CN116904347A - 一种兼具抗炎、抗氧化功能的植物乳酸杆菌胞外多糖的制备方法及应用 - Google Patents
一种兼具抗炎、抗氧化功能的植物乳酸杆菌胞外多糖的制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116904347A CN116904347A CN202310663547.9A CN202310663547A CN116904347A CN 116904347 A CN116904347 A CN 116904347A CN 202310663547 A CN202310663547 A CN 202310663547A CN 116904347 A CN116904347 A CN 116904347A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactobacillus plantarum
- eps
- extracellular polysaccharide
- culture medium
- medium
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 title claims abstract description 104
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 title claims abstract description 104
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 title claims abstract description 104
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 59
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 title claims abstract description 59
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 title claims abstract description 58
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 27
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 27
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 8
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 56
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 41
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 36
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 16
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 13
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 13
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 claims description 10
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 7
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 6
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 6
- HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N dpph Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1[N]N(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 HHEAADYXPMHMCT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000007760 free radical scavenging Effects 0.000 claims description 6
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 6
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 claims description 6
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 claims description 6
- SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N L-rhamnopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-JFNONXLTSA-N 0.000 claims description 5
- PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N L-rhamnose Natural products CC(O)C(O)C(O)C(O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 5
- 229940040526 anhydrous sodium acetate Drugs 0.000 claims description 5
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 claims description 5
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 5
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 claims description 5
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 claims description 5
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 5
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 claims description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 4
- 230000002292 Radical scavenging effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 3
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 3
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 3
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 claims description 3
- 125000000311 mannosyl group Chemical group C1([C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 claims description 2
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 claims description 2
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 claims 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims 2
- 230000002180 anti-stress Effects 0.000 claims 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 claims 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims 1
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 22
- 230000004044 response Effects 0.000 abstract description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 6
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 abstract description 6
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 abstract description 4
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 abstract description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 abstract 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 abstract 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 36
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 29
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 16
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 13
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 12
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 11
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 11
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 9
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 9
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 9
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000013461 design Methods 0.000 description 8
- -1 DPPH free radical Chemical class 0.000 description 7
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 6
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 6
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 6
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 6
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 5
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 5
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003064 anti-oxidating effect Effects 0.000 description 4
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 4
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 4
- OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N phenol;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.OC1=CC=CC=C1 OQUKIQWCVTZJAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M potassium bromide Chemical compound [K+].[Br-] IOLCXVTUBQKXJR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N salicylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1O YGSDEFSMJLZEOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 2
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 2
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 2
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 2
- 238000002329 infrared spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N papa-hydroxy-benzoic acid Natural products OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000012599 radical scavenging assay Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 229960004889 salicylic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N D-galactopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-YMDCURPLSA-N 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N D-ribofuranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H]1O HMFHBZSHGGEWLO-SOOFDHNKSA-N 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 240000001973 Ficus microcarpa Species 0.000 description 1
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 1
- 241001449625 Lactobacillus plantarum 16 Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 1
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102100038280 Prostaglandin G/H synthase 2 Human genes 0.000 description 1
- 108050003267 Prostaglandin G/H synthase 2 Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N Ribose Natural products OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-LMVFSUKVSA-N 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N alpha-D-Furanose-Ribose Natural products OCC1OC(O)C(O)C1O HMFHBZSHGGEWLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N diphenyl-(2,4,6-trinitrophenyl)iminoazanium Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+](=O)[O-])=CC([N+]([O-])=O)=C1N=[N+](C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 MGJZITXUQXWAKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N edaravone Chemical compound O=C1CC(C)=NN1C1=CC=CC=C1 QELUYTUMUWHWMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 1
- 229940097043 glucuronic acid Drugs 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N hydroxyl Chemical compound [OH] TUJKJAMUKRIRHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012844 infrared spectroscopy analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000002356 laser light scattering Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021110 pickles Nutrition 0.000 description 1
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 1
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000004309 pyranyl group Chemical group O1C(C=CC=C1)* 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 235000019614 sour taste Nutrition 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000005491 wire drawing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
- 230000037303 wrinkles Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
- A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/0003—General processes for their isolation or fractionation, e.g. purification or extraction from biomass
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
- C12R2001/25—Lactobacillus plantarum
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种兼具抗炎、抗氧化功能的植物乳酸杆菌胞外多糖的制备方法及应用。在EPS制备上，本发明中通过离子交换层析、琼脂糖凝胶层析获得纯度较高的中性EPS，并测定了EPS的分子量，单糖组成，官能团组成以及微观结构；在功能活性上，本发明中的EPS具有优秀的体外抗氧化活性、同时可以缓解LPS诱导的炎症反应，具有良好的抗炎作用；在EPS产量水平上，本发明通过单因素优化、响应曲面等方法优化了植物乳杆菌EPS的产量，提供了一套高产EPS的植物乳杆菌发酵培养基及发酵条件的配方，这也为其将来的生产奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种兼具抗炎、抗氧化功能的植物乳酸杆菌胞外多糖的制备方法及应用。
背景技术
乳酸菌是可使葡萄糖等糖类分解为乳酸的各种细菌的总称，属革兰氏阳性菌。乳酸菌作为一种公认的食品级安全产品，已经广泛应用于食品、医药、工业等相关领域。畜牧生产中，乳酸菌作为微生态制剂的常用菌株在生产中应用非常广泛，近年来随着我国饲料无抗、替抗的进程加快，乳酸菌等益生菌的研究也越来越受到关注。
胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞外的一类长链多糖。根据多糖存在的位置可以分为荚膜多糖和黏液多糖，而根据组成多糖的单糖种类又可以分为同型多糖和异型多糖。EPS作为一种天然的增稠剂，其在食品的加工和生产中应用十分广泛。而乳酸菌产EPS的能力十分出色，更因为其安全性被广泛的研究：乳酸菌的EPS除了可以被用作食品加工中的增稠剂，在抗氧化、抗肿瘤、降低胆固醇、增强免疫活性和改善肠道微生态环境等方面也有着重要作用。尤其是随着近些年大型分析仪器的发展和分子生物学的兴起，糖研究步入一个新的阶段。近年来关于多糖的活性和结构研究成为蛋白质和核酸之后生物化学的又一个巨大学术前沿领域。
在畜牧生产中，预防炎症疾病发生对于增强动物免疫力、提高生产力以及提高经济效益有着重要的意义。机体炎症的发生机理复杂，受到体内外多种因素的影响，乳酸菌所产的EPS作为一种潜在的抗氧化、抗炎大分子具有十分可观的应用前景，但乳酸菌的EPS目前在畜牧养殖中仍未得到推广，主要原因是目前报道的EPS功能活性并不强，大部分EPS功能单一且活性较弱，实际应用效果难以达到预期，因此开发一种具有高活性的乳酸菌EPS是其在畜牧领域应用的关键一环。
发明内容
本发明提供一种兼具抗炎、抗氧化功能的植物乳酸杆菌胞外多糖的制备方法及应用，用以解决现有技术中大部分EPS功能单一且活性较弱的缺陷，获得一种具有高产量、高活性的乳酸菌EPS。
为了实现本发明目的，本发明首先提供了一株乳酸杆菌，所述菌株为从泡菜中分离，经生物学性能和抗逆性比较得到的一株乳酸杆菌，该菌株的菌体呈短杆状，单个或成对、短链、偶见长丝状菌体；菌落表面呈圆形，乳白色，边缘整齐，表面光滑湿润无褶皱，质地均匀，不透明，隆起，拉丝后较为粘稠，能闻到明显的酸味。经革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性菌，并通过采用16S rRNA对该菌株进行鉴定，所得结果在NCBI数据库中进行BLAST比对，该菌株与植物乳杆菌16SrRNA的同源性为100％。结合以上鉴定结果，最终确定发菌株为植物乳杆菌，该菌株已于2023年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.26768，编号为R301，分类命名：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)。
本发明提供一种菌剂，包括所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)R301。
本发明提供一种组合物，包括所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)R301或所述菌剂。
本发明提供一种植物乳杆菌培养基，每100ml植物乳杆菌培养基中包括以下原料：1-8g葡萄糖，1-8g小肽，0.1-1g磷酸氢二钾，0.1-1g无水乙酸钠，0.1-1g柠檬酸三胺，0.01-0.5g七水合硫酸镁，0.01-0.5g无水硫酸锰和0.1-0.5ml Tween-80。
优选的，每100ml植物乳杆菌培养基中包括以下原料：1-4g葡萄糖，2-5g小肽，0.2-0.6g磷酸氢二钾，0.5-0.6g无水乙酸钠，0.2-0.4g柠檬酸三胺，0.01-0.05g七水合硫酸镁，0.04-0.1g无水硫酸锰和0.1-0.4ml Tween-80。
乳酸菌EPS产量普遍较低，对于养殖应用而言成本过高，本发明通过单因素优化、响应曲面优化将植物乳杆菌EPS的产量由初始的53.34mg/L提升至98.52mg/L，产量提升接近一倍。
优选的，所述植物乳杆菌培养基中余量为水。
优选的，所述植物乳杆菌培养基用于培养所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)R301。
本发明提供一种植物乳杆菌的培养方法，培养基初始pH值6.5-7.5，种子液接种量2％-7％(V/V)。
优选的，发酵温度22-37℃。
优选的，利用植物乳杆菌培养基进行发酵，每100ml植物乳杆菌培养基中包括0.01-0.05g七水合硫酸镁。
优选的，利用所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)R301和/或所述植物乳杆菌培养基。
本发明对植物乳杆菌的EPS产量水平进行了优化，主要采用单因素优化以及响应曲面优化的方法来提高EPS的产量，本发明优化得到了植物乳杆菌产EPS的培养基配方及最佳发酵条件：1-4g葡萄糖，2-5g小肽，0.2-0.6g磷酸氢二钾，0.5-0.6g无水乙酸钠，0.2-0.4g柠檬酸三胺，0.01-0.05g七水合硫酸镁，0.04-0.1g无水硫酸锰和0.1-0.4ml Tween-80,发酵温度20-35℃，培养基初始pH值6.5-7.5，种子液接种量2％-7％，最佳发酵条件下植物乳杆菌EPS的产量为98.52mg/L,与优化前相比EPS的产量提高了84.7％。
本发明提供一种胞外多糖的制备方法，包括利用所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)R301、所述菌剂、所述组合物、所述植物乳杆菌培养基、所述植物乳杆菌的培养方法中的一种或几种；
优选的，所述方法包括，培养植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)R301得到发酵液，从发酵液中提取胞外多糖。
优选的，得到发酵液后；对所述发酵液除菌体、乙醇沉淀、除蛋白、经离子交换柱、琼脂糖凝胶柱洗脱，得到胞外多糖，进一步优选得到分子量为3.1×106Da的胞外多糖；
所述胞外多糖的单糖组成为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，单糖组成的摩尔比例为5.7:35.8:27.5:15.8:15.2。
本发明提供一种胞外多糖，其由所述胞外多糖的制备方法制备而成。
本发明筛选得到的植物乳杆菌的EPS具有抗氧化功能：具体表现为体外抗氧化试验表明在4mg/mL、1mg/mL和2mg/mL时，EPS对DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的清除率均能达到100％，4mg/mL时还原力约为抗坏血酸的30％。
本发明筛选得到的植物乳杆菌的EPS具有抗炎功能：具体表现为20μg/mL的EPS即可缓解LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应，减少NO的产生，缓解NF-κB的应激反应，降低促炎因子IL-6的表达水平。
本发明筛选得到的植物乳杆菌可耐受低pH(pH＝3.0)、较高浓度的胆盐环境(0.1～0.3％)，能够在模拟消化道环境中生存，具有很强的消化道环境耐受性。
本发明提供所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)R301、所述菌剂、所述组合物、所述植物乳杆菌培养基、所述植物乳杆菌的培养方法中的一种或几种在制备胞外多糖中的应用。
本发明提供植物乳杆菌胞外多糖在抗氧、抗炎或抗逆中的应用；
优选的，所述植物乳杆菌胞外多糖为所述胞外多糖。
本发明提供植物乳杆菌胞外多糖在以下任一项中的应用：
1)ABTS自由基清除；
2)DPPH自由基清除；
3)羟基自由基清除；
4)减少NO的产生；
5)缓解NF-κB的应激反应；
6)降低促炎因子IL-6的表达水平；
优选的，所述植物乳杆菌胞外多糖为所述胞外多糖。
本发明解决了现有技术中EPS功能活性不够强、产量不够高这两方面的问题，在功能活性上，本发明中的EPS具有优秀的体外抗氧化活性、同时可以缓解LPS诱导的炎症反应，具有良好的抗炎作用，而在畜牧集约化养殖中，动物因氧化应激、炎症等问题造成的经济损失巨大，本发明的EPS抗氧化、抗炎功能正适于解决这一问题；在EPS产量水平上，本发明通过单因素优化、响应曲面等方法优化了植物乳杆菌EPS的产量，提供了一套高产EPS的植物乳杆菌发酵培养基及发酵条件的配方，这也为其将来的生产奠定了基础。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1最佳碳源种类优化图。
图2是本发明实施例1最佳碳源添加量优化图。
图3是本发明实施例1最佳氮源种类优化图。
图4是本发明实施例1最佳氮源添加量优化图。
图5是本发明实施例1Mn2+添加量优化图。
图6是本发明实施例1Mg2+添加量优化图。
图7是本发明实施例1接种量优化图。
图8是本发明实施例1发酵温度优化图。
图9是本发明实施例1培养基初始pH值优化图。
图10是本发明实施例1响应曲面优化各因素对EPS产量影响的等高线图和响应曲面图。
图11是本发明实施例1植物乳杆菌R301 EPS的离子交换柱纯化洗脱曲线。
图12是本发明实施例1植物乳杆菌R301 EPS的琼脂糖凝胶柱纯化洗脱曲线。
图13是本发明实施例1植物乳杆菌R301 EPS的分子量分布图。
图14是本发明实施例1植物乳杆菌R301 EPS的单糖组成高效液相色谱图。
图15是本发明实施例1植物乳杆菌R301 EPS的红外光谱图。
图16是本发明实施例1植物乳杆菌R301 EPS的扫描电镜图(A：300×，B：500×，C：1000×，D：10000×)。
图17是本发明实施例2植物乳杆菌R301 EPS抗氧化能力试验结果图；
注：图中A为ABTS自由基清除试验结果，图中B为DPPH自由基清除试验，图中C为羟基自由基清除试验，图中D为还原力试验，Vc为阳性对照。
图18是本发明实施例2植物乳杆菌EPS对IPEC-J2的细胞毒性图；
注：图中A为IPEC-J2细胞毒性试验结果，图中B为RAW 264.7细胞毒性试验结果；
数据用平均数±SD表示，a、b、c表示含不同上标字母的数据之间存在显著差异(P<0.05)。
图19是本发明实施例2植物乳杆菌EPS对LPS诱导的巨噬细胞炎症的缓解作用图；
图中A为NO水平，图中B-E分别为iNOS，NF-κB，COX-2以及IL-6的mRNA表达水平；
数据用平均数±SD表示，abc表示含不同上标字母的数据之间存在显著差异(P<0.05)。
图20是本发明实施例2植物乳杆菌抗逆性试验结果图；
注：图中A为胆盐耐受性结果，图中B为pH耐受结果，control组为MRS液体培养基，显著性分析结果为各组与control组比较；图中C为人工胃液存活试验，图中D为人工小肠液存活试验；
数据用平均数±SD表示，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中的“小肽”购自于北京澳龙港生物技术研究中心。
实施例1：
1.单因素优化
(1)最佳碳源筛选
选取五种碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖以及乳糖分别替代MRS培养基中的碳源，添加量均为2％(w/v)。挑取R301单菌落接种至种子液培养基培养12h，调整种子液600nm吸光光度值为5.0，以2％(v/v)的接种量接种至不同碳源的培养基中37℃静置培养24h，利用分光光度计测定菌液600nm吸光光度值，提取EPS并测定含量。每组做三个重复，种子液培养基为MRS液体培养基，EPS提取方法及含量测定参考以下操作：
1.将R301按3％(v/v)的种子液接种量接种至MRS改良培养基中，37℃培养24h；
2.发酵液100℃水浴10min；
3.取适量发酵液12000rpm离心2min去除菌体；
4.取上清加入80％(w/v)TCA溶液至终浓度为4％(w/v)，混匀后4℃静置6h，12000rpm离心20min保留上清；
5.上清加入3倍体积的无水乙醇混匀4℃静置过夜，12000rpm离心20min。弃上清，加入适量去离子水于50℃水浴复溶粗多糖；
6.使用分子截流量为8000～14000Da的透析袋透析24h，换三次水(分别隔3h，6h，12h)，EPS的含量测定采用苯酚硫酸法测定。
(2)碳源添加浓度优化
由前述试验得到最佳碳源，分别以质量浓度1％～8％的添加量替代MRS培养基中的碳源。挑取R301单菌落接种至种子液培养基中培养12h，以2％(w/v)的接种量接种至不同碳源浓度的培养基中37℃静置培养24h，利用分光光度计测定菌液在600nm处吸光光度值，提取EPS并测定含量。每组做三个重复，种子液培养基为MRS液体培养基，EPS提取方法及含量测定参考上述。
(3)最佳氮源筛选
选取8种氮源：小肽、牛肉膏、胰蛋白胨、乳清蛋白粉、氨水，尿素，硫酸铵以及硝酸铵分别替代MRS培养基中的氮源，添加量均为2.5％(w/v)。挑取R301单菌落接种至种子液培养基中培养12h，以2％(v/v)的接种量接种至不同氮源的培养基中37℃静置培养24h，利用分光光度计测定菌液在600nm处吸光光度值，提取EPS并测定含量。每组做三个重复，种子液培养基为MRS液体培养基，EPS提取方法及含量测定参考上述。
(4)氮源添加浓度优化
由前述试验得到最佳氮源，分别以质量浓度1％～8％的添加量替代MRS培养基中的氮源。挑取R301单菌落接种至种子液培养基中培养12h，以2％(v/v)的接种量接种至不同氮源浓度的培养基中37℃静置培养24h，利用分光光度计测定菌液在600nm处吸光光度值，提取EPS并测定含量。每组做三个重复，种子液培养基为MRS液体培养基，EPS提取方法及含量测定参考上述。
(5)Mn2+添加浓度优化
分别以质量浓度0～0.5％添加量的一水合硫酸锰替代MRS培养基中的一水合硫酸锰。挑取R301单菌落接种至种子液培养基中培养12h，以2％(v/v)的接种量接种至不同Mn2+浓度的培养基中37℃静置培养24h，利用分光光度计测定菌液在600nm处吸光光度值，提取EPS并测定含量。每组做三个重复，种子液培养基为MRS液体培养基，EPS提取方法及含量测定参考上述。
(6)Mg2+添加浓度优化
分别以质量浓度0～0.5％添加量的七水合硫酸镁替代MRS培养基中的七水合硫酸镁。挑取R301单菌落接种至种子液培养基中培养12h，以2％(v/v)的接种量接种至不同Mg2+浓度的培养基中37℃静置培养24h，利用分光光度计测定菌液在600nm处吸光光度值，提取EPS并测定含量。每组做三个重复，种子液培养基为MRS液体培养基，EPS提取方法及含量测定参考上述。
(7)种子液接种量优化
挑取R301单菌落接种至种子液培养基中培养12h，分别以体积比1％～8％的种子液接种MRS培养基中37℃静置培养24h，利用分光光度计测定菌液在600nm处吸光光度值，提取EPS并测定含量。每组做三个重复，种子液为MRS液体培养基，EPS提取方法及含量测定参考上述。
(8)培养温度优化
挑取R301单菌落接种至种子液培养基中培养12h，以2％(v/v)的接种量接种MRS培养基中分别于20℃～40℃静置培养24h，利用分光光度计测定菌液在600nm处吸光光度值，提取EPS并测定含量。每组做三个重复，种子液为MRS液体培养基，EPS提取方法及含量测定参考上述。
(9)培养基的初始pH值优化
分别调整培养基的pH值为5.5～8.0。挑取R301单菌落接种至种子液培养基中培养12h，以2％(v/v)的接种量接种MRS培养基中于37℃静置培养24h，利用分光光度计测定菌液在600nm处吸光光度值，提取EPS并测定含量。每组做三个重复，种子液为MRS液体培养基，EPS提取方法及含量测定参考上述。
2.响应曲面优化
(1)Plackett-Burman试验
使用Design-Expert 8.0设计Plackett-Burman试验，筛选影响因素包括：碳源浓度、氮源浓度、Mn2+浓度、Mg2+浓度、培养基的初始pH值、培养温度、种子液接种量。每种因素有两水平，以EPS产量为响应值，筛选影响EPS产量的显著因素。试验设计见表1。
表1Plackett-Burman试验设计表
(2)中心组合设计试验
根据Plackett-Burman试验结果，使用Design-Expert 8.0设计中心组合设计试验。以EPS产量为响应值，得出回归模型，确定R301生产EPS的最佳条件。试验设计见表2。
表2CCD试验设计
植物乳杆菌发酵产生EPS的优化结果如下：
Plackett-Burman试验结果及方差分析见表3、4：其中表4方差分析结果中模型P值为0.0232<0.05，差异显著，表明模型建立成功。R-square＝0.9370表明模型拟合良好。在所有的八个因素中E和G差异显著(P<0.05)，即培养基的初始pH值和种子液接种量为影响EPS产量的两个显著因素，此外选择C：Mg2+添加量作为第三种因素。因此最终选择培养基的初始pH值、种子液接种量以及Mg2+添加量作为响应曲面优化的因素。
依据Plackett-Burman试验结果设计CCD试验进一步优化EPS的产量，试验结果和方差分析见表5、6。利用Design-Expert 8.0对实验数据进行回归分析，得到EPS产生量(Y)对Mg2+添加量(A)、培养基的初始pH值(B)和种子液接种量(C)的二次多项回归方程模型：
Y＝-1412.15+13035.07A+354.50B+39.31C-828.11AB+15.34AC-2.50BC–351330A2–22.33B2–1.44C2
对上述回归模型的方差分析结果见表5：回归模型差异极显著(P<0.01)，一次项中种子液接种量表现显著(P<0.01)，二次项均表现显著(P<0.01)，回归模型R-square＝0.9288，接近1，说明该函数可以较好的模拟试验过程。失拟项不显著，表明该函数符合实际情况，可以用于预测和分析R301产EPS的产量。通过P值可知对EPS合成影响最大的因素为种子液接种量，其次为培养基的初始pH值，最次为Mg2+添加量，这也与Plackett-Burman试验结果相一致。
为分析各个交互项对EPS产量的影响，利用Design-Expert得到各个交互项的等高线图和3D响应曲面图(图10)，分别为A(图10中A)、B(图10中B)、C(图10中C)固定为零水平时另外两个因素对EPS产量的影响：当Mg2+添加量为0.01％(w/v)，种子液接种量固定不变时，EPS的产量随培养基的初始pH值的增大先升高后降低，但整体影响较小。当固定培养基的初始pH值不变时，EPS的产量随种子液接种量的增大而增大，达到一定值后增加速度变缓或不再增加(图10中A)；当培养基的初始pH值为7，种子液接种量固定不变时，EPS产量随Mg2+添加量的增大先升高后降低，但整体影响较小，当固定Mg2+添加量不变时，EPS产量随种子液接种量的增大而增大，达到一定值后增加速度变缓或不在增加(图10中B)；当种子液接种量为6％(v/v)时，无论固定培养基的初始pH值或者Mg2+添加量对EPS的产量均呈现先升高后降低，且整体影响较小(图10中C)。响应曲面存在着R301产EPS的最大值，预测的最佳条件为：Mg2+添加量为0.01％(w/v)，培养基的初始pH值为7.41，种子液接种量为6.4％(v/v)，预测EPS最大产量为97.85mg/L。
为验证响应曲面预测值是否符合实际，按照软件预测的最佳发酵条件进行三次平行试验，测得EPS的平均产量为98.52mg/L，与软件预测值相接近，即回归方程能够较好的反映R301实际EPS产量。
表3Plackett-Burman试验设计及结果
表4影响EPS产量因素的显著性分析
表5中心复合设计试验及结果
表6回归方程的方差分析
3.植物乳杆菌R301胞外多糖的分离与提取
种子培养基配方为(以100mL培养基计)：2g葡萄糖，0.5g酵母提取物，1g蛋白胨，1g牛肉膏，0.2g柠檬酸三胺，1mL的Tween-80，5mL的盐液甲(盐液甲由11.5g七水合硫酸镁和2.8g一水合硫酸锰定容至100mL并单独灭菌后无菌添加至灭菌的种子培养基)。
发酵培养基配方为(以100mL培养基计)：1-4g葡萄糖，2-5g小肽，0.2-0.6g磷酸氢二钾，0.5-0.6g无水乙酸钠，0.2-0.4g柠檬酸三胺，0.01-0.05g七水合硫酸镁，0.04-0.1g无水硫酸锰和0.1-0.4ml Tween-80,发酵温度20-35℃，培养基初始pH值6.5-7.5。
采用Sevag法去除蛋白质，Sevag试剂为氯仿：正丁醇(5:1)(体积比)。
胞外多糖分离与提取流程：
1.将R301按3％(v/v)的种子液接种量接种至MRS改良培养基中，37℃培养24h；
2.发酵液100℃水浴10min；
3.取适量发酵液12000rpm离心2min去除菌体；
4.取上清加入Sevag试剂(粗多糖液：Sevag试剂＝4:1，v/v)，室温下涡旋混匀10min，离心，保留水相，反复操作，直至蛋白完全除去，将粗提的EPS冻干备用；
5.上清加入3倍体积的无水乙醇混匀4℃静置过夜，12000rpm离心20min。弃上清，加入适量去离子水于50℃水浴复溶粗多糖；
6.使用分子截流量为8000～14000Da的透析袋透析24h，换三次水(分别隔3h，6h，12h)，EPS的含量测定采用苯酚硫酸法测定。
7.胞外多糖的纯化：
采用DEAE-52阴离子交换层析柱对上述得到的EPS进行纯化，分别使用不同浓度的氯化钠水溶液(0,0.3,0.6和0.9mol/L)洗脱150min(1mL/min)，收集洗脱出峰管的洗脱液，使用苯酚硫酸法检测OD490并绘制检测峰曲线。如图11所示，粗EPS主要成分在使用蒸馏水洗脱时已经出峰，而在NaCl浓度为0.3mol/L进行洗脱时得到了一个微弱的峰，以上信息可知植物乳杆菌的胞外多糖主要是以中性多糖的形式存在的，因此后续的纯化以及功能验证主要针对中性多糖。
采用Sephadex G-100琼脂糖凝胶层析柱对上述所得的中性胞外多糖初级纯品进行分离纯化，使用0.9％的氯化钠水溶液作为洗脱液，速度为0.5mL/min，收集出峰管的洗脱液，使用苯酚硫酸法检测OD490并绘制检测峰曲线。如图12所示，经过琼脂糖凝胶层析柱纯化得到了纯度较高的R301中性多糖。
分子量测定：
分别采用SB-806HQ和SB-804HQ柱的凝胶渗透色谱法测定EPS的分子重量，在25℃下使用激光散射检测和折射率检测器来检测EPS。然后将EPS溶液送入系统，并使用超纯水进行洗脱。图13为凝胶渗透色谱分析的EPS分子量分布图，结果表明EPS有一个单峰，表明EPS是均一的，R301的EPS分子量为3.1×106Da。
胞外多糖单糖组成分析(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖)：
标准品的配制：在离心管内加入甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖以及岩藻糖各100mg，使用去离子水定容至10mL得到10mg/mL的母液，使用时稀释至100μg/mL的工作液浓度。
样品前处理：前述得到的中性EPS称取样品5mg，加入三氟乙酸溶液，121℃加热2h，吹干后使用甲醇清洗以除去三氟乙酸，重复3次，加入蒸馏水复溶得到胞外多糖水解液。将水解液加入1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮及氢氧化钠在70℃衍生70min，加入盐酸中和，随后加入同体积氯仿进行萃取，重复3次后取水层转入色谱瓶待测。
HPLC条件分析:分离柱为Shim-pack GIST C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为乙腈－0.05mol/mL磷酸盐缓冲液(pH 6.8)(18∶82)，流速0.8mL/min，柱温30℃，紫外检测波长245nm，进样量20μL。图14为R301 EPS色谱图，结果表明R301 EPS主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖组成的杂多糖，单糖组成比例为5.7:35.8:27.5:15.8:15.2。
胞外多糖红外光谱分析：
采用溴化钾压片法，取10mg胞外多糖，加入100mg的溴化钾粉末，使用压片机制成均匀的薄片，采用傅里叶变换红外光谱仪(Bruker VERTEX33型)在4000-5000cm-1范围内扫描红外光谱并记录数据。由图15可知在3420cm-1处的峰值是羟基的伸缩振动，在2938和2888cm-1处的峰值为烷基中C-H键的伸缩振动峰，表明存在糖等有机物，在1644cm-1处的峰值是羰基的伸缩振动峰，表明存在甘露糖或半乳糖，在1454cm-1处的峰值是烷基的变角振动峰，1426cm-1处的峰可能归属于羧基中羰基的对称伸缩振动峰，1359cm-1处的峰值是属于烷基的面外摇摆峰，1265、1161、1129cm-1处的峰值都属于C-O-C的伸缩振动峰，1065cm-1处的峰值表明R301 EPS中可能存在吡喃环。
胞外多糖扫描电镜表观形态分析：取充分干燥的胞外多糖组分，取少量涂抹于导电胶上，喷金后采用扫描电镜观察其表面形态。电镜结果如图16所示，植物乳杆菌R301 EPS呈现片状结果，随着放大倍数的增加可以看到其表面有细小颗粒。
实施例2：
本发明还对植物乳杆菌产的EPS功能活性进行了鉴定，本发明中的植物乳杆菌EPS具有抗氧化、抗炎活性，同时该植物乳杆菌具有很强的抗逆性，具体鉴定过程如下：
1.植物乳杆菌EPS体外抗氧化试验
(1)ABTS自由基清除试验
取粗EPS配制成不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0mg/mL)的溶液1mL，7mM的ABTS和2.4mM的过硫酸钾等体积混合，室温避光反应16个小时，用于生成ABTS自由基。ABTS用PBS(pH＝7.4)稀释到734nm吸光光度值为0.7，然后将500μL的样品加到1mL的ABTS中避光反应10min，于734nm处测定吸光光度值。空白组以等体积无菌水代替ABTS自由基溶液，对照组以等体积无菌水代替EPS溶液，Vc做阳性对照。清除率计算公式：
清除率(％)＝[1-(A1-A)/A0]×100％
式中：A为空白组的吸光光度值；A0为对照组的吸光光度值；A1为样品组的吸光光度值。
(2)DPPH自由基清除试验
取粗EPS配制成不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0mg/mL)的溶液1mL，与2mL0.2mM的DPPH无水乙醇溶液混合均匀，室温下避光反应30min，于517nm处测定吸光光度值。空白组以等体积乙醇代替DPPH溶液，对照组以等体积无菌水代替EPS溶液，Vc做阳性对照。清除率计算公式:
清除率(％)＝[1-(A1-A)/A0]×100％。
式中：A为空白组的吸光光度值；0A0为对照组的吸光光度值；A1为样品组的吸光光度值。
3)羟基自由基清除试验
将1.5mL 1.8mM的水杨酸、2mL的1.8mM的硫酸亚铁、1mL 6mM的过氧化氢分别与1mL不同浓度的粗EPS(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0mg/mL)混合均匀，在37℃下反应30min，3000rpm离心5min，取上清于510nm处测定吸光光度值。空白组以等体积的无菌水代替水杨酸，对照组为以等体积的无菌水替代EPS溶液，Vc作为阳性对照。清除率计算公式：
清除率(％)＝[1-(A1-A)/A0]×100％。
式中：A为空白组的吸光光度值；A0为对照组的吸光光度值；A1为样品组的吸光光度值。
(4)还原力测定试验
取粗EPS配制成不同浓度(0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0mg/mL)的溶液1mL加入2.5mL的磷酸缓冲溶液(0.2M、pH＝6.6)和2.5mL质量分数1％的铁氰化钾，混合均匀于50℃反应20min。随后加入2.5mL的三氯乙酸(10％，w/v)3000rpm离心10min。取2.5mL的上清加入等体积的蒸馏水和0.5mL的FeCl3(0.1％，w/v)混合均匀室温放置10min。于700nm处测定吸光光度值。样品还原力与吸光光度值成正比。
2.植物乳杆菌EPS细胞毒性试验
(1)细胞复苏
液氮取出的细胞冻存管置于37℃水浴锅水浴2min，待细胞完全融化后将冻存管内容物转移至15mL离心管并加入完全培养基10mL混匀，1000rpm离心4min。弃上清，加入5mL的完全培养基，吹打均匀后转移至25T细胞培养瓶，37℃5％二氧化碳静置培养，12～24h换一次液。
(2)细胞传代
正常培养的细胞贴壁至80％左右开始传代，倒掉培养瓶中的培养液，加入PBS清洗细胞，然后加入适量胰酶轻轻摇晃，培养箱培养0.5～4min，期间通过显微镜观察细胞状态，待大部分细胞变圆后立即加入10mL完全培养基以中和胰酶，将细胞悬浮液转移至离心管1000rpm离心4min。弃上清，加入适量完全培养基吹打均匀转移至细胞培养瓶传代培养。
(3)粗EPS细胞毒性试验
细胞毒性试验采用CCK-8试剂盒进行测定，细胞复苏后进行传代培养，待细胞状态良好时进行CCK-8试验：
1.利用完全培养基将细胞稀释至3×105个/mL，按照每孔100μL接种至96孔细胞培养板培养，阴性对照孔仅加入100μL完全培养基。将96孔细胞培养板于37℃，5％二氧化碳培养12h；
2.利用完全培养基将粗EPS稀释至不同浓度：0、20、40、60、80、100、500、1000μg/mL；分别吸取100μL粗EPS稀释液加入96孔细胞培养板，37℃，5％二氧化碳培养箱培养24h；
3.向每孔加入10μL CCK-8试剂，将细胞培养板于37℃，5％二氧化碳培养箱避光孵育2～4h；
4.用酶标仪测定其在450nm处的吸光光度值。
细胞存活率＝[A(EPS)-A(空白)]/[A(对照)-A(空白)]×100％
A(EPS)：具有细胞、CCK-8溶液和EPS溶液的孔的吸光光度值
A(空白)：具有培养基和CCK-8溶液但没有细胞的孔的吸光光度值
A(对照)：具有细胞、CCK-8溶液但没有EPS溶液的孔的吸光光度值
3.植物乳杆菌EPS抗炎活性试验
将RAW 264.7以每孔3.0×105个细胞的密度播种到96孔板中，培养12小时，在每孔中加入不同浓度的EPS，再培养12小时，然后在每孔中加入终浓度为1μg/mL的LPS，再培养24小时。按上述方法构建LPS诱导的炎症巨噬细胞模型。用Griess试剂测定一氧化氮(NO)含量。
将RAW 264.7细胞以每孔2.0×106个细胞的密度播种到6孔板中，随后的步骤按上述方法进行。收集细胞，提取RNA。所有样品的RNA完整性通过琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop进行评估。将质量良好的RNA样品进行cDNA的反转录。qPCR使用引物见下表。本研究中使用了两步扩增法。95℃下30秒预孵化，40个循环，95℃下5秒变性，60℃下30秒延伸，然后1个循环，95℃下5秒，60℃下60秒，95℃下1秒熔解。基因表达与看家基因β-肌动蛋白的表达进行归一化，结果反映了相对于对照样本的倍数增加。
表7qPCR所使用的引物
3.R301消化道抗逆性试验
(1)胆盐耐受性试验
向MRS液体培养基中添加牛胆盐至指定浓度：0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L，将乳酸菌接种于含有不同浓度牛胆盐MRS培养基中培养12h后观察各组中菌株的生长情况，进行平板涂布计算活菌数量和存活率。
存活率＝A0/A1×100％
注：A0为lg(处理0h活菌数)，A1为lg(处理12h活菌数)
空白组为不添加牛胆盐的正常MRS液体培养基，每个处理组做三个重复。
(2)pH耐受性试验
使用1M HCl调节MRS液体培养基pH至指定值：1.0、2.0、3.0、4.0，将乳酸菌接种于不同pH值的MRS液体培养基中培养12h后观察各组中菌株的生长情况，进行平板涂布计算活菌数量和存活率。
存活率＝A0/A1×100％
注：A0为lg(处理0h活菌数)，A1为lg(处理12h活菌数)
空白组为自然pH值的MRS液体培养基，每个处理组做三个重复。
(3)模拟消化道存活试验
乳酸菌过夜培养后3000rpm离心10min弃上清，使用PBS清洗菌体两次，加入新鲜MRS培养基5mL和人工胃液5mL重悬菌体，200rpm 37℃摇床培养2h，分别于培养0h和2h取1mL菌液用于活菌计数；培养结束后3000rpm离心10min弃上清，使用PBS清洗菌体两次，加入新鲜MRS培养基5mL和人工小肠液5mL重悬菌体，200rpm 37℃摇床培养7h，分别于0h，2h，5h和7h取1mL菌液用于活菌计数。每个处理组做三个重复。
功能活性鉴定结果如下：植物乳杆菌的EPS具有很强的体外抗氧化能力，对ABTS自由基、DPPH自由基以及羟基自由基清除率达到100％，也具有一定的还原力。在0～100μg/mL浓度范围内，对正常细胞IPEC-J2和RAW 264.7均无损伤。并且EPS可以缓解由LPS引起的巨噬细胞炎症反应。此外还对R301进行模拟消化道抗逆性试验，结果表明R301可以很好地在人工消化液中存活，具有较强的消化道抗逆性。具体结果详见图17-20。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)R301，其特征在于，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.26768。
2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)R301。
3.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)R301或权利要求2所述菌剂。
4.一种植物乳杆菌培养基，其特征在于，每100ml植物乳杆菌培养基中包括以下原料：1-4g葡萄糖，1-4g小肽，0.2-0.6g磷酸氢二钾，0.5-0.6g无水乙酸钠，0.2-0.4g柠檬酸三胺，0.01-0.05g七水合硫酸镁，0.01-0.1g无水硫酸锰和0.1-0.5ml Tween-80；
优选的，余量为水；
优选的，所述植物乳杆菌培养基用于培养权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)R301。
5.一种植物乳杆菌的培养方法，其特征在于，培养基初始pH值6.5-7.5，种子液接种量2-7％(V/V)；
优选的，发酵温度20-35℃；
优选的，利用植物乳杆菌培养基进行发酵，每100ml植物乳杆菌培养基中包括0.01-0.05g七水合硫酸镁；
优选的，利用权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)R301和/或权利要求4所述植物乳杆菌培养基。
6.一种胞外多糖的制备方法，其特征在于，包括利用权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)R301、权利要求2所述菌剂、权利要求3所述组合物、权利要求4所述植物乳杆菌培养基、权利要求5所述植物乳杆菌的培养方法中的一种或几种得到发酵液，从发酵液中提取胞外多糖；
优选的，对所述发酵液除菌体、乙醇沉淀、除蛋白、经离子交换柱、琼脂糖凝胶柱洗脱，得到胞外多糖，进一步优选得到分子量为3.1×106Da的胞外多糖；
优选的，所述胞外多糖的单糖组成为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，单糖组成的摩尔比例为5.7:35.8:27.5:15.8:15.2。
7.一种胞外多糖，其特征在于，其由权利要求6所述胞外多糖的制备方法制备而成。
8.权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)R301、权利要求2所述菌剂、权利要求3所述组合物、权利要求4所述植物乳杆菌培养基、权利要求5所述植物乳杆菌的培养方法中的一种或几种在制备胞外多糖中的应用。
9.植物乳杆菌胞外多糖在抗氧、抗炎或抗逆中的应用；
优选的，所述植物乳杆菌胞外多糖为权利要求7所述胞外多糖。
10.植物乳杆菌胞外多糖在以下任一项中的应用：
1)ABTS自由基清除；
2)DPPH自由基清除；
3)羟基自由基清除；
4)减少NO的产生；
5)缓解NF-κB的应激反应；
6)降低促炎因子IL-6的表达水平；
优选的，所述植物乳杆菌胞外多糖为权利要求7所述胞外多糖。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310663547.9A CN116904347A (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 一种兼具抗炎、抗氧化功能的植物乳酸杆菌胞外多糖的制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310663547.9A CN116904347A (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 一种兼具抗炎、抗氧化功能的植物乳酸杆菌胞外多糖的制备方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116904347A true CN116904347A (zh) | 2023-10-20 |
Family
ID=88360998
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310663547.9A Pending CN116904347A (zh) | 2023-06-06 | 2023-06-06 | 一种兼具抗炎、抗氧化功能的植物乳酸杆菌胞外多糖的制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116904347A (zh) |
-
2023
- 2023-06-06 CN CN202310663547.9A patent/CN116904347A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pei et al. | Purification and structural characterization and antioxidant activity of levan from Bacillus megaterium PFY-147 | |
| CN105055440B (zh) | 寡聚透明质酸或者寡聚透明质酸盐的用途及其组合物 | |
| Ruas-Madiedo et al. | Invited review: methods for the screening, isolation, and characterization of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria | |
| Ren et al. | Bioactive exopolysaccharides from a S. thermophilus strain: Screening, purification and characterization | |
| Vijayendra et al. | Physico-chemical characterization of an exopolysaccharide produced by a non-ropy strain of Leuconostoc sp. CFR 2181 isolated from dahi, an Indian traditional lactic fermented milk product | |
| CN106635924B (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖的制备及用途 | |
| CN104672339B (zh) | 一种蝉花菌素及其制备和用途 | |
| CN107988115B (zh) | 植物乳杆菌及其复合益生菌发酵液与制备方法 | |
| Mukhopadhyay et al. | Isolation and characterization of extracellular polysaccharide Thelebolan produced by a newly isolated psychrophilic Antarctic fungus Thelebolus | |
| CN111100810B (zh) | 一株植物乳杆菌dnb1及其胞外多糖和应用 | |
| Tang et al. | Extraction, isolation, structural characterization and prebiotic activity of cell wall polysaccharide from Kluyveromyces marxianus | |
| CN112662717A (zh) | 一种鼠李糖乳杆菌胞外多糖及其制备方法与应用 | |
| Zhang et al. | Characterization and antioxidant activity of released exopolysaccharide from potential probiotic Leuconostoc mesenteroides LM187 | |
| CN113564069A (zh) | 一种长双歧杆菌、长双歧杆菌胞外多糖及其提取方法和应用 | |
| CN113621665B (zh) | 一种植物乳杆菌酸性胞外多糖及其应用 | |
| CN114196564B (zh) | 一株嗜盐四联球菌及其在生产抗癌胞外多糖中的应用 | |
| CN108330086A (zh) | 一种产胞外多糖空间植物乳杆菌ss18-33及其在提高生物抗氧化活性中的应用 | |
| CN117414319A (zh) | 一种经过植物乳杆菌发酵后的黑果腺肋花楸提取物纳米眼霜及制备方法 | |
| CN116904347A (zh) | 一种兼具抗炎、抗氧化功能的植物乳酸杆菌胞外多糖的制备方法及应用 | |
| CN114736835B (zh) | 副干酪乳杆菌菌株ss-01、用该菌株制备的胞外多糖、制备方法及应用 | |
| CN113698503B (zh) | 一种植物乳杆菌中性胞外多糖及其应用 | |
| LU500037B1 (en) | Fucosyl-disaccharide with Prebiotic Effect, Method for Preparing the Same and Application Thereof | |
| CN113861303A (zh) | 一种从德氏乳杆菌和嗜热链球菌发酵酸奶中分离出的胞外多糖及其应用 | |
| CN110305816B (zh) | 一种嗜热链球菌imau20756及其应用 | |
| CN109295127B (zh) | 一种具有氧压力排除效应的α-葡聚糖及其制备方法与应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |