CN116509819A - 一种双载药重组高密度脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种双载药重组高密度脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种双载药重组高密度脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用，属于药物制剂技术领域；所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒中，以高密度脂蛋白作为药物运输载体，所述药物运输载体中包含了水溶性药物铂类药物和脂溶性药物五环三萜类皂苷类药物；所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒中具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒性和无免疫原性；所述重组高密度脂蛋白纳米粒可以实现共同靶向给药。

Description

一种双载药重组高密度脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于药物制剂技术领域，具体涉及一种双载药重组高密度脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一。目前，CRC的发病率呈年轻化趋势，且多数病人发现时已属于中晚期。近年来，CRC的治疗得到了极大发展，化学治疗、靶向治疗、免疫治疗、局部治疗都为深受病痛折磨的患者带来了希望。由于35％患者发现时已进入晚期，失去手术根治机会。化疗仍然是晚期CRC治疗的主要方式。
化疗药物奥沙利铂(Oxaliplatin,OXA)是继顺铂和卡铂后的第三代铂类化疗药物，其具有特异的细胞毒性，是晚期CRC患者常用的一线化疗药物。但是，OXA易引发癌细胞产生耐药性，有将近50％患者对OXA治疗无反应，这是OXA治疗失败的主要原因。
α-常春藤皂苷(α-Hederin)是从我国传统中药材中分离提取的一种单桥糖三萜皂苷，具有多种生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、抑制炎症和免疫调节等，在逆转肿瘤耐药、改善结肠癌治疗效果方面也有一定作用。但α-Hederin的水溶性较差并且其细胞毒性很大，特别是具有溶血性。
高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)是一种内源性纳米脂蛋白颗粒，由多种生物脂类和载脂蛋白构成。重组高密度脂蛋白和内源性高密度脂蛋白构成成分相同，具有典型的“壳-核”结构。清道夫Bl受体(scavenger type Blreceptor,SR-B1)能够被HDL表面的载脂蛋白A-1(APOA-1)所识别且高亲和力结合，使细胞选择性地摄取HDL中的胆固醇酯。rHDL纳米粒可以与肿瘤细胞表面高表达的SR-B1受体特异性结合，直接靶向肿瘤，形成更高效的药物递送。内源性物质APOA-1、磷脂、胆固醇组成的亲水表面使得rHDL纳米粒有效地规避网状内皮系统的清除。rHDL作为药物运输载体具有先天优势，如可静脉注射、无毒、无免疫原性、可携带脂溶性和水溶性分子、留存时间长、具有一定靶向性等。
因此，需要开发一种双载药重组高密度脂蛋白纳米粒来作为新的肿瘤制剂。
发明内容
针对现有技术中存在不足，本发明提供了一种双载药重组高密度脂蛋白纳米粒及其制备方法和应用；所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒中，以高密度脂蛋白作为药物运输载体，所述药物运输载体中包含了水溶性药物铂类药物和脂溶性药物五环三萜类皂苷类药物；所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒中具有良好的生物相容性、生物可降解性、无毒性和无免疫原性；所述重组高密度脂蛋白纳米粒可以实现共同靶向给药。
本发明首先提供了一种双载药重组高密度脂蛋白纳米粒，所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒为球形结构，球形结构表面有不规则的凸起，所述纳米粒的平均粒径为124.5±3.56nm；所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒中，磷脂和胆固醇形成双分子层囊泡，囊泡内包载水溶性药物，双分子层内包载脂溶性药物，载脂蛋白A-1结合于双分子层的亲水层上；
所述水溶性药物包括铂类药物，所述脂溶性药物包括五环三萜类皂苷类药物。
优选地，所述铂类药物包括奥沙利铂、奈达铂、卡铂或顺铂；所述五环三萜类皂苷类药物包括α-常春藤皂苷或人参皂苷Ro。
本发明还提供了上述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)双载药纳米粒的制备：
将大豆卵磷脂、胆固醇和五环三萜类皂苷类药物溶于乙醇，得到有机相；
将质量分数为5％的葡萄糖溶液预热，然后向其中加入铂类药物和脱氧胆酸钠，超声溶解，得到水相；
在搅拌条件下将有机相缓慢注入水相中，继续搅拌反应，反应结束后减压旋蒸除去有机溶剂和部分水，然后冰浴探头超声，超声结束后过滤膜以减小粒径，使其粒径达到200nm以下，得到双载药纳米粒溶液；
(2)双载药重组高密度脂蛋白(rHDL)纳米粒的制备：
向双载药纳米粒溶液中加入载脂蛋白A-1，溶解后孵育一段时间，得到所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒。
优选地，步骤(1)中，所述有机相中，大豆卵磷脂、胆固醇、五环三萜类皂苷类药物的用量比为100mg：15～5mg：5～15mg。
优选地，步骤(1)中，所述水相中，葡萄糖溶液、铂类药物和脱氧胆酸钠的用量比为15mL：1～10mg：5～15mg。
优选地，步骤(1)中，所述葡萄糖溶液质量分数为5％，预热至50～65℃。
优选地，步骤(1)中，所述有机相和水相的体积比为1～3：3～1。
优选地，步骤(1)中，所述搅拌反应的条件为40～50℃下反应60min。
优选地，步骤(1)中，所述旋转蒸发仪的设置条件为60～68℃，30～40min。
优选地，步骤(1)中，所述冰浴探头超声条件为AMPL40％，工作1s休息1s，时间为10～15min。
优选地，步骤(2)中，所述双载药纳米粒溶液和载脂蛋白A-1的用量比为3mL:100～200μg；
所述孵育的条件为在37℃下摇床孵育2天。
本发明还提供了上述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒在制备肿瘤制剂中的应用。
优选地，所述肿瘤包括结直肠癌。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明采用高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)作为药物运输载体，所述高密度脂蛋白作为药物运输载体具有先天优势，如可静脉注射、无毒、无免疫原性、可携带脂溶性和水溶性分子、留存时间长、具有一定靶向性等。
本发明将铂类药物和五环三萜类皂苷尤其是奥沙利铂和α-常春藤皂苷联合使用，在对抗结肠癌的过程中，起到了协同、增效的作用。
本发明制备的双载药重组高密度脂蛋白递送系统，延长了药物在体内的滞留时间，实现了两种药物的共同、靶向给药。
附图说明
图1为未加载脂蛋白即α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒的粒径分布图图。
图2为添加载脂蛋白即α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白的粒径分布图。
图3为α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒的TEM图；图中a为100nm，b为50nm。
图4为α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白的TEM图；图中a为100nm，b为50nm。
图5为HPLC法测定奥沙利铂对照品的标准曲线。
图6为HPLC法测定α-常春藤皂苷标准品的标准曲线。
图7为奥沙利铂的体外药物释放曲线。
图8为α-常春藤皂苷的体外药物释放曲线。
图9为不同浓度α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白对细胞活力的影响情况图。
图10为不同加药组不同时间点对细胞活力的影响情况图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并不限于此。本发明中，若非特指，所使用的原料和设备均为市售产品，下列实施例中，若非特指，均为本领域常规方法。以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
在以下实施例中所述采用的试剂盒仪器来源如下：
试剂：大豆卵磷脂(Lecithin，上海源叶生物科技有限公司)；胆固醇(Cholesterol，阿拉丁)；α-常春藤皂苷(α-Hederin，上海普誉科贸有限公司)；葡萄糖(D-(+)-Glucose，国药集团化学试剂有限公司)；分析纯无水乙醇(Ethanol，上海泰坦科技股份有限公司)；奥沙利铂(Oxaliplatin，中国食品药品检定研究院)；色谱级乙腈(Acetonitrile，美国TEDIA)；分析纯正磷酸(Phosphorous Acid，上海泰坦科技股份有限公司)；色谱级甲醇(Methyl Alcohol，美国TEDIA)；Triton TM X-100(美国R&D Systems)；RPMI 1640(美国CORNING)；无菌PBS(Adamas life)；青霉素-链霉素双抗溶液(PenicillinStreptomycin，gibco)；胰蛋白酶-EDTA溶液(Trypsin-EDTA，gibco)；胎牛血清(Fetalbovine serum，gibco)；无血清完全细胞冻存液(CELLBANKER 2，日本ZENOAQ)；cck-8(上海威奥生物科技有限公司)；二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，阿拉丁)
材料：0.22μm水相过滤器(上海普誉科贸有限公司)；0.22μm有机过滤器(上海普誉科贸有限公司)；0.22μm无菌滤膜(MilliporePES Membrane Filter Unit，Millex-GP)
仪器：RE-55AA旋转蒸发器(上海贤德实验仪器有限公司)；SHZ-DⅢ循环水真空泵(上海羌强实业发展有限公司)；DK-8D型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；VCX130超声波破碎仪(美国Sonics)；85-2数显恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机有限公司)；LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；CAPCELL PAK C18 UG120色谱柱(日本OSAKASODA)；Athena C18-WP色谱柱(德国CNW)；Fresco17高速冷冻离心机(美国赛默飞世尔科技公司)；AL204电子天平(瑞士METTLER TOLEDO)；纳米粒度及Zeta电位分析仪(DLS)(英国Malvern Zetasizer Nano ZS90)；HT7800透射电子显微镜(日本日立高新技术公司)；二氧化碳培养箱3111(Thermo SCIENTIFIC)；1300系列Ⅱ级A2型生物安全柜(ThermoSCIENTIFIC)；TDL-5-A型离心机(上海安亭科学仪器厂)；尼康倒置生物显微镜(NikonECLIPSE TS100)；Multiskan Skyhigh全波长酶标仪(Thermo SCIENTIFIC)；超低温保存箱(海尔DW-86L578J)；医用冷藏冷冻箱(海尔)
HCT116细胞(上海富衡生物科技有限公司)
实施例1：双载药重组高密度脂蛋白纳米粒的制备
(1)双载药纳米粒的制备：
将100mg大豆卵磷脂、5mg胆固醇和5mgα-常春藤皂苷溶于5mL乙醇，得到有机相；
将15mL浓度为5％(w/v)的葡萄糖溶液预热至58℃，然后向其中加入5.3mg奥沙利铂和10mg脱氧胆酸钠，超声溶解，得到水相；
在45℃、搅拌条件下将有机相缓慢注入水相中，其中有机相和水相的体积比为1:1，继续搅拌反应1h，反应结束后使用旋转蒸发器进行减压蒸馏，58℃水浴真空旋转蒸发除去有机溶剂和部分水；使用超声波破碎仪进行冰浴探头超声10min(AMPL 40％工作1s休息1s)，然后通过0.22μm水系滤膜、整粒三次，得到α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒溶液，即所述双载药纳米粒溶液；
(2)双载药重组高密度脂蛋白(rHDL)纳米粒的制备：
向3mL双载药纳米粒溶液中加入150μg载脂蛋白A-1，溶解后37℃下摇床孵育2天，得到α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白，即所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒。
分别对未加载脂蛋白即α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒和添加载脂蛋白即α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白的粒径、Zeta电位进行测定，测定方法为：分别取适量α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒和α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白，稀释一定倍数后，充分混匀，使用纳米粒度及Zeta电位分析仪(DLS)测定。
α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒和α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白的粒径分布如图1和图2所示，从图中可以看出，α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒平均粒径为(109.23±2.39)nm，Zeta电位为(-6.52±0.29)；α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白平均粒径为(124.5±3.56)nm，Zeta电位为(-5.35±0.38)。两种纳米粒的粒径都小于150nm，这说明α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒和α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白可以通过EPR效应更好的聚集在肿瘤细胞的周围。
本实施例中还考察了α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒和α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白的形态学特征，考察方法如下：
分别取适量α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒和α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白，稀释一定倍数后，充分混匀，分别滴于微栅铜网，用滤纸条从液滴边缘吸去多余液体样本，室温下静置1min，滴加1％磷酸钨进行负染色，静置30s后用滤纸条吸去铜网多余的染液，使铜网自然风干，用透射电子显微镜进行观察，考察结果如图3和图4所示。
从图3和图4中可以看出，α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒为均匀的球形结构，边缘光滑圆整，粒径大小均一；α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白为球形结构，表面有不规则的凸起。
实施例2：
本实施例中考察了实施例1中制备的α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒和α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白的包封率、载药量，具体考察如下所示：
(1)奥沙利铂总含量测定：
(a)色谱条件：
Capcell Pak C18 UG120柱(250mm×5μm,i.d.)；流动相：pH3的磷酸水溶液-乙腈(99:1)；柱温：40℃；流速：1mL·min-1；检测波长：210nm；进样量：20μL。
(b)标曲制作：
用电子天平准确称取奥沙利铂标准品，并用5％葡萄糖溶解，配得标准品浓度为：1、2、4、8、16、32、64、128μg/mL，所有试验样品在进样前通过0.22μm滤膜去除杂质。然后打开高效液相色谱系统，按照(a)中给出的色谱条件设置各项参数，待系统稳定后进样，然后导出所有原始数据以PDF格式保存，通过Origin进行数据处理，制作出奥沙利铂标准曲线浓度-峰面积图。
图5为奥沙利铂的标准曲线，从图中可以看出，回归方程为y＝14436.464x-799.445，相关指数为R2＝0.99999。
(c)样品溶液中奥沙利铂总含量的测定：
取样品溶液200μL，加入10％Triton溶液800μL，充分摇晃纯以保证脂质体结构被充分破坏，加入1000μL的5％葡萄糖溶液，混合均匀，过0.22μm滤膜，取20μL进样，测定，换算得到样品溶液中奥沙利铂的含量即为总药物量，测定结果如表1所示。
(2)α-常春藤皂苷总含量测定：
(a)色谱条件：
色谱条件：Athena C18-WP柱(4.6mm×150mm,5μm)；流动相：乙腈-0.1％磷酸水溶液(45:55)；柱温：25℃；流速：1mL·min-1；检测波长：203nm；进样量：20μL。
(b)标曲制作：
用电子天平准确称取α-常春藤皂苷标准品，并用80％甲醇溶解，配得标准品浓度为：1、2、4、8、16、32、64、128μg/mL。所有试验样品在进样前通过0.22μm滤膜去除杂质。打开高效液相色谱系统，设置各项参数，待系统稳定后进样。导出所有原始数据以PDF格式保存，通过Origin进行数据处理，制作出α-常春藤皂苷标准曲线浓度-峰面积图。
图6为α-常春藤皂苷的标准曲线，从图中可以看出，回归方程为y＝8990.441x+1166.858，相关指数为R2＝0.99983。
(c)样品溶液中α-常春藤皂苷总含量的测定：
取各样品溶液200μL，加入800μL纯甲醇，充分摇晃以保证脂质体结构被充分破坏，过0.22μm滤膜，取20μL进样，测定，换算得到样品溶液中α-常春藤皂苷的含量即为总药物量，测定结果如表1所示。
(3)奥沙利铂包封率的测定
采用超滤离心法测定奥沙利铂的包封率。具体操作如下：取300μL新鲜制备的样品于3KD的超滤管中，采用超滤离心法即离心力13200g，温度10℃，离心10min，对外管中液体进行定量，用5％葡萄糖溶液将其稀释至原浓度，过0.22μm滤膜，取20μL进样，测定，换算得到样品溶液中奥沙利铂的游离药物量，测定结果如表1所示。
(4)α-常春藤皂苷包封率的测定
采用低速离心法测定α-常春藤皂苷的包封率。具体操作如下：取200μL新鲜制备的样品、200μL的5％葡萄糖溶液于1.5mL离心管中，充分混匀，采用低速离心法即离心力2000rpm，温度10℃，离心15min，吸取上清100μL，加入400μL纯甲醇，混合均匀，过0.22μm滤膜，取20μL进样，测定，经换算得到样品溶液中α-常春藤皂苷包裹在脂质体中的药物量。按下列公式计算载药纳米粒中药物的包封率(entrapment efficiency,EE)
包封率公式：
其中m1为包裹在纳米粒中的药物量，m2为液体体系和纳米粒体系中的总药物量
按下列公式计算载药纳米粒中药物的载药量(drug loading,DL)
载药量公式：
其中m总为载药脂质体纳米粒的总质量
表1.双载药纳米粒和双载药重组高密度脂蛋白纳米粒的包封率、载药量
从表1中可以看出，两种纳米粒对奥沙利铂的包封率均高于90％，对α-常春藤皂苷的包封率均大于80％。
实施例3：
本实施例通过透析法模拟药物在体内的释放过程，来考察实施例1中制备的α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒和α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白的体外药物释放行为，具体考察如下：
将游离奥沙利铂溶液、游离α-常春藤皂苷溶液、α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒和α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白置于3KD的透析袋中，各加入含0.05％SDS的PBS溶液作为释放介质，将透析装置置于37℃恒温振荡器中，控制转速为100rpm。分别于不同时间点取释放介质1mL，同时补充新鲜释放介质1mL。取各时间点的样品20μL，HPLC进样分析，经换算得到各时间点释放介质中α-常春藤皂苷、奥沙利铂的浓度。按下列公式计算不同时间点的药物累积释放率(Q)，绘制累积释放曲线。
V为释放介质的体积(mL)，Ci和Cn为第i、n时间点取样测得的药物质量浓度(ug/mL)，V0为取样体积(mL)m为样品中药物的总质量。
从图7和图8中可以看出，在体外药物释放实验中，与游离奥沙利铂溶液、游离α-常春藤皂苷溶液相比，α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒和α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白的药物释放更为缓慢，其中α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白的药物释放最为缓慢。说明α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白对两种药物有着明显的缓释作用。
实施例4：
本实施例通过cck-8实验探究实施例1中制备的α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白对细胞活性的影响，具体考察如下：
实验设置对照组、实验组、空白组，其中对照组为细胞加培养基，空白组只加培养基，以此来消除培养基中OD值带来的误差。取处于对数生长期的HCT116与HCT116耐奥沙利铂细胞，润洗、消化、离心、计数，制得浓度为8×103cells/mL的细胞悬液，之后将细胞接种于96孔板中，每孔100μL细胞悬液，空白组加100μL培养液。将96孔板放入37℃、5％CO2孵育箱中，待细胞长至适宜的密度后，将培养液换为含药培养基后继续培养24h，之后每孔加入10mL的cck-8，避光37℃、5％CO2孵育箱中孵育1h，通过酶标仪，测定540nm下每孔的OD值。各浓度设置3个复孔。
为探究α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白在不同浓度下对细胞活性的影响，设置每个实验组奥沙利铂的浓度分别为0、5、10、15、20、25、30、35μM，不同浓度药物组对细胞的活性影响如图9所示。
从图9可以看出，α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白对HCT116细胞的细胞活力具有明显的抑制作用，对细胞的抑制作用随药物浓度的增加而增强。
为比较同一浓度的不同药物组在不同时间节点24、48、72h对细胞活性的影响，设置实验组有空白rHDL、α-Hederin-NLC、OXA-NLC、α-Hederin-OXA-NLC、α-Hederin-OXA-rHDL，其中奥沙利铂或α-常春皂苷的浓度20μM。不同时间节点，同一药物浓度的各纳米粒对细胞的抑制作用如图10所示。
从图10可以看出，空白脂质体对HCT116细胞无毒害作用；双载药纳米粒杀伤细胞的作用比单载药纳米粒更加明显，说明两种药物的联用在抑制结肠癌结肠癌细胞时起协同作用；各纳米粒对细胞的抑制作用随着作用时间的增加而增强。
实施例5：
(1)双载药纳米粒的制备：
将100mg大豆卵磷脂、15mg胆固醇和15mgα-常春藤皂苷溶于5mL乙醇，得到有机相；
将15mL浓度为5％(w/v)的葡萄糖溶液预热至50℃，然后向其中加入1mg奥沙利铂和5mg脱氧胆酸钠，超声溶解，得到水相；
在40℃、搅拌条件下将有机相缓慢注入水相中，其中有机相和水相的体积比为1:3。然后继续搅拌反应1h，反应结束后使用旋转蒸发器进行减压蒸馏，60℃水浴真空旋转蒸发除去有机溶剂和部分水；使用超声波破碎仪进行冰浴探头超声15min(AMPL 40％工作1s休息1s)，然后通过0.22μm水系滤膜、整粒三次，得到α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒溶液，即所述双载药纳米粒溶液；
(2)双载药重组高密度脂蛋白(rHDL)纳米粒的制备：
向3mL双载药纳米粒溶液中加入100μg载脂蛋白A-1，溶解后37℃下摇床孵育2天，得到α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白，即所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒。
实施例6：
(1)双载药纳米粒的制备：
将100mg大豆卵磷脂、10mg胆固醇和10mgα-常春藤皂苷溶于5mL乙醇，得到有机相；
将15mL浓度为5％(w/v)的葡萄糖溶液预热至65℃，然后向其中加入10mg奥沙利铂和15mg脱氧胆酸钠，超声溶解，得到水相；
在50℃、搅拌条件下将有机相缓慢注入水相中，其中有机相和水相的体积比为3:1。然后继续搅拌反应1h，反应结束后使用旋转蒸发器进行减压蒸馏，68℃水浴真空旋转蒸发除去有机溶剂和部分水；使用超声波破碎仪进行冰浴探头超声12min(AMPL 40％工作1s休息1s)，然后通过0.22μm水系滤膜、整粒三次，得到α常春藤皂苷-奥沙利铂双载药纳米粒溶液，即所述双载药纳米粒溶液；
(2)双载药重组高密度脂蛋白(rHDL)纳米粒的制备：
向3mL双载药纳米粒溶液中加入200μg载脂蛋白A-1，溶解后37℃下摇床孵育2天，得到α常春藤皂苷-奥沙利铂重组高密度脂蛋白，即所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种双载药重组高密度脂蛋白纳米粒，其特征在于，所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒中，磷脂和胆固醇形成双分子层囊泡，囊泡内包载水溶性药物，双分子层内包载脂溶性药物，载脂蛋白A-1结合于双分子层的亲水层上；
所述水溶性药物包括铂类药物，所述脂溶性药物包括五环三萜类皂苷类药物。
2.根据权利要求1所述的双载药重组高密度脂蛋白纳米粒，其特征在于，所述铂类药物包括奥沙利铂、奈达铂、卡铂或顺铂；所述五环三萜类皂苷类药物包括α-常春藤皂苷或人参皂苷Ro。
3.根据权利要求2所述的双载药重组高密度脂蛋白纳米粒，其特征在于，所述铂类药物为奥沙利铂；所述五环三萜类皂苷类药物为α-常春藤皂苷。
4.权利要求1～3任一项所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒的制备方法，其特征在于，包括：
(1)双载药纳米粒的制备：
将大豆卵磷脂、胆固醇和五环三萜类皂苷类药物溶于乙醇，得到有机相；
将质量分数为5％的葡萄糖溶液预热，然后向其中加入铂类药物和脱氧胆酸钠，超声溶解，得到水相；
在搅拌条件下将有机相缓慢注入水相中，继续搅拌反应，反应结束后减压旋蒸除去有机溶剂和部分水，然后冰浴探头超声，超声结束后过滤膜以减小粒径，使其粒径达到200nm以下，得到双载药纳米粒溶液；
(2)双载药重组高密度脂蛋白纳米粒的制备：
向双载药纳米粒溶液中加入载脂蛋白A-1，溶解后孵育一段时间，得到所述双载药重组高密度脂蛋白纳米粒。
5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述有机相中，大豆卵磷脂、胆固醇、五环三萜类皂苷类药物的用量比为100mg：15～5mg：5～15mg；
所述水相中，葡萄糖溶液、铂类药物和脱氧胆酸钠的用量比为15mL：1～10mg：5～15mg。
6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述葡萄糖溶液质量分数为5％，预热至50～65℃；
所述有机相和水相的体积比为1～3：3～1。
7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述搅拌反应的条件为40～50℃下反应60min；
所述旋转蒸发仪的设置条件为60～68℃，30～40min；
所述冰浴探头超声条件为AMPL40％，工作1s休息1s，时间为10～15min。
8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述双载药纳米粒溶液和载脂蛋白A-1的用量比为3mL:100～200μg；
所述孵育的条件为在37℃下摇床孵育2天。
9.权利要求1～3任一项所述的双载药重组高密度脂蛋白纳米粒、权利要求4～8任一项所述方法制备的双载药重组高密度脂蛋白纳米粒在制备肿瘤制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括结直肠癌。
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