相色谱柱；进样量为5μl。流动相A(H2O)，流动相B(0.1M NaOH)，流动相C(0.1M NaOH，0.2M NaAc)，流速0.5ml/min；柱温为30℃；洗脱梯度：0min A相/B相/C相(95：5：0，V/V)，26min A相/B相/C相(85：5：10，V/V)，42min A相/B相/C相(85：5：10，V/V)，42.1min A相/B相/C相(60：0：40，V/V)，52min A相/B相/C相(60：40：0，V/V)，52.1min A相/B相/C相(95：5：0，V/V)，60min A相/B相/C相(95：5：0，V/V)。
标准品测定结果如图3所示，13个标准品均为单峰。样本色谱图如图4所示，根据标准品保留时间和样本浓度的标准曲线进行计算，确定胞外多糖DL-EPS单糖组成为阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：核糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸：甘露糖醛酸：古罗糖醛酸＝0.51:1.47:1.8:73.98:4.67:9.96:0.94:2.33:1.35:1.32:1.67。
胞外多糖DL-EPS分子量测定方法如下：色谱系统采用的是凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统，液相系统为U3000(Thermo,USA)，示差检测器为Optilab T-rEX(Wyatttechnology，CA，USA)，激光光散射检测器为DAWN HELEOSⅡ(Wyatt technology，CA，USA)。采用凝胶排阻色谱柱(Ohpak SB-805HQ(300×8mm)，Ohpak SB-804HQ(300×8mm)和OhpakSB-803HQ(300×8mm)串联。柱温45℃，进样量100μL，流动相A(0.02％ NaN3，0.1M NaNO3)，流速0.4mL/min，洗脱梯度：等度，100min。结果如图5所示，胞外多糖DL-EPS样品保留时间为63.5min，根据马克-霍温克方程进行计算，胞外多糖DL-EPS重均分子量为3500Da，检测为单峰，确定为胞外多糖DL-EPS纯品。
实施例3粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS细胞毒性评价。
将HaCaT细胞以1×105细胞/孔接种于96孔板3h后，用并用终浓度1×103-1×106cfu/mL不同浓度的粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1和0.06-4.5mg/mL不同浓度的胞外多糖DL-EPS处理，以添加空细胞培养基为对照，在5％ CO2培养箱孵育24h。向板的每个孔中加入10μL CCK8溶液，将培养板在培养箱中孵育1-4小时后使用酶标仪(Agilent BioTek，SYNERGY/H1)测量450nm处的吸光度。结果如图6所示，1×103-1×106cfu/mL粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1和0.06-4.5mg/mL胞外多糖DL-EPS对HaCaT细胞活力无显著影响，说明粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖DL-EPS在该浓度范围是安全的。
实施例4粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS对50mJ/cm2UVB辐照诱导的HaCaT细胞活性氧的影响。
将HaCaT细胞铺在含2mL 10％FBS的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为3.5×105cell/well，培养3h后，加入以实施例2中得到的皮肤共生菌R.mucosa DL-1活菌制剂，分别为1×104CFU/mL和1×106CFU/mL，皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖DL-EPS浓度为0.5μg/mL和5μg/mL。共培养4h后利用50mJ/cm2 UVB辐照(Sigma辐照设备SS-07B(1201B)(280-320nm)根据Radiometer SOLAR辐照计，探头PMA2100进行校正)，处理24h测定活性氧。
活性氧测定测定方法利用1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA(SLOAR,CA1410)，使终浓度为10μmol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。在六孔板的一个孔加入1mL稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。利用荧光显微镜分析各组细胞内活性氧水平。结果如图7和图8所示，50mJ/cm2 UVB处理后HaCaT细胞活性氧迸发，粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂1×104CFU/mL和1×106CFU/mL及0.5μg/mL和5μg/mL胞外多糖DL-EPS对50mJ/cm2 UVB辐照诱导的HaCaT细胞活性氧有显著抑制作用，降低了UVB辐照导致的HaCaT细胞内氧化应激水平。
实施例5皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖DL-EPS对50mJ/cm2 UVB辐照诱导的HaCaT细胞主要炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α及IFN-β转录水平的影响。
将HaCaT细胞铺在含2mL 10％ FBS的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为3.5×105cell/well，培养12h后，加入实施例2中得到的皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖DL-EPS，浓度为0.5μg/mL和5μg/mL。共培养4h后利用50mJ/cm2 UVB辐照(Sigma辐照设备SS-07B(1201B)(280-320nm)根据Radiometer SOLAR辐照计，探头PMA2100进行校正)，辐照4h后再次加入等量胞外多糖DL-EPS处理过夜，UVB处理24h后收集细胞，采用TRIZOL试剂盒提取HaCaT细胞总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，利用SYBR Green试剂盒在ABI Prism 7900实时定量PCR仪上进行检测目标mRNA表达水平。以β-actin作为内参，目的基因的mRNA的相对表达量根据2－ΔΔCt计算。
如图9所示，50mJ/cm2 UVB辐照HaCaT细胞可以显著提高HaCaT细胞的IL-6、IL-1β、TNF-α及IFN-β转录水平。皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖DL-EPS浓度为为0.5μg/mL和5μg/mL均可以抑制UVB辐照诱导的炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α转录水平升高，并抑制UVB辐照导致的I型干扰素IFN-β的转录水平升高。
实施例6粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1胞外多糖DL-EPS对50mJ/cm2 UVB辐照诱导的HaCaT细胞凋亡的影响。
细胞试验设置如实施例4所示，分析50mJ/cm2 UVB处理24h后HaCaT细胞凋亡情况。采用细胞凋亡检测试剂盒(Biolegend,640914)根据推荐染色步骤进行处理后，通过流式细胞仪进行分析。如图10所示，50mJ/cm2 UVB辐照HaCaT细胞会引起细胞的大量凋亡，0.5μg/mL和5μg/mL DL-EPS均可以显著抑制UVB辐照导致的HaCaT凋亡。
实施例7粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS对430mJ/cm2UVB辐照诱导的C57BL/6小鼠背部肉眼皮损和镜下皮损病理的影响。
动物实验设计：采用C57BL/6J小鼠共28只，周龄为7周，随机均分为7组，所有组小鼠背部剃毛后24小时分别予以药物处理，七组分别为健康对照组(无处理，NC)，UVB造模组(UVB)，阳性对照组(氢化可的松50mg/4cm2/day，UVB+Hydr)，基质组(100％丙二醇，UVB+Vehicle)，高剂量组(1mg/4cm2/day，UVB+EPS-H)，低剂量组(0.5mg/4cm2/day，UVB+EPS-L)，活菌处理组(109cfu/4cm2/day，UVB+DL-1)，处理3天后利用UVB 430mJ/cm2照射背部，并继续给药观察至UVB照射48h。
统计分析方法：照光后48h牺牲小鼠，观察小鼠背部皮疹，实验结果如附图11所示。UVB造模组可引起皮肤红斑、水肿、渗出及结痂，形成弥漫性皮损，相较于基质组，阳性组氢化可的松可显著显著减轻UVB急性照射引起的皮肤红斑、水肿、渗出及结痂，试验组中0.5mg/4cm2/day DL-EPS和粘液玫瑰单胞菌DL-1活菌制剂处理小鼠可缓解UVB急性照射引起的皮肤红斑、水肿、渗出及结痂，仅见局灶性皮损，在UVB导致的皮肤疾病中有广阔应用前景。
实施例8粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS对430mJ/cm2UVB辐照诱导的C57BL/6小鼠背部皮损局部主要炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α转录的影响。
对实施例7中小鼠牺牲后取皮损，利用组织研磨仪进行重分研磨后，采用TRIZOL试剂盒提取HaCaT细胞总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，利用SYBR Green试剂盒在ABI Prism 7900实时定量PCR仪上进行检测目标mRNA表达水平。以β-actin作为内参，目的基因的mRNA的相对表达量根据2－ΔΔCt计算。
结果如图12所示，UVB急性照射可引起皮损处主要炎症因子IL-6和IL-1β转录水平的显著升高，与基质处理组相比，采用氢化可的松、高剂量DL-EPS、低剂量DL-EPS和粘液玫瑰单胞菌DL-1活菌制剂对小鼠进行处理均可抑制UVB急性照射引起的皮损局部主要炎症因子IL-6和IL-1β转录水平的升高，均有统计学差异，其中低剂量DL-EPS处理具有最显著的抑制UVB导致的急性炎症因子转录水平升高的效果。
实施例9粘液玫瑰单胞菌R.mucosa DL-1的活菌制剂及胞外多糖DL-EPS对430mJ/cm2UVB辐照诱导的C57BL/6小鼠背部皮损局部表皮角质形成细胞凋亡的影响。
小鼠皮肤组织的免疫荧光染色方法：
1)从-80℃冰箱取出已采取的小鼠背部皮损组织，利用OCT进行包埋，使用冰冻切片机将组织切成5mm的薄片；
2)将玻片放在湿盒中复温10min；
3)将组织切片放入PBS中并置于水平摇床，80rpm，每次5min，共3次；
4)甩片后用纸巾擦去组织周围PBS，免疫组化笔在组织周围画圈；
5)滴加快速免疫染色封闭液，室温孵育10min；
6)PBS洗2次，每次5min；
7)在组织表面滴加使用免疫染色一抗稀释液稀释的anti-pancytokeratin一抗(1:100稀释，abcam，货号ab8068)，湿盒内，4℃孵育过夜；
8)PBS洗3次，80rpm，每次5min；
9)在组织表面滴加使用二抗稀释液稀释的Alexa Fluor 488-conjugatedgoatant-rabbite二抗(1:200稀释，vector lab，货号DI-1488-1.5)，室温避光孵育60min；
10)PBS洗3次，80rpm，每次5min；
11)滴加propidium iodide(PI)/RNase staining solution(Cell SignalingTechnology,4087S)染色液于组织上，室温避光孵育15min；
12)PBS洗3次，80rpm，每次5min；
13)滴加两滴含DAPI封片剂于组织上，室温避光孵育后5min封片后荧光共聚焦显微镜下观察。
结果如图13所示，总剂量430mJ/cm2UVB辐照后，UVB模型和基质组菌均出现表皮角质形成细胞典型凋亡，阳性药氢化可的松处理和高剂量胞外多糖处理组均可显著缓解UVB诱导的角质形成细胞凋亡。低剂量胞外多糖和粘液玫瑰单胞菌DL-1活菌制剂处理组具有改善UVB诱导的角质形成细胞凋亡的趋势。
本发明提供一种皮肤共生菌粘液玫瑰单胞菌(Roseomonas mucosa)活菌制剂及其胞外多糖制备方法，并进一步提供了其在缓解UVB诱导急性皮肤损伤中的应用。即将R.mucosa活菌制剂和分离得到的胞外多糖处理UVB辐照后的HaCaT和UVB诱导的C57/BL6小鼠背部急性损伤，粘液玫瑰单胞菌DL-1及其胞外多糖对细胞模型和小鼠模型中对UVB引起的角质形成细胞凋亡具有保护效应，可抑制UVB诱导的皮损局部炎症因子的转录水平升高，降低受UVB辐照导致的HaCaT细胞凋亡。本发明可为其在拮抗光损伤的药物开发提供一定的科学依据。
Claims (10)
1.粘液玫瑰单胞菌活菌制剂在制备用于缓解UVB导致的皮肤损伤的药物中的应用，所述粘液玫瑰单胞菌活菌制剂通过如下方法制备得到：将粘液玫瑰单胞菌接种于R2A培养基中，25-37 ℃活化12-24 h，将活化的粘液玫瑰单胞菌转接于发酵培养基中，30-37 ℃培养24-36 h得到发酵液，将发酵液离心后将菌体重悬于给药溶剂后即得活菌制剂；
所述粘液玫瑰单胞菌分类号为粘液玫瑰单胞菌（Roseomonas mucosa），菌株号为DL-1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No. 25967。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述活菌制剂中粘液玫瑰单胞菌活菌数为1×106-1×109 CFU/mL。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌活菌制剂降低UVB照射导致的HaCaT细胞的氧化应激水平和细胞凋亡。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌活菌制剂改善UVB辐照诱导的C57BL/6小鼠背部皮肤红斑、水肿、渗出及结痂，抑制UVB辐照引起的背部皮损处的角质形成细胞凋亡，并降低皮损处炎症因子转录水平。
5.粘液玫瑰单胞菌胞外多糖在制备用于缓解UVB导致的皮肤损伤的药物中的应用，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖通过如下方法制备得到：将粘液玫瑰单胞菌接种于R2A培养基中，25-37 ℃活化12-24 h，将活化的粘液玫瑰单胞菌转接于发酵培养基中，30-37 ℃培养24-36 h得到发酵液，将发酵液经除菌、除蛋白、无水乙醇沉淀、DEAE离心交换树脂分离纯化得到胞外多糖；
所述粘液玫瑰单胞菌分类号为粘液玫瑰单胞菌（Roseomonas mucosa），菌株号为DL-1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No. 25967。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述胞外多糖的重均分子量为3000-3500Da。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述胞外多糖的单糖组成包括阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖降低UVB辐照导致的HaCaT细胞的氧化应激和凋亡，降低UVB辐照诱导的HaCaT细胞炎症因子的转录水平。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖抑制UVB辐照导致的I型干扰素IFN-β的转录水平升高。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖改善UVB辐照诱导的C57BL/6小鼠背部皮肤红斑、水肿、渗出及结痂，抑制UVB辐照引起的背部皮损处的角质形成细胞凋亡，并降低皮损处炎症因子转录水平。
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| CN202310555890.1A CN116617269A (zh) | 2023-05-17 | 2023-05-17 | 粘液玫瑰单胞菌活菌制剂及胞外多糖在制备用于缓解uvb导致的皮肤损伤的药物中的应用 |
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|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
| JP2021050289A (ja) * | 2019-09-26 | 2021-04-01 | 有限会社バイオメディカルリサーチグループ | 皮膚常在細菌ｌｐｓ及びその配合物 |
| WO2021138599A1 (en) * | 2020-01-03 | 2021-07-08 | Forte Subsidiary, Inc. | Cosmetic compositions |
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| CN116103205A (zh) * | 2023-03-10 | 2023-05-12 | 中国医学科学院皮肤病医院(中国医学科学院皮肤病研究所) | 一种粘液玫瑰单胞菌、菌剂和胞外多糖及其制备方法和应用 |
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2023
- 2023-05-17 CN CN202310555890.1A patent/CN116617269A/zh active Pending
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