CN116510756A - 一种高熵氟化物量子点纳米酶、制备方法及其生化检测应用 - Google Patents

一种高熵氟化物量子点纳米酶、制备方法及其生化检测应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高熵氟化物量子点纳米酶、制备方法及其生化检测应用。首先，基于气相冷冻法将原料雾化加热再喷射使反应物相遇来形成沉淀颗粒，颗粒落在超低温板上迅速冻结得到初始高熵氟化物纳米酶；其次，通过内爆法将初始高熵氟化物纳米酶量子点化；最后，通过表面催化中心嫁接法对其进行表面改性而得到最终高熵氟化物量子点纳米酶。本发明提供的制备方法适用于多种高熵氟化物量子点纳米酶的制备，该制备方法简单易行，制备出的纳米酶具有丰富的活性位点和良好的类过氧化物酶活性。实验结果表明，本发明制备的高熵氟化物量子点纳米酶具有优良的类过氧化物酶活性，在细菌等病原体检测领域拥有广阔的应用前景。

Description

一种高熵氟化物量子点纳米酶、制备方法及其生化检测应用
技术领域
本发明属于功能材料技术领域，涉及一种纳米酶，具体涉及一种高熵氟化物量子点纳米酶、制备方法及其生化检测应用。
背景技术
纳米酶是一类能够在温和或极端条件下催化酶的底物并遵循酶动力学(如米氏方程)将其转化为产物的纳米材料。由于其高催化性、高稳定性和低成本等优点，已被广泛应用于生物医学、食品安全、环境监测、细菌检测等领域。近年来，高熵材料(HEM)因其显着且常常出人意料的特性而受到越来越多的关注，并且已经发现了一整类具有未来应用潜力的材料。高熵氟化物纳米酶可用作天然纳米酶的替代品，但是传统方法制备出来的高熵氟化物的颗粒往往是不均匀的，且制备条件难以控制，这些制备缺点使得制备出来的高熵氟化物纳米酶的性能不够完善。经过量子点化和表面修饰后的高熵氟化物量子点纳米酶，拥有活性位点丰富、高酶活性的优点，有望广泛应用于生物医学检测等领域。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种高熵氟化物量子点纳米酶的制备方法，操作简单，成本低，产量高，速度快，可制备出多种类型、活性位点丰富的高熵氟化物量子点纳米酶。
本发明的目的之二是提供一种由上述制备方法制得的高熵氟化物量子点纳米酶。
本发明的目的之三是提供上述高熵氟化物量子点纳米酶的生化检测应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种高熵氟化物量子点纳米酶的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：首先配制CsF溶液，再将BiCl3、CrCl3、WCl2、BeCl2、SnCl2、VCl2中的五种物质混合后溶解在水中，加入内爆因子，得到五种物质的混合溶液，搭建一个简易小型内室Ⅰ，内室Ⅰ底部放置一块超低温板；
步骤2：将步骤1中CsF溶液和混合溶液分别装入喷雾枪中雾化加热，并喷射到小型内室Ⅰ中，两反应溶液在小型内室Ⅰ上方以气态接触并迅速生成沉淀颗粒，再落到内室Ⅰ下方的超低温板上冻结，反应结束后收集冻结的沉淀物，在室温下加入去离子水解冻后形成沉淀悬浮液，再将沉淀离心洗涤三次后，烘干，得到带有内爆因子的初始高熵氟化物纳米酶；
步骤3：基于内爆法将初始高熵氟化物纳米酶量子点化，即将初始高熵氟化物纳米酶放在小型内室Ⅱ中，循环射入一束强光，强光与内爆因子相互作用使得初始高熵氟化物纳米酶自行循环爆炸形成高熵氟化物量子点纳米酶；
步骤4：使用表面催化中心嫁接法对量子点纳米酶进行表面改性，即将金属有机物与纳米酶混合，使有机物与纳米酶表面的氟形成氢键，增加纳米酶活性位点。
优选的，所述步骤1中的CsF溶液和五种物质的混合溶液的浓度比是25：4～35：0.3。
优选的，所述步骤1中的超低温板温度范围应保持在-50℃～0℃，以实现沉淀颗粒的快速冻结过程。
优选的，所述步骤1中的内爆因子为锗/锡合金量子点。
优选的，所述步骤2中的CsF溶液和混合物溶液的喷雾枪的喷射速度范围分别为0.2～3mL min-1和0.1～1.5mL min-1。
优选的，所述步骤3中的强光为808nm激光(800mW·cm-2)，循环射入频率为5s～15s/次，内爆过程持续时间为5～15分钟。
优选的，所述步骤3中的高熵氟化物量子点纳米酶的平均直径为1～10nm。
优选的，所述步骤4中的金属有机物为二乙基氨基铁、二丁基羟基钴、二丙基氨基钪、二戊基氨基铟和二丁基氨基铋中的任意一种。
更优选的，所述步骤4中的金属有机物为二乙基氨基铁。
第二方面，本发明提供上述制备方法制得的高熵氟化物量子点纳米酶。
第三方面，本发明提供上述高熵氟化物量子点纳米酶在生化检测中的应用。
与现有技术相比，本发明提供的制备方法不仅简单方便，且制备出的高熵氟化物量子点纳米酶具有更丰富的活性位点，且具有更高的酶活性。实验表明，本发明制备出的高熵氟化物纳米酶具有的类过氧化物酶活性可以催化过氧化氢(H2O2)和3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)之间的氧化反应，加速产生氧化态TMB(ox-TMB)，使得反应体系从无色变成蓝色，并在652nm附近产生强烈的紫外吸收峰。基于环介导等温扩增和纳米酶条技术及酶对底物高效催化作用，本发明利用LAMP技术扩增副溶血性弧菌的靶基因和高熵氟化物量子点纳米酶的过氧化物酶活性来检测副溶血性弧菌，在由该细菌引起的胃肠炎疾病诊断治疗领域中具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为高熵氟化物量子点纳米酶的制备过程机理图；
图2为Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图；
图3为Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图；
图4为Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图；
图5为Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图；
图6为Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图；
图7为Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图；
图8为Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图9为Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图10为Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图11为Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图12为Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图13为Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图14为LAMP扩增靶基因的过程示意图；
图15为纳米酶测向流纸芯片检测过程图；
图16为Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶应用于副溶血性弧菌的标准曲线图；
图17为Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶应用于副溶血性弧菌的标准曲线图；
图18为Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶应用于副溶血性弧菌的标准曲线图；
图19为Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶应用于副溶血性弧菌的标准曲线图；
图20为Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶应用于副溶血性弧菌的标准曲线图；
图21为Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶应用于副溶血性弧菌的标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供一种高熵氟化物量子点纳米酶，是基于气相冷冻法，将原料雾化再喷射使反应物相遇来形成沉淀颗粒，沉淀颗粒落在超低温板上迅速冻结得到初始高熵氟化物纳米酶；然后通过内爆法将初始高熵氟化物纳米酶量子点化；最后，通过表面催化中心嫁接法对其进行表面改性而得到最终高熵氟化物量子点纳米酶。其反应机理如图1所示。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明
以下实施例中的小型内室Ⅰ和小型内室Ⅱ均为边长18～48cm的正方形内室。高度足够高以保证反应物在落到超低温板之前就已是沉淀颗粒，并保证有足够大的空间来实现爆炸量子点化的过程。
实施例1：Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的制备
采用气相冷冻法，将0.06mol CsF溶解于10mL去离子水中，混合均匀，得到浓度为6mol·L-1的CsF溶液；分别取0.004mol BiCl3、0.004mol CrCl3、0.004mol WCl2、0.004molBeCl2、0.004mol SnCl2，共同溶解于8mL的去离子水中，混合均匀后加入100μL的锗/锡合金量子点(1mg·mL-1)，得到浓度为0.5mol·L-1的混合溶液。将两种溶液装入到喷雾枪中雾化加热，CsF溶液和混合溶液以0.5mL·min-1：0.4mL·min-1的喷射速度同时喷射到边长为30cm的小型内室Ⅰ中，两溶液在小型内室Ⅰ上方相遇后迅速生成沉淀颗粒，生成的沉淀颗粒落到下方的温度为-6℃的超低温板上冻结。
待反应结束后，收集被冻结的沉淀颗粒，将其用去离子水溶解20分钟形成悬浮液，再用离心机离心10分钟，经2次去离子水洗涤离心和一次无水乙醇洗涤离心后，放入100℃的烘干箱中烘干2天，得到初始Cs(BixCryWzBegSnh)F3纳米酶(纳米酶分子式为CsBF3，Cs：B：F＝1:1:3，式中B为(BixCryWzBegSnh)，x+y+z+g+h＝1)。
基于内爆法，将初始Cs(BixCryWzBegSnh)F3纳米酶量子点化。将初始Cs(BixCryWzBegSnh)F3纳米酶置于边长为30cm的正方形小型内室Ⅱ中，用808nm激光(800mW·cm-2)以8s/次的频率循环照射，持续时间为8分钟，初始Cs(BixCryWzBegSnh)F3纳米酶在激光和锗/锡合金量子点的作用下自行循环爆炸形成Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶。
图2为Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图，平均直径为6nm。
实施例2：Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶的制备
采用气相冷冻法，将0.06mol CsF溶解于10mL去离子水中，混合均匀后，得到浓度为6mol L-1的CsF溶液；BiCl3、CrCl3、WCl2、BeCl2、VCl2都取0.004mol的量混合并溶解于8mL的去离子水中，混合均匀后加入100μL的锗/锡合金量子点(1mg·mL-1)，得到浓度为0.5mol·L-1的混合溶液。将两种溶液装入到喷枪中雾化加热，CsF溶液和混合溶液以0.5mL·min-1：0.4mL·min-1的喷射速度同时喷射到边长为30cm的小型内室Ⅰ中，两溶液在小型内室Ⅰ上方相遇后迅速生成沉淀颗粒，生成的沉淀颗粒落到下方的温度为-6℃的超低温板上冻结。
待反应结束后，收集被冻结的沉淀颗粒，将其用去离子水溶解20分钟形成悬浮液，再用离心机离心10分钟，经2次去离子水洗涤离心和一次无水乙醇洗涤离心后，放入100℃的烘干箱中烘干2天，得到初始Cs(BixCryWzBegVh)F3纳米酶(纳米酶分子式为CsBF3，Cs：B：F＝1:1:3，式中B为(BixCryWzBegVh)，x+y+z+g+h＝1)。
基于内爆法，将初始Cs(BixCryWzBegVh)F3纳米酶量子点化。将初始Cs(BixCryWzBegVh)F3纳米酶置于边长为30cm的正方形小型内室Ⅱ中，用808nm激光(800mW·cm-2)以8s/次的频率循环照射，持续时间为8分钟，初始Cs(BixCryWzBegVh)F3纳米酶在激光和锗/锡合金量子点的作用下自行循环爆炸形成Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶。
图3为Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图，平均直径为6nm。
实施例3：Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶的制备
采用气相冷冻法，将0.06mol CsF溶解于10mL去离子水中，混合均匀后，得到浓度为6mol·L-1的CsF溶液；BiCl3、CrCl3、WCl2、VCl2、SnCl2都取0.004mol的量混合并溶解于8mL的去离子水中，混合均匀后加入100μL的锗/锡合金量子点(1mg·mL-1)，得到浓度为0.5mol·L-1的混合溶液。将两种溶液装入到喷枪中雾化加热，CsF溶液和混合溶液以0.5mL·min-1：0.4mL·min-1的喷射速度同时喷射到边长为30cm的小型内室Ⅰ中，两溶液在小型内室Ⅰ上方相遇后迅速生成沉淀颗粒，生成的沉淀颗粒落到下方的温度为-6℃的超低温板上冻结。
待反应结束后，收集被冻结的沉淀颗粒，将其用去离子水溶解20分钟形成悬浮液，再用离心机离心10分钟，经2次去离子水洗涤离心和一次无水乙醇洗涤离心后，放入100℃的烘干箱中烘干2天，得到初始Cs(BixCryWzVgSnh)F3纳米酶(纳米酶分子式为CsBF3，Cs：B：F＝1:1:3，式中B为(BixCryWzVgSnh)，x+y+z+g+h＝1)。
基于内爆法，将初始Cs(BixCryWzVgSnh)F3纳米酶量子点化。将初始Cs(BixCryWzVgSnh)F3纳米酶置于边长为30cm的正方形小型内室Ⅱ中，用808nm激光(800mW·cm-2)以8s/次的频率循环照射，持续时间为8分钟，初始Cs(BixCryWzVgSnh)F3纳米酶在激光和锗/锡合金量子点的作用下自行循环爆炸形成Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶。
图4为Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图，平均直径为6nm。
实施例4：Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶的制备
采用气相冷冻法，将0.06mol CsF溶解于10mL去离子水中，混合均匀后，得到浓度为6mol L-1的CsF溶液；BiCl3、CrCl3、VCl2、BeCl2、SnCl2都取0.004mol的量混合并溶解于8mL的去离子水中，混合均匀后加入100μL的锗/锡合金量子点(1mg·mL-1)，得到浓度为0.5mol·L-1的混合溶液。将两种溶液装入到喷枪中雾化加热，CsF溶液和混合溶液以0.5mL·min-1：0.4mL·min-1的喷射速度同时喷射到边长为30cm的小型内室Ⅰ中，两溶液在小型内室Ⅰ上方相遇后迅速生成沉淀颗粒，生成的沉淀颗粒落到下方的温度为-6℃的超低温板上冻结。
待反应结束后，收集被冻结的沉淀颗粒，将其用去离子水溶解20分钟形成悬浮液，再用离心机离心10分钟，经2次去离子水洗涤离心和一次无水乙醇洗涤离心后，放入100℃的烘干箱中烘干2天，得到初始Cs(BixCryVzBegSnh)F3纳米酶(纳米酶分子式为CsBF3，Cs：B：F＝1:1:3，式中B为(BixCryVzBegSnh)，x+y+z+g+h＝1)。
基于内爆法，将初始Cs(BixCryVzBegSnh)F3纳米酶量子点化。将初始Cs(BixCryVzBegSnh)F3纳米酶置于边长为30cm的正方形小型内室Ⅱ中，用808nm激光(800mW·cm-2)以8s/次的频率循环照射，持续时间为8分钟，初始Cs(BixCryVzBegSnh)F3纳米酶在激光和锗/锡合金量子点的作用下自行循环爆炸形成Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶。
图5为Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图，平均直径为6nm。
实施例5：Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶的制备
采用气相冷冻法，将0.06mol CsF溶解于10mL去离子水中，混合均匀后，得到浓度为6mol L-1的CsF溶液；BiCl3、VCl2、WCl2、BeCl2、SnCl2都取0.004mol的量混合并溶解于8mL的去离子水中，混合均匀后加入100μL的锗/锡合金量子点(1mg·mL-1)，得到浓度为0.5mol·L-1的混合溶液。将两种溶液装入到喷枪中雾化加热，CsF溶液和混合溶液以0.5mL·min-1：0.4mL·min-1的喷射速度同时喷射到边长为30cm的小型内室Ⅰ中，两溶液在小型内室Ⅰ上方相遇后迅速生成沉淀颗粒，生成的沉淀颗粒落到下方的温度为-6℃的超低温板上冻结。
待反应结束后，收集被冻结的沉淀颗粒，将其用去离子水溶解20分钟形成悬浮液，再用的离心机离心10分钟，经2次去离子水洗涤离心和一次无水乙醇洗涤离心后，放入100℃的烘干箱中烘干2天，得到初始Cs(BixVyWzBegSnh)F3纳米酶(纳米酶分子式为CsBF3，Cs：B：F＝1:1:3，式中B为(BixVyWzBegSnh)，x+y+z+g+h＝1)。
基于内爆法，将初始Cs(BixVyWzBegSnh)F纳米酶量子点化。将初始Cs(BixVyWzBegSnh)F纳米酶置于边长为30cm的正方形小型内室Ⅱ中，用808nm激光(800mW·cm-2)以8s/次的频率循环照射，持续时间为8分钟，初始Cs(BixVyWzBegSnh)F纳米酶在激光和锗/锡合金量子点的作用下自行循环爆炸形成Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶。
图6为Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图，平均直径为6nm。
实施例6：Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的制备
采用气相冷冻法，将0.06mol CsF溶解于10mL去离子水中，混合均匀后，得到浓度为6mol·L-1的CsF溶液；VCl2、CrCl3、WCl2、BeCl2、SnCl2都取0.004mol的量混合并溶解于8mL的去离子水中，混合均匀后加入100μL的锗/锡合金量子点(1mg·mL-1)，得到浓度为0.5mol·L-1的混合溶液。将两种溶液装入到喷枪中雾化加热，CsF溶液和混合溶液以0.5mL·min-1：0.4mL·min-1的喷射速度同时喷射到边长为30cm的小型内室Ⅰ中，两溶液在小型内室Ⅰ上方相遇后迅速生成沉淀颗粒，生成的沉淀颗粒落到下方的温度为-6℃的超低温板上冻结。
待反应结束后，收集被冻结的沉淀颗粒，将其用去离子水溶解20分钟形成悬浮液，再用离心机离心10分钟，经2次去离子水洗涤离心和一次无水乙醇洗涤离心后，放入100℃的烘干箱中烘干2天，得到初始Cs(VxCryWzBegSnh)F3纳米酶(纳米酶分子式为CsBF3，Cs：B：F＝1:1:3，式中B为(VxCryWzBegSnh)，x+y+z+g+h＝1)。
基于内爆法，将初始Cs(VxCryWzBegSnh)F3纳米酶量子点化。将初始Cs(VxCryWzBegSnh)F3纳米酶置于边长为30cm的正方形小型内室Ⅱ中，用808nm激光(800mW·cm-2)以8s/次的频率循环照射，持续时间为8分钟，初始Cs(VxCryWzBegSnh)F3纳米酶在激光和锗/锡合金量子点的作用下自行循环爆炸形成Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶。
图7为Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的透射电子显微镜图，平均直径6nm。
实施例7：不同高熵氟化物量子点纳米酶的类酶活性测试
配制摩尔浓度为200mM，pH值为3.6的醋酸-醋酸钠缓冲溶液，将3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)溶解于二甲基亚砜得到0.1mM的TMB溶液，将30wt％的过氧化氢溶液稀释成摩尔浓度为1mM的溶液，将高熵氟化物量子点纳米酶分散在缓冲溶液中，混合均匀，得到1mg·mL-1的纳米酶分散液。在离心管中依次加入1640μL缓冲液，100μL酶分散液，200μL TMB溶液以及60μL过氧化氢(H2O2)溶液，将反应液震荡并在室温25℃下孵育10分钟，用紫外分光光度计测量其吸收情况。并与无高熵氟化物量子点纳米酶添加的空白体系进行吸光度值的比较。
图8～图13是不同高熵氟化物量子点纳米酶的酶活性曲线图。
图8为Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图9为Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图10为Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图11为Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图12为Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶的吸收曲线；
图13为Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的活性验证图，下曲线为TMB+H2O2吸收曲线，上曲线为TMB+过氧化氢+Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的吸收曲线。
表1为不同高熵氟化物量子点纳米酶的Km值。
实施例 Km(TMB)(mM) Km(H2O2)(mM)
实施例1 0.083 0.088
实施例2 0.086 0.092
实施例3 0.058 0.078
实施例4 0.062 0.086
实施例5 0.073 0.097
实施例6 0.051 0.072
上述实验结果表明，本发明提供的高熵氟化物量子点纳米酶具有良好的类过氧化物酶活性。
实施例8：高熵氟化物量子点纳米酶的表面改性
配制浓度为2mol·mL-1的二乙基氨基铁和浓度为1mg·mL-1的高熵氟化物量子点纳米酶，将3mL的二乙基氨基铁溶液与2mL的高熵氟化物量子点纳米酶溶液均匀混合，二乙基氨基铁与纳米酶表面的氟形成氢键，得到最终纳米酶。
实施例9：不同高熵氟化物量子点纳米酶基于类过氧化物酶活性在细菌基因检测中的应用
首先将副溶血性弧菌菌株(购自上海联迈生物工程有限公司)分别用TSA和TSB在37℃下处理并培养，得到一定浓度的副溶血性弧菌。将PMA溶解在20％(v/v)二甲基亚砜中，得到初始溶液(1mg·mL-1)并在黑暗中-35℃下储存。分别将15μL的细菌加入2mL的离心管中，用PMA(最终浓度为10μg·mL-1)在室温25℃下黑暗中处理3分钟。然后收集细菌，提取细菌中的靶基因(即toxR基因)，并立即用LAMP(环介导等温扩增)法扩增toxR基因。使用链置换型DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，实现靶基因的大量扩增，有效提高灵敏度和特异性。LAMP扩增靶基因的过程示意如图14所示。
将链霉亲和素与生物素化测试DNA(T-DNA)或生物素化对照DNA(C-DNA)混合分别孵育1h。随后，将上述混合物喷射到NC膜上，分别形成T线和C线。纳米酶测向流纸芯片检测过程如图15所示。
(1)Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的应用
将SH-DNA修饰到Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶上以形成捕获探针，并将捕获探针提前喷射在结合区。将含有PMA-LAMP反应产物的溶液加入到样品区，溶液通过毛细管作用流向结合区与捕获探针混合，溶液中的PMA-LAMP反应产物在结合区与捕获探针偶联形成复合物后，到达T线并与T线上的T-DNA结合；复合物与T-DNA结合结束后，溶液中剩余的捕获探针则与C线上的C-DNA结合，吸收区最后用于收集废液。接下来加入显色反应混合溶液(含最终浓度为0.1mM的TMB和0.3mM的H2O2)，经过10分钟后，用手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度，根据不同浓度对应不同的蓝色强度值计算出待测物的浓度。
图16为Cs(BixCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶应用于检测副溶血性弧菌的标准曲线。
副溶血性弧菌的标准曲线方程为：Y＝8526.3x+2282.1，R2＝0.9903(x为log(副溶血性弧菌浓度))。
(2)Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶的应用
将SH-DNA修饰到Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶上以形成捕获探针，并将捕获探针提前喷射在结合区。将含有PMA-LAMP反应产物的溶液加入到样品区，溶液通过毛细管作用流向结合区与捕获探针混合，溶液中的PMA-LAMP反应产物在结合区与捕获探针偶联形成复合物后，到达T线并与T线上的T-DNA结合；复合物与T-DNA结合结束后，溶液中剩余的捕获探针则与C线上的C-DNA结合，吸收区最后用于收集废液。接下来加入显色反应混合溶液(含最终浓度为0.1mM的TMB和0.3mM的H2O2)，经过10分钟后，用手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度，根据不同浓度对应不同的蓝色强度值计算出待测物的浓度。
图17为Cs(BixCryWzBegVh)F3量子点纳米酶应用于检测副溶血性弧菌的标准曲线。
副溶血性弧菌的标准曲线方程为：Y＝8262.1x+2862.4，R2＝0.9900(x为log(副溶血性弧菌浓度))。
(3)Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶的应用
将SH-DNA修饰到Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶上以形成捕获探针，并将捕获探针提前喷射在结合区。将含有PMA-LAMP反应产物的溶液加入到样品区，溶液通过毛细管作用流向结合区与捕获探针混合，溶液中的PMA-LAMP反应产物在结合区与捕获探针偶联形成复合物后，到达T线并与T线上的T-DNA结合；复合物与T-DNA结合结束后，溶液中剩余的捕获探针则与C线上的C-DNA结合，吸收区最后用于收集废液。接下来加入显色反应混合溶液(含最终浓度为0.1mM的TMB和0.3mM的H2O2)，经过10分钟后，用手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度，根据不同浓度对应不同的蓝色强度值计算出待测物的浓度。
图18为Cs(BixCryWzVgSnh)F3量子点纳米酶应用于检测副溶血性弧菌的标准曲线。
副溶血性弧菌的标准曲线方程为：Y＝8397.7x+1315.4，R2＝0.9900(x为log(副溶血性弧菌浓度))。
(4)Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶的应用
将SH-DNA修饰到Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶上以形成捕获探针，并将捕获探针提前喷射在结合区。将含有PMA-LAMP反应产物的溶液加入到样品区，溶液通过毛细管作用流向结合区与捕获探针混合，溶液中的PMA-LAMP反应产物在结合区与捕获探针偶联形成复合物后，到达T线并与T线上的T-DNA结合；复合物与T-DNA结合结束后，溶液中剩余的捕获探针则与C线上的C-DNA结合，吸收区最后用于收集废液。接下来加入显色反应混合溶液(含最终浓度为0.1mM的TMB和0.3mM的H2O2)，经过10分钟后，用手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度，根据不同浓度对应不同的蓝色强度值计算出待测物的浓度。
图19为Cs(BixCryVzBegSnh)F3量子点纳米酶应用于检测副溶血性弧菌的标准曲线。
副溶血性弧菌的标准曲线方程为：Y＝8396.3x+2092.1，R2＝0.9903(x为log(副溶血性弧菌浓度))。
(5)Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶的应用
将SH-DNA修饰到Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶上以形成捕获探针，并将捕获探针提前喷射在结合区。将含有PMA-LAMP反应产物的溶液加入到样品区，溶液通过毛细管作用流向结合区与捕获探针混合，溶液中的PMA-LAMP反应产物在结合区与捕获探针偶联形成复合物后，到达T线并与T线上的T-DNA结合；复合物与T-DNA结合结束后，溶液中剩余的捕获探针则与C线上的C-DNA结合，吸收区最后用于收集废液。接下来加入显色反应混合溶液(含最终浓度为0.1mM的TMB和0.3mM的H2O2)，经过10分钟后，用手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度，根据不同浓度对应不同的蓝色强度值计算出待测物的浓度。
图20为Cs(BixVyWzBegSnh)F3量子点纳米酶应用于检测副溶血性弧菌的标准曲线。
副溶血性弧菌的标准曲线方程为：Y＝8568.0x+2826.1，R2＝0.9902(x为log(副溶血性弧菌浓度))。
(6)Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶的应用
将SH-DNA修饰到Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶上以形成捕获探针，并将捕获探针提前喷射在结合区。将含有PMA-LAMP反应产物的溶液加入到样品区，溶液通过毛细管作用流向结合区与捕获探针混合，溶液中的PMA-LAMP反应产物在结合区与捕获探针偶联形成复合物后，到达T线并与T线上的T-DNA结合；复合物与T-DNA结合结束后，溶液中剩余的捕获探针则与C线上的C-DNA结合，吸收区最后用于收集废液。接下来加入显色反应混合溶液(含最终浓度为0.1mM的TMB和0.3mM的H2O2)，经过10分钟后，用手机拍摄图像并用Image J软件读取T线上的蓝色强度，根据不同浓度对应不同的蓝色强度值计算出待测物的浓度。
图21为Cs(VxCryWzBegSnh)F3量子点纳米酶应用于检测副溶血性弧菌的标准曲线。
副溶血性弧菌的标准曲线方程为：Y＝8325.7x+3918.1，R2＝0.9901(x为log(副溶血性弧菌浓度))。
本发明利用高熵氟化物量子点纳米酶的类过氧化物酶活性，将其作为催化剂，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢混合溶液为显色剂，将toxR基因作为LAMP扩增的靶基因，结合纳米酶条技术，进一步检测副溶血性弧菌浓度。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高熵氟化物量子点纳米酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：首先配制CsF溶液，再将BiCl3、CrCl3、WCl2、BeCl2、SnCl2、VCl2中的五种物质混合后溶解在水中，加入内爆因子，得到五种物质的混合溶液，搭建一个简易小型内室Ⅰ，内室Ⅰ底部放置一块超低温板；
步骤2：将步骤1中CsF溶液和混合溶液分别装入喷雾枪中雾化加热，并喷射到小型内室Ⅰ中，两反应溶液在小型内室Ⅰ上方以气态接触并迅速生成沉淀颗粒，再落到内室Ⅰ下方的超低温板上冻结，反应结束后收集冻结的沉淀物，在室温下加入去离子水解冻后形成沉淀悬浮液，再将沉淀离心洗涤后，烘干，得到带有内爆因子的初始高熵氟化物纳米酶；
步骤3：基于内爆法将初始高熵氟化物纳米酶量子点化，即将初始高熵氟化物纳米酶放在小型内室Ⅱ中，循环射入一束强光，强光与内爆因子相互作用使得初始高熵氟化物纳米酶自行循环爆炸形成高熵氟化物量子点纳米酶；
步骤4：使用表面催化中心嫁接法对量子点纳米酶进行表面改性，即将金属有机物与纳米酶混合，使有机物与纳米酶表面的氟形成氢键，增加纳米酶活性位点。
2.根据权利要求1所述的一种高熵氟化物量子点纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的CsF溶液和五种物质的混合溶液的浓度比是25：4～35：0.3。
3.根据权利要求1所述的一种高熵氟化物量子点纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的超低温板温度范围保持在-50℃～0℃。
4.根据权利要求1所述的一种高熵氟化物量子点纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的内爆因子为锗/锡合金量子点。
5.根据权利要求1所述的一种高熵氟化物量子点纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的CsF溶液和混合物溶液的喷雾枪的喷射速度范围分别为0.2～3mL·min-1和0.1～1.5mL·min-1。
6.根据权利要求1所述的一种高熵氟化物量子点纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的强光为808nm、800mW·cm-2激光，循环射入频率为5s～15s/次，内爆过程持续时间为5～15分钟。
7.根据权利要求1所述的一种高熵氟化物量子点纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的金属有机物为二乙基氨基铁、二丁基羟基钴、二丙基氨基钪、二戊基氨基铟和二丁基氨基铋中的任意一种。
8.根据权利要求7所述的一种高熵氟化物量子点纳米酶的制备方法，其特征在于，所述步骤4中的金属有机物为二乙基氨基铁。
9.一种权利要求1至8任一项所述的高熵氟化物量子点纳米酶。
10.权利要求9所述的高熵氟化物量子点纳米酶在生化检测中的应用。
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