CN116139163B - 一种粘液玫瑰单胞菌胞外多糖在制备用于缓解特应性皮炎的药物上的应用 - Google Patents

一种粘液玫瑰单胞菌胞外多糖在制备用于缓解特应性皮炎的药物上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种粘液玫瑰单胞菌胞外多糖在制备用于缓解特应性皮炎的药物上的应用，其中，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖通过将粘液玫瑰单胞菌的发酵液经除菌、除蛋白、无水乙醇沉淀、DEAE离子交换树脂分离纯化得到，所述粘液玫瑰单胞菌的分类命名为粘液玫瑰单胞菌（Roseomonas mucosa），菌株号为DL‑1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No.25967。研究结果表明，粘液玫瑰单胞菌DL‑1胞外多糖对TNF‑α和IFN‑γ诱导的HaCaT细胞的炎症因子转录水平的抑制作用，还进一步公开了粘液玫瑰单胞菌DL‑1胞外多糖对MC903诱导的BALB/c小鼠特应性皮炎缓解作用。

Description

一种粘液玫瑰单胞菌胞外多糖在制备用于缓解特应性皮炎的 药物上的应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种皮肤共生菌粘液玫瑰单胞菌胞外多糖在制备用于缓解特应性皮炎的药物上的应用。
背景技术
炎症是宿主对致炎因子刺激产生的一种防御性为主的免疫反应，体内多种细胞被招募到免疫微环境中，产生细胞因子消除外界因素的入侵，恢复机体健康，但持续存在的炎症会对机体器官以及全身反应产生损害，在很多复杂疾病的发生发展进程中扮演着重要角色。
巨噬细胞在调控宿主炎症反应变化的过程中扮演着重要角色。存在于源自病原体、受伤组织或适应性免疫的激活效应子的不同微环境中的信号，会在分化巨噬细胞中引发不同的遗传程序，从而诱导不同的功能极化状态。M1和M2是用于定义在体外激活为促炎(当与经典的IFN-γ和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS))或抗炎(当分别使用IL-4或IL-10激活)两种。M1极化的巨噬细胞对于在损伤后引发炎症反应至关重要，而切换到M2表型似乎对于消退炎症和损伤组织的再生至关重要。正常机体内的巨噬细胞经常维持一种稳态的平衡，然而当巨噬细胞极化失调则可能导致多种慢性炎症相关性疾病的发生发展，例如脓毒症、哮喘、动脉粥硬化及炎症性肠病等。因此，抑制持续的M1型巨噬细胞存在和促进M2型表型的表达可能在炎症相关疾病中获益，巨噬细胞的极化调控有望成为控制和治疗炎症性疾病的靶点。
特应性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一种以剧烈瘙痒和湿疹样皮疹为主要表现的慢性复发性炎症性皮肤病。遗传背景、皮肤屏障功能损伤、区域免疫异常、环境暴露等多因素共同参与AD的发病。近30年来AD患病率迅速增加，在发达国家影响了高达20％的儿童和10％的成年人。皮肤菌群失调或是AD发病的主要环境因素之一。皮肤菌群在皮肤屏障免疫调控中发挥重要作用，皮肤表面常驻菌如表皮葡萄球菌可通过产生抗微生物肽和具有活性的代谢产物等途径调节皮肤生理和健康。近年越来越多的研宄显示细菌代谢产物是菌群发挥生物学作用的重要组分。某些细菌胞外多糖可以阻止促炎细胞因子分泌，揭示了菌群调节免疫应答的新机制。
卡泊三醇(MC903)是一种人工合成维生素D3的类似物，广泛应用于治疗银屑病，并且能够抑制白血病细胞的增殖分化。近年来，局部应用MC903能引起小鼠特应性皮炎综合征，同时MC903能够通过上皮角质形成细胞维生素D受体引起的胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的高表达。TSLP是一种上皮细胞来源的细胞因子，在起始和促进Th2细胞介导的过敏性炎症中起关键作用。在AD的急性期，IL-4，IL-5和IL-10等Th2细胞因子过量表达，刺激IgE的高表达。同时，在AD的慢性期，Th1产生IFN-γ、IL-6和TNF-α高表达，而且TNF-α是众所周知的促炎细胞因子之一，其抑制被认为是预防过敏的可行策略。
多糖是由10个以上单糖以糖苷键形式结合而成的高分子碳水化合物，生物活性多糖具有免疫调节、抗肿瘤、降血糖、抗炎和调节肠道微环境等作用。通过开发并利用合适的生物活性多糖有望为特应性皮炎提供新的治疗方式。
发明内容
发明目的：本发明提供了粘液玫瑰单胞菌胞外多糖在制备用于治疗特应性皮炎的药物中的应用。
具体地，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖通过将粘液玫瑰单胞菌的发酵液经除菌、除蛋白、无水乙醇沉淀、DEAE离心交换树脂分离纯化得到，其分类命名为粘液玫瑰单胞菌(Roseomonas mucosa)，菌株号为DL-1，中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No.25967，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101。该菌株是发明人于2021年11月从健康人皮肤筛选得到的皮肤共生菌菌株。
其中，粘液玫瑰单胞菌的发酵液通过如下方法制备得到：将所述粘液玫瑰单胞菌接种于R2A培养基中25-37℃活化12-24h，将活化的粘液玫瑰单胞菌转接于发酵培养基中，30-37℃培养24-36h得到。
其中，R2A培养基组分为：酵母浸出粉0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酪蛋白水解物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，可溶性淀粉0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，无水硫酸镁0.024g/L，丙酮酸钠0.3g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2。
优选地，所述发酵培养基配方如下：碳源10-100g/L，氮源1-30g/L，无机盐0.01-50g/L，pH5.0-9.0，所述溶剂为水。
其中，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、木糖、果糖、乳酸、柠檬酸、甘油、淀粉和糖蜜中的任意一种几种的组合，优选为蔗糖、葡萄糖、乳糖、柠檬酸和淀粉中的任意一种或几种的组合；所述氮源为酵母浸粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合，优选为蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆、(NH4)2SO4、NH4Cl、(NH4)2HPO4和NH4NO3中的任意一种或几种的组合；所述无机盐为氯化钠、硫酸盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐和盐酸盐中的任意一种或几种的组合。
在一个优选的实施方式中，发酵培养基组分为胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH值7.3。
在一个具体的实施方式中，粘液玫瑰单胞菌胞外多糖通过如下方法制备得到：将粘液玫瑰单胞菌接种在200mL发酵培养基中32℃培养24h，通过3000-5000rpm离心10min除菌，加入1/2体积的sevage试剂除蛋白3次后，加入1倍体积无水乙醇后在4℃过夜得到胞外多糖粗糖沉淀，利用去离子水复溶后，通过DEAE-52分离纯化后进行冻干干燥得到粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖(R.mucosa DL-1EPS，简称为EPS)(后文R.mucosa DL-1EPS，R.mucosaDL-1胞外多糖具有相同含义)。
其中，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖的重均分子量为3000-3500Da，其单糖组成包括阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸和古罗糖醛酸。
具体地，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖的单糖组成为：阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：核糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸：甘露糖醛酸：古罗糖醛酸＝0.50～0.6:1.3～1.5:1.3～2:72-78:4-7:9-11:0.9-1.1:0.5-2.4:0.6-1.4:0.6-1.4:0.9-1.7。
在一个具体的实施方式中，所述R.mucosa DL-1胞外多糖分子量为3000Da，单糖组成为阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：核糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸：甘露糖醛酸：古罗糖醛酸＝0.51:1.47:1.8:73.98:4.67:9.96:0.94:2.33:1.35:1.32:1.67。
本申请研究结果表明，所述粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖调控脂多糖诱导的巨噬细胞Raw 264.7极化，抑制M1型巨噬细胞，促进M2表型的巨噬细胞。
在另一方面，所述粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖抑制脂多糖或脂多糖和IFN-γ诱导的巨噬细胞Raw 264.7分泌炎症因子。
本发明进一步提供了R.mucosa DL-1胞外多糖EPS在缓解特应性皮炎细胞模型中的作用。
优选地，在体外实验中，利用10ng/mL TNF-α和10ng/mL IFN-γ诱导HaCaT细胞形成AD细胞模型，所述粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可以抑制10ng/mL TNF-α和10ng/mLIFN-γ诱导HaCaT细胞的炎症因子转录水平的增加。
优选地，所述粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可以抑制10ng/mL TNF-α和10ng/mLIFN-γ诱导HaCaT细胞的TSLP，IL-33，TNF-α,IL-6和IL-1β转录水平升高。
本发明进一步提供了R.mucosa DL-1胞外多糖EPS在缓解特应性皮炎动物模型中的作用。
具体地，于各组BALB/c小鼠左耳分别涂布1nmol MC903，连续诱导15天。同时，试验分为对照组、基质组、糠酸莫米松组、高剂量多糖和低剂量多糖组，上午给药，下午造模，连续15天后牺牲小鼠，观察药效。
优选地，粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可以缓解MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠皮损，包括耳部肿胀和鳞屑。
优选地，粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可以缓解MC903诱导的BALB/c小鼠耳厚增加。
优选地，粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可以缓解MC903诱导的BALB/c小鼠肥大细胞浸润。
优选地，粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可以抑制MC903诱导的BALB/c小鼠皮损中IL-6、IL-1β、TNF-α、TSLP和IL-33等炎症因子转录水平的升高。
优选地，粘液玫瑰单胞菌胞外多糖可以抑制MC903诱导的BALB/c小鼠皮损处丝聚蛋白含量的降低。
有益效果：(1)本发明获得了从健康人中筛选出皮肤共生粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖的制备和纯化方法；(2)粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可以抑制10ng/mL TNF-α和10ng/mL IFN-γ诱导HaCaT细胞的炎症因子分泌；(3)粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可以抑制10ng/mL TNF-α和10ng/mL IFN-γ诱导HaCaT细胞的TSLP，IL-33，TNF-α,IL-6和IL-1β分泌；(4)粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可以缓解MC903诱导BALB/c小鼠的特应性皮炎皮损。
附图说明
图1为粘液玫瑰单胞菌生物学特征；A：菌落形态，B革兰氏染色，C：扫描电子显微照片，D：16S rRNA序列的系统发育树分析；
图2为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS洗脱曲线；
图3为标准样品离子色谱图；
图4为胞外多糖EPS样品离子色谱图；
图5为胞外多糖EPS样品散射光谱图；
图6为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对Raw 264.7细胞毒性作用；
图7为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对脂多糖诱导的Raw 264.7细胞炎症因子转录水平的影响；图A-B为脂多糖处理4h，图C-D为脂多糖处理24h；
图8为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对脂多糖诱导的Raw 264.7细胞极化的影响；
图9为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对脂多糖和IFN-γ诱导的Raw 264.7细胞炎症因子转录水平的影响；
图10为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对HaCaT细胞活力的影响；
图11为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对TNF-α和IFN-γ诱导的HaCaT炎症因子转录水平的影响；
图12为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对MC903诱导的BALB/c小鼠特应性皮炎皮损的影响；
图13为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎病例分析；
图14为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠耳厚的影响；
图15为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠皮损处肥大细胞浸润的影响；
图16为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠皮损处肥大细胞浸润统计分析；
图17为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠皮损处炎症因子转录水平的影响；
图18为粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠皮损处丝聚蛋白含量的影响(蓝色：DAPI，红色：丝聚蛋白)；
具体实施方式
实施例1粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖的制备。
1)粘液玫瑰单胞菌DL-1的培养
将4℃斜面保存的粘液玫瑰单胞菌DL-1活化，接种于种子培养基(即活化培养基)上，活化温度为32℃，活化时间为16h。将种子发酵液10％接种于发酵培养基中，转速为200rpm，32℃培养24h得发酵液，发酵液活菌数量可达到5×109CFU/mL以上。
所述活化培养基为R2A培养基，培养基组分为：酵母浸出粉0.5g/L，蛋白胨0.5g/L，酪蛋白水解物0.5g/L，葡萄糖0.5g/L，可溶性淀粉0.5g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，无水硫酸镁0.024g/L，丙酮酸钠0.3g/L，琼脂15.0g/L，pH值7.2。所述发酵培养基组分为胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH值7.3。
其中，粘液玫瑰单胞菌DL-1是发明人从健康人皮肤筛选得到的皮肤共生菌。粘液玫瑰单胞菌DL-1具有下述性质：
菌落形态学特征
在R2A培养基32℃培养16-24h后显微镜观察到菌落为单菌落，形态如图1A所示。对其进行革兰氏染色，结果如图1B所示，球杆状，属于革兰氏阴性菌，通过电镜扫描，形态如图1C所示，可见分泌大量生物膜，具有鞭毛能够运动。在上述培养基中32℃培养12h菌体可以大量生长，产红色色素，形态呈粘液状，且单个、成对或短链状排列。其生长的温度范围是5-40℃，最适温度为30-35℃，生长的pH范围是5.0-9.5，最适pH为6.5-7.5。能在LB、R2A、TSB、BAB等培养基中正常生长。
16S rDNA序列分析
16S rDNA序列长度1464bp。将16S rDNA序列和GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树如图1D所示。结果表明：菌株DL-1与粘液玫瑰单胞菌相似性达到99.86％。所以认定本发明的菌株为粘液玫瑰单胞菌(Roseomonasmucosa)，该分类为红螺菌目，醋杆菌科，菌株号为DL-1，并保藏在中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC 25967。
2)粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖的制备
将上述得到的发酵液离心(3000-4000rpm,10min)除菌，将1倍体积的发酵液加入2倍体积的sevag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)中，重复2-3次以去除蛋白，然后加入1倍体积无水乙醇，在4℃过夜离心(3000-4000rpm,10min)得到胞外多糖粗品沉淀，晾干后，利用去离子水复溶。利用硫酸-苯酚法测定约5-6g胞外多糖粗品进行DEAE离心交换树脂分离纯化，洗脱曲线如图2所示，收集0.2M NaCl洗脱组分进行冻干后，分别测定胞外多糖EPS单糖组成、分子量。
胞外多糖EPS单糖测定方法如下：Thermo ICS5000离子色谱系统(ICS5000，ThermoFisher Scientific，USA)，利用电化学检测器对混标和样本单糖组分进行分析检测。分别准确称取本项目所需标准品后，加入水配成10mg/mL标准溶液母液单标，然后取适量标准品母液单标混合配制成最高指标浓度为60μg/mL、50μg/mL或40μg/mL的标准品混标，根据以下浓度梯度配制成上机所需系列标准品。
表1.单糖混标梯度浓度信息
*标准品主要来自sigma公司
采用DionexTMCarboPacTMPA20(150*3.0mm，10μm)液相色谱柱；进样量为5μl。流动相A(H2O)，流动相B(0.1M NaOH)，流动相C(0.1M NaOH，0.2M NaAc)，流速0.5ml/min；柱温为30℃；洗脱梯度：0min A相/B相/C相(95：5：0，V/V)，26min A相/B相/C相(85：5：10，V/V)，42min A相/B相/C相(85：5：10，V/V)，42.1min A相/B相/C相(60：0：40，V/V)，52min A相/B相/C相(60：40：0，V/V)，52.1min A相/B相/C相(95：5：0，V/V)，60min A相/B相/C相(95：5：0，V/V)。
标准品测定结果如图2所示，13个标准品均为单峰。样本色谱图如图3所示，根据标准品保留时间和样本浓度的标准曲线进行计算，确定胞外多糖EPS单糖组成为阿拉伯糖：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：核糖：半乳糖醛酸：葡萄糖醛酸：甘露糖醛酸：古罗糖醛酸＝0.51:1.47:1.8:73.98:4.67:9.96:0.94:2.33:1.35:1.32:1.67。
胞外多糖EPS分子量测定方法如下：色谱系统采用的是凝胶色谱-示差-多角度激光光散射系统，液相系统为U3000(Thermo,USA)，示差检测器为Optilab T-rEX(Wyatttechnology，CA，USA)，激光光散射检测器为DAWN HELEOSⅡ(Wyatt technology，CA，USA)。采用凝胶排阻色谱柱(Ohpak SB-805HQ(300×8mm)，Ohpak SB-804HQ(300×8mm)和OhpakSB-803HQ(300×8mm)串联。柱温45℃，进样量100μL，流动相A(0.02％ NaN3，0.1M NaNO3)，流速0.4mL/min，洗脱梯度：等度，100min。结果如图5所示，胞外多糖EPS样品保留时间为63.5min，根据马克-霍温克方程进行计算，胞外多糖EPS重均分子量为3000Da，检测为单峰，确定为胞外多糖EPS纯品。
实施例2粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对Raw 264.7细胞的毒性评价。
将Raw 264.7细胞以1×104细胞/孔接种于96孔板4h后，用并用终浓度0.4-12.8g/L胞外多糖EPS处理，以添加无菌水为对照，在5％ CO2培养箱孵育24h。向板的每个孔中加入10μL CCK8溶液，将培养板在培养箱中孵育1-4小时后使用酶标仪(Agilent BioTek，SYNERGY/H1)测量450nm处的吸光度。结果如图6所示，0.4-12.8g/L粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对Raw 264.7细胞活力无显著影响，说明粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS在该浓度范围是安全的。
实施例3粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对脂多糖诱导巨噬细胞Raw 264.7炎症因子转录水平的影响。
脂多糖(LPS)刺激4h：将Raw 264.7细胞铺在含2mL含有10％FBS和的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为1×105cell/well，过夜培养后在四个孔中加入实施例1中得到的皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS浓度为0.75mg/mL、1.5mg/mL、3mg/mL和6mg/mL。R.mucosa DL-1胞外多糖EPS预处理4h后在同一孔内加入100ng/mL脂多糖(MCE,HY-D1056)刺激，模型组只加入脂多糖刺激，刺激4h和24h后收细胞。
脂多糖(LPS)刺激24h：将Raw 264.7细胞铺在含2mL含有10％FBS和的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为1×105cell/well，过夜培养后在四个孔中加入实施例1中得到的皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS浓度为0.5mg/mL、1.5mg/mL。R.mucosaDL-1胞外多糖EPS预处理4h后在同一个孔中加入100ng/mL脂多糖(MCE,HY-D1056)刺激，模型组只加入脂多糖刺激，刺激4h后再加入同等量胞外多糖处理，共计脂多糖刺激24h后收细胞。
将上述收集的细胞采用TRIZOL试剂盒提取Raw264.7细胞总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，利用SYBR Green试剂盒在ABI Prism 7900实时定量PCR仪上进行检测目标mRNA表达水平。以β-actin作为内参，目的基因的mRNA的相对表达量根据2－ΔΔCt计算。
如图7A-B所示，脂多糖刺激4h诱导Raw 264.7细胞中炎症因子IL-1β转录水平提高3000多倍，TNF-α转录水平的提高12倍，利用0.75mg/mL、1.5mg/mL、3mg/mL和6mg/mL皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS处理均可显著抑制脂多糖刺激4h诱导的Raw 264.7细胞中炎症因子IL-1β和TNF-α转录水平升高，均有统计学意义。如图7C-D所示，脂多糖刺激24h诱导Raw 264.7细胞中炎症因子IL-1β和TNF-α转录水平升高，利用0.5mg/mL和1.5mg/mL皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS处理均可抑制脂多糖刺激24h诱导的Raw 264.7细胞中炎症因子IL-1β中和TNF-α症转录水平升高，其中1.5mg/mL皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS处理组有统计学意义。
收集脂多糖(LPS)刺激24h后的Raw 264.7细胞进行流式染色，方法如下：
(1)收集细胞4℃400g离心5min，弃上清，1mL 1×PBS重悬细胞，加入1uL FixableViability Stain BV510死活染料,在室温避光孵育15min。
(2)4℃400g离心5min，弃上清，各加入0.5uL Fc block涡旋，4℃孵育10min。
(3)将6uL CD 86(Biolegend，货号105032)和6uL CD 206(Invitrogen，货号2175437)加入610μL 1×PBS中混匀后，每个样本加入100μL，涡旋，4℃孵育25min。
(4)500g离心5min弃上清，加入1mL PBS，70μm细胞滤网过滤，转移至流式管，4℃500g离心5min，弃上清，200μLPBS涡旋上机。
利用Flowjo进行流式分析，结果如图8所示，脂多糖刺激24h会显著诱导Raw 264.7细胞向M1极化，0.5mg/mL和1.5mg/mL皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS处理均可显著抑制Raw 264.7细胞向M1极化，促进Raw 264.7细胞向M2极化，因此皮肤共生菌R.mucosaDL-1胞外多糖EPS具有在抗炎方面的应用前景。
实施例4粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对脂多糖和IFN-γ诱导巨噬细胞Raw264.7炎症因子转录水平的影响。
脂多糖和IFN-γ刺激24h：将Raw 264.7细胞铺在含2mL含有10％FBS和的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为1×105cell/well，过夜培养后在四个孔中加入实施例1中得到的皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS浓度为0.5mg/mL和1.5mg/mL。R.mucosaDL-1胞外多糖EPS预处理4h后在同一个孔中加入10ng/mL脂多糖(MCE,HY-D1056)和10ng/mLIFN-γ(ABclonal，RP01070)刺激，模型组只加入脂多糖和IFN-γ刺激，刺激4h后再加入同等量胞外多糖处理，共计脂多糖和IFN-γ刺激24h后收细胞。细胞RNA和RT-PCR操作同实施例3。
如图9所示，10ng/mL脂多糖和10ng/mL IFN-γ共同刺激24h诱导Raw 264.7细胞中炎症因子IL-1β转录水平提高300多倍，利用0.5mg/mL和1.5mg/mL皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS处理均可抑制脂多糖和IFN-γ诱导的Raw 264.7细胞中炎症因子IL-6、IL-1β、INOS和TNF-α转录水平升高，其中1.5mg/mL皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS处理组效果更佳，均有统计学意义。且利用1.5mg/mL皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS处理可显著增加Raw 264.7细胞中IL-10转录水平升高，因此皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS具有在抗炎、抗感染等方面的应用前景。
实施例5粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对HaCaT细胞的毒性评价。
将HaCaT细胞以1×104细胞/孔接种于96孔板4h后，用并用终浓度0.06-4.5mg/mL胞外多糖EPS处理，以添加无菌水为对照，在5％ CO2培养箱孵育24h。向板的每个孔中加入10μL CCK8溶液，将培养板在培养箱中孵育1-4小时后使用酶标仪(Agilent BioTek，SYNERGY/H1)测量450nm处的吸光度。结果如图10所示，0.06-1.5mg/mL粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS对HaCaT细胞活力无显著影响，说明粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖EPS在该浓度范围是安全的。
实施例6粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对TNF-α和IFN-γ诱导的HaCaT炎症因子转录水平的影响。
TNF-α和IFN-γ刺激24h：将HaCaT细胞铺在含2mL含有10％FBS和的DMEM培养基的六孔培养板中，其中细胞浓度为1×105cell/well，过夜培养后在四个孔中加入实施例1中得到的皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS浓度为0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL和500μg/mL。R.mucosa DL-1胞外多糖EPS预处理4h后在同一孔内各加入10ng/mL TNF-α和10ng/mLIFN-γ刺激，模型组只加入TNF-α和IFN-γ刺激，刺激24h后收细胞。
将上述收集的细胞采用TRIZOL试剂盒提取HaCaT细胞总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，利用SYBR Green试剂盒在ABI Prism 7900实时定量PCR仪上进行检测目标mRNA表达水平。以β-actin作为内参，目的基因的mRNA的相对表达量根据2－ΔΔCt计算。
如图11所示，TNF-α和IFN-γ刺激24h诱导HaCaT细胞中炎症因子IL-6转录水平提高4000多倍，IL-1β转录水平提高2倍，TNF-α转录水平的提高170余倍，TSLP提高50余倍，IL-33提高60余倍，诱导了典型的AD细胞模型特征。利用0.5μg/mL、5μg/mL、50μg/mL和500μg/mL皮肤共生菌粘玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖处理均可显著抑制TNF-α和IFN-γ刺激24h诱导的HaCaT细胞中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、TSLP和IL-33转录水平升高，均有统计学意义，其中50μg/mL和500μg/mL皮肤共生菌R.mucosa DL-1胞外多糖EPS处理组更佳。
实施例7粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠皮损的影响。
饲养环境：SPF级，小鼠：BALB/c雌性小鼠，8周龄；造模方法：(1)将购买的大小均一的8周龄BALB/c雌性小鼠稳定饲养一周后每天每只小鼠耳朵均匀涂抹1nmol MC903。实验设置5种处理方式，每个处理方式设4个生物学重复，24只小鼠。给药处理统一为造模当天，局部给药，每天上午给药，下午造模，处理方式如下：
处理1(HC)，不处理，即为健康对照组；
处理2(AD)，MC903造模，即为AD模型组；
处理3(MF)，自MC903造模起其给予局部外用糠酸莫米松(Mometasone furoate)，即为阳性对照组；
处理4(Vehicle)，自MC903造模起其给予局部外用60％丙二醇，即为基质组。
处理5(EPS-H)，自MC903造模起其给予局部外用粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖40mg/cm2，即为高剂量多糖组。
处理6(EPS-L)，自MC903造模起其给予局部外用粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖40mg/cm2，即为低剂量多糖组。
6种处理的其他日常管理均保持一致。在试验结束后，牺牲小鼠采取组织样本，并对小鼠皮损和病理HE染色分析。如图12所示，与健康小组相比，MC903诱导典型的AD皮损，表现为小鼠耳厚增加、红斑、鳞屑。与AD模型小鼠相比，粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖高剂量组和低剂量组均对红斑、鳞屑有改善，其中低剂量组缓解效果更显著。阳性对照组糠酸莫米松疗效非常显著，但是长时间的激素处理，出现在皮肤萎缩的副作用。病理分析如图13所示，MC903可诱导小鼠耳朵的表皮和真皮肿胀，炎症细胞浸润严重，与基质处理组相比，高低剂量EPS-H处理组均可以改善小鼠耳朵的肿胀和炎症细胞浸润，其中低剂量处理组EPS-L效果更为显著。因此，粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对MC903诱导的小鼠AD样皮损有一定的缓解作用，有可能成为一种安全低毒的新疗法。
实施例8粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠耳厚和表皮增厚的影响。
MC903诱导15天后，利用游标卡尺测量实施例5中小鼠耳厚，每只小鼠测量3次取平均值，统计结果如图14A所示，与健康组相比，连续用MC903涂抹15天后，小鼠耳部显著增厚，糠酸莫米松可以显著抑制MC903诱导的耳部增厚。与基质组相比，粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可以缓解MC903诱导的小鼠耳部增厚，其中粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖低剂量处理组有统计学差异。根据实施例7中病理图片，利用Image J对表皮厚度进行统计分析，结果如图14B所示，与健康组相比，连续用MC903涂抹15天后，小鼠表皮显著增厚。与基质组相比，糠酸莫米松和胞外多糖EPS处理组均可以缓解MC903诱导的小鼠表皮增厚，均具有显著性差异，其中低剂量胞外多糖EPS-L处理组比高剂量胞外多糖EPS-H处理组平均表皮厚度更低。
实施例9粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠皮损处肥大细胞浸润的影响。
将实施例7中牺牲小鼠皮损组织通过石蜡包埋后切片，通过甲苯胺蓝进行肥大细胞染色，染色方法如下：(1)组织固定于中性甲醛液或甲醛乙醇液。(2)组织切片脱蜡。(3)放入甲苯胺蓝液(0.5g甲苯胺蓝用蒸馏水定容至100ml)染色30min。(4)稍水洗。(5)冰醋酸液(冰醋酸0.5ml用蒸馏水定容至100ml)分化,直到胞核和颗粒清晰(在显微镜下控制)。(6)稍水洗,用冷风吹干。(7)二甲苯或透明中性树胶封固。
通过统计分析结果如图15所示，肥大细胞颗粒呈红紫色，胞核蓝色。MC903处理可显著诱导小鼠真皮层肥大细胞浸润，与基质处理组相比，糠酸莫米松和胞外多糖EPS处理组均可以缓解MC903诱导的小鼠肥大细胞浸润。根据全片扫描后每个高倍镜下肥大细胞计数取平均值统计结果如图16所示，糠酸莫米松和胞外多糖EPS处理组均具有显著性差异，其中低剂量胞外多糖EPS-L处理组比高剂量胞外多糖EPS-H处理组效果更好。
实施例10粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠皮损处炎症因子转录水平的影响。
将实施7中五组(健康组、基质处理组、糠酸莫米松处理组和胞外多糖处理组)牺牲小鼠的皮损组织进行组织研磨后，采用TRIZOL试剂盒提取皮损组织总RNA。利用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA，利用SYBR Green试剂盒在ABI Prism 7900实时定量PCR仪上进行检测目标mRNA表达水平。以β-actin作为内参，目的基因的mRNA的相对表达量根据2－ΔΔCt计算。
结果如图17所示，MC903可诱导BALB/c小鼠耳部IL-6、IL-1β、TNF-α、TSLP和IL-33炎症因子转录水平显著性升高，与基质处理组相比，EPS和阳性药糠酸莫米松处理组都可以抑制MC903诱导的炎症因子水平的增高，根据统计分析，阳性药糠酸莫米松处理组对IL-1β、TNF-α和TSLP和的抑制有显著性差异，低剂量EPS-L对IL-1β和TNF-α炎症因子抑制有显著性差异，高剂量EPS-H对IL-6、IL-1β、TSLP和IL-33的抑制有显著性差异。
实施例11粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠皮损丝聚蛋白含量的影响。
取实施7中五组(模型组、基质处理组、糠酸莫米松处理组和胞外多糖处理组)牺牲小鼠的皮损组织进行免疫荧光染色，方法如下：
1)从-80℃冰箱取出已采取的小鼠背部皮损组织，利用OCT进行包埋，使用冰冻切片机将组织切成5mm的薄片。
2)将玻片放在湿盒中复温10min。
3)将组织切片放入PBS中并置于水平摇床，80rpm，每次5min，共3次。
4)甩片后用纸巾擦去组织周围PBS，免疫组化笔在组织周围画圈。
5)滴加快速免疫染色封闭液，室温孵育10min。
6)PBS洗2次，每次5min。
7)在组织表面滴加使用免疫染色一抗稀释液稀释的FLG Rabbit pAb一抗(1:1000稀释，Abclonal，货号A20011)，湿盒内，4℃孵育过夜。
8)PBS洗3次，80rpm，每次5min。
9)在组织表面滴加使用二抗稀释液稀释的IgG-Alexa Fluor 594二抗(1:200稀释，Absin，货号abs20021)，室温避光孵育60min。10)PBS洗3次，80rpm，每次5min。
11)滴加两滴含DAPI封片剂于组织上，室温避光孵育后5min封片后荧光共聚焦显微镜下观察。
MC903可诱导BALB/c小鼠特应性皮炎样皮肤屏障功能损伤，丝聚蛋白是表皮的结构蛋白之一，在皮肤屏障中起关键作用。结果如图18所示，MC903可诱导BALB/c小鼠耳部丝聚蛋白含量显著降低，与基质处理组相比，EPS和阳性药糠酸莫米松处理组都可以抑制MC903诱导丝聚蛋白含量降低，其中高剂量胞外多糖处理组EPS-H和低剂量胞外多糖处理组EPS-L均有非常显著的效果，两组的丝聚蛋白染色荧光亮度非常高。
综上所述，本发明提供一种具有缓解特应性皮炎的皮肤共生菌粘液玫瑰单胞菌(Roseomonas mucosa)DL-1胞外多糖的制备方法及应用。粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖可抑制TNF-α和IFN-γ诱导的HaCaT细胞TSLP和IL-33等炎症因子转录水平的升高。通过MC903诱导的BALB/c特应性皮炎动物模型验证了粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖对特应性皮炎样小鼠耳缘增厚、炎症因子聚集和皮肤屏障损伤等的缓解作用，因此粘液玫瑰单胞菌DL-1胞外多糖在治疗特应性皮炎中有一定的应用前景。

Claims (9)

1.粘液玫瑰单胞菌胞外多糖在制备用于缓解特应性皮炎的药物上的应用，其中，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖通过将粘液玫瑰单胞菌的发酵液经除菌、除蛋白、无水乙醇沉淀、DEAE离心交换树脂分离纯化得到，所述粘液玫瑰单胞菌的分类命名为粘液玫瑰单胞菌（Roseomonas mucosa），菌株号为DL-1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2022年10月26日，保藏编号为CGMCC No. 25967，所述粘液玫瑰单胞菌的发酵液通过如下方法制备得到：将所述粘液玫瑰单胞菌接种于R2A培养基中25-37℃活化12-24 h，将活化的粘液玫瑰单胞菌转接于发酵培养基中，30-37℃培养24-36 h得到；所述发酵培养基组分为：胰蛋白胨17.0g/L，大豆蛋白胨3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，pH值7.3。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖的重均分子量为3000-3500Da。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖由阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、甘露糖醛酸和古罗糖醛酸组成。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖抑制TNF-α和IFN-γ诱导的HaCaT细胞炎症因子转录水平和炎症因子的分泌。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述炎症因子为IL-1β、TNF-α、IL-6、TSLP和IL-33中的任一种或几种的组合。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖缓解MC903诱导的BALB/c小鼠耳部肿胀、鳞屑、和小鼠耳部肥大细胞增多。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖缓解MC903诱导的BALB/c特应性皮炎小鼠耳厚增加和表皮增厚，缓解MC903诱导的小鼠肥大细胞浸润。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖抑制MC903诱导的BALB/c小鼠皮损处炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6、TSLP和IL-33中的一种或几种转录水平升高。
9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粘液玫瑰单胞菌胞外多糖抑制MC903诱导的BALB/c小鼠皮损处丝聚蛋白含量降低。
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