CN116509777B - 保湿组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及护肤品技术领域，尤其是涉及一种保湿组合物及其制备方法和应用。保湿组合物，包括石斛茎提取物和绣球菌提取物。通过采用石斛与绣球菌科学组合，通过内源促进透明质酸的生成，促进水通道蛋白AQP3表达，促进紧密连接蛋白Claudin‑1及丝聚蛋白FLG合成，从护水源、畅水渠、固水坝保湿机理途径，促进皮肤自身保湿系统运转，达到保湿功效。

Description

保湿组合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及护肤品技术领域，尤其是涉及一种保湿组合物及其制备方法和应用。
背景技术
保湿、补水为护肤基本功效需求，具备强需求、强供给特点。肌肤含水量随着年龄的增长而逐年下降，当角质层的肌肤含水量降至10％时，会使皮肤出现干燥、无光泽、弹性降低、皱纹增多等皮肤老化现象，同时会使得皮肤屏障功能减弱，使得外界有害物质更容易进入皮肤，严重的将会产生皮肤疾病。因此，保湿在化妆品护肤产品中起着不可忽视的作用。
目前保湿成分备案数排名靠前的是仿生合成类的基础成分，如透明质酸钠、尿囊素、甜菜碱、海藻糖等，植物类成分较少。由于人们对天然、无刺激、无副作用化妆品的需求日益增加，天然植物在护肤品中的开发应用受到了研究者们的关注。
皮肤保湿分为内源性保湿和外源性保湿。内源性皮肤保湿与表皮以及真皮中的许多水合成分有关，皮肤的最外层角质层是外环境和体内之间的屏障，这种屏障能够防止水分丢失以及异物入侵等。角质层水分的保持主要方式包括：角质细胞中的天然保湿因子；促进水通道蛋白AQP3生成；角质细胞间的结构。外源性保湿是通过一些保湿成分在皮肤上形成封闭层，防止水分蒸发或在皮肤中水合吸收水分和保持水分。然而，现有的具有保湿效果的天然植物类护肤品，其保湿效果主要使水分停留在肌肤上，不能够深层保湿，且保湿效果不长久，并且功效单一。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的一个目的在于提供保湿组合物，可深层解决皮肤干燥问题。
本发明的另一目的在于提供保湿组合物的制备方法。
本发明的又一目的在于提供保湿组合物在制备护肤品中的应用。
为了实现本发明的上述目的，本发明一方面提供了一种保湿组合物，包括石斛茎提取物和绣球菌提取物。
在本发明的具体实施方式中，包括按重量份数计的所述石斛茎提取物1～5份和所述绣球菌提取物1～5份。进一步的，包括按重量份数计的所述石斛茎提取物3.5～4.5份和所述绣球菌提取物3～4份；如包括按重量份数计的所述石斛茎提取物4份和所述绣球菌提取物3.5份。
在本发明的具体实施方式中，所述石斛茎提取物为石斛茎的水提物，所述绣球菌提取物为绣球菌的水提物。
在本发明的具体实施方式中，所述石斛茎提取物中，石斛多糖的分子量为10w～50wDa。进一步的，所述石斛茎提取物中的石斛多糖在液相色谱检测条件下得到的色谱图中，在保留时间为17.290～17.544min、24.154～24.748min、26.464～26.854min、28.041～28.625min、28.887～29.180min、29.385～29.949min和31.607～31.804min处具有单糖吸收峰；
所述液相色谱检测条件包括：
色谱柱型号为C18 Agilent 4.6mm×250mm，5μm；柱温为25℃；紫外检测器波长为254nm；
流动相A为0.1mol/L、pH为6.8的KH2PO4水溶液，流动相B为乙腈，以流动相A和流动相B的体积比为82﹕18进行等度洗脱，流速为1mL/min；进样量为10μL。
在本发明的具体实施方式中，所述保湿组合物中还包括透明质酸钠。进一步的，所述保湿组合物中，所述透明质酸钠的含量为0.05wt％～0.5wt％，优选为0.1wt％～0.2wt％。
在本发明的具体实施方式中，所述保湿组合物中，所述石斛茎提取物中的石斛多糖与所述透明质酸钠的质量比为(1～6)﹕1。
在本发明的具体实施方式中，所述保湿组合物还包括添加剂。
本发明另一方面提供了保湿组合物的制备方法，包括如下步骤：
石斛茎提取物和绣球菌提取物混合复配。
在本发明的具体实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：以水为提取溶剂，料液比为1﹕(10～80)(m/m)对石斛茎和绣球菌进行混合提取，将提取液进行脱色脱味、过滤处理。
在本发明的另一具体实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：以水为提取溶剂，料液比为1﹕(10～100)(m/m)对石斛茎和绣球菌分别进行提取，将提取液进行脱色脱味、过滤处理；然后将石斛茎提取物和绣球菌提取物混合复配。
在本发明的具体实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
(a)以水为提取溶剂，料液比为1﹕(10～80)(m/m)对石斛茎进行提取、脱色脱味、过滤，采用膜分离方式将提取液分离，收集分子量为10w～50wDa之间的石斛多糖提取液；
(b)采用石斛多糖提取液和水对绣球菌在料液比为1﹕(10～100)(m/m)条件下进行提取，然后将提取液进行脱色脱味、过滤处理。
在本发明的另一具体实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
(a1)以水为提取溶剂，料液比为1﹕(10～80)(m/m)对石斛茎进行提取、脱色脱味、过滤，采用膜分离方式将提取液分离，收集分子量为10w～50wDa之间的石斛多糖提取液；
(b1)采用水对绣球菌在料液比为1﹕(10～80)(m/m)条件下进行提取，然后将提取液进行脱色脱味、过滤处理，得到绣球菌提取物；
(c1)将所述石斛多糖提取液与所述绣球菌提取物混合复配。
在本发明的具体实施方式中，所述提取的温度为40～90℃；所述提取的时间1～4h。
在本发明的具体实施方式中，所述脱色脱味包括：在所述提取液中添加活性炭或双氧水进行处理，收集滤液。
在本发明的具体实施方式中，在所述提取前，对所述绣球菌进行高温微压或水蒸气处理。
在本发明的具体实施方式中，还包括：将所述石斛茎提取物和所述绣球菌提取物的混合物与透明质酸钠按比例混合，进行均质、微波、超声和/或微压处理。
在本发明的另一具体实施方式中，还包括：将所述石斛茎提取物与透明质酸钠按比例混合，进行均质、微波、超声和/或微压处理，然后再与所述绣球菌提取物混合。
在本发明的具体实施方式中，所述均质的条件包括：转速为2000～5000rpm，均质时间为5～30min；所述微压的条件包括：温度为110～121℃，计示压力为0.05～0.13MPa，微压时间为5～20min；所述微波的条件包括：微波功率为200～800w，微波时间为5～20min；所述超声的条件包括：超声功率为50～400W，超声温度为30～60℃，超声时间为5～20min。
本发明又一方面提供了上述任意一种所述保湿组合物在制备护肤品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明的保湿组合物，通过采用石斛与绣球菌科学组合，通过内源促进透明质酸的生成，促进水通道蛋白AQP3表达，促进紧密连接蛋白Claudin-1及丝聚蛋白FLG合成，从护水源、畅水渠、固水坝保湿机理途径，促进皮肤自身保湿系统运转，达到保湿功效；
(2)本发明的保湿组合物，利用石斛与透明质酸钠经过超分子多糖组装，精准促进AQP3高表达的同时，形成“DHA网”，实现捕水、缓释、深透；
(3)本发明对石斛多糖中不同分子量多糖进行分离纯化，并与透明质酸钠进行超分子组合，通过保湿相关功效测试试验、肤感测评，该组合具有协同增效作用；
(4)本发明的保湿组合物可有效提升皮肤弹性，改善细纹，紧致肌肤，具有以水抗初痕功效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明不同样品的保湿率测试结果；
图2为本发明实施例2、4～7的样品的保湿率测试结果；
图3为本发明不同样品的人体保湿测试结果；
图4为本发明实施例2、4～7的样品的人体保湿测试结果；
图5为本发明透明质酸钠和石斛多糖的单一溶液及组合溶液的流变测试结果；
图6为本发明的透明质酸钠和石斛多糖单一样品及组合样品的红外光谱图；
图7为本发明的透明质酸钠和石斛多糖单一样品及组合样品的高斯拟合结果显示的分子间氢键比例；
图8为本发明的透明质酸钠和石斛多糖的单一样品及组合样品的吸湿率测试结果；
图9为本发明的人体测试中眼角皱纹变化的测试结果；
图10为本发明的实施例5的步骤(3)得到的石斛多糖提取液的液相色谱图。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明一方面提供了一种保湿组合物，包括石斛茎提取物和绣球菌提取物。
本发明的保湿组合物，通过采用石斛与绣球菌科学组合，通过内源促进透明质酸的生成，促进水通道蛋白AQP3表达，促进紧密连接蛋白Claudin-1及丝聚蛋白FLG合成，从护水源、畅水渠、固水坝保湿机理途径，促进皮肤自身保湿系统运转，达到保湿功效。
在本发明的具体实施方式中，包括按重量份数计的所述石斛茎提取物1～5份和所述绣球菌提取物1～5份。
如在不同实施方式中，所述保湿组合物中，按重量份数计，可以示例性的包括所述石斛茎提取物1份、1.5份、2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份、5份等，可以示例性的包括所述绣球菌提取物1份、1.5份、2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份、5份等。
在本发明的具体实施方式中，所述保湿组合物包括按重量份数计的所述石斛茎提取物3.5～4.5份和所述绣球菌提取物3～4份。优选的，所述保湿组合物包括按重量份数计的所述石斛茎提取物4份和所述绣球菌提取物3.5份。
需要说明的是，本发明的保湿组合物中，石斛茎提取物和绣球菌提取物的用量分别是以所使用的原料石斛茎和绣球菌的用量计算的。
通过采用上述配比的石斛茎和绣球菌进行提取，更有助于通过内源促进透明质酸的生成，促进水通道蛋白AQP3表达，促进紧密连接蛋白Claudin-1及丝聚蛋白FLG合成。
在本发明的具体实施方式中，所述石斛茎提取物为石斛茎的水提物，所述绣球菌提取物为绣球菌的水提物。
在本发明的具体实施方式中，所述石斛茎提取物中，石斛多糖的分子量为10w～50wDa。
如在不同实施方式中，所述石斛多糖的分子量可以示例性的为10wDa、15wDa、20wDa、25wDa、30wDa、35wDa、40wDa、45wDa、50wDa或任意两个数值之间的范围等。
采用上述分子量范围内的石斛多糖，通过保湿相关功效测试试验、肤感测评等验证可知，具有最优的促进AQP3表达效果及肤感。
在本发明的具体实施方式中，所述石斛茎提取物中的石斛多糖在液相色谱检测条件下得到的色谱图中，在保留时间为17.290～17.544min、24.154～24.748min、26.464～26.854min、28.041～28.625min、28.887～29.180min、29.385～29.949min和31.607～31.804min处具有单糖吸收峰；
所述液相色谱检测条件包括：色谱柱型号为C18 Agilent 4.6mm×250mm，5μm；柱温为25℃；紫外检测器波长为254nm；
流动相A为0.1mol/L、pH为6.8的KH2PO4水溶液，流动相B为乙腈，以流动相A和流动相B的体积比为82﹕18进行等度洗脱，流速为1mL/min；进样量为10μL。
在本发明的具体实施方式中，所述石斛茎提取物在液相色谱检测进样前进行预处理；所述预处理包括：
(1)称取适量石斛茎提取物，加1mL水和4mol/L三氟乙酸水溶液1mL，充氮，110℃水解5h，然后冷却至室温，取0.1mL于容器中，60℃干燥2h；
(2)向干燥后的容器中加入0.05mL 0.3mol/L NaOH水溶液、0.05mL PMP甲醇溶液，充氮，70℃处理1h，然后冷却至室温，加0.5mL 0.3mol/L HCl水溶液、0.75mL水、1.5mL氯仿，振荡摇匀后静置分层，弃去下层氯仿，如此反复萃取三次，水层过0.45μm滤膜，上机测定。
在本发明的具体实施方式中，所述石斛茎提取物(石斛多糖的分子量为10w～50wDa)中，石斛多糖至少包括甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖。进一步的，所述石斛多糖中，至少包括按重量份数计的甘露糖77～78份、半乳糖醛酸0.05～0.1份、葡萄糖18～25份、半乳糖0.5～1份、木糖0.2～0.6份、阿拉伯糖0.05～0.1份和岩藻糖0.05～0.1份。
单糖分子是多糖的基础组成部分，经过缩合、失水形成多糖。在单糖组成与活性的联系中，研究发现，多糖的功能活性与其单糖组成具有直接与间接的联系。如多糖的免疫刺激活性、抗氧化活性等均受到单糖相对含量的影响。根据分析可知，本发明的石斛提取物的石斛多糖中，单糖组成以甘露糖、葡萄糖为主，此外还含有半乳糖醛酸、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖等。
在本发明的具体实施方式中，所述保湿组合物中还包括透明质酸钠。进一步的，所述保湿组合物中，所述透明质酸钠的含量为0.05wt％～0.5wt％，优选为0.1wt％～0.2wt％。
如在不同实施方式中，所述透明质酸钠的含量可以示例性的为0.05wt％、0.1wt％、0.15wt％、0.2wt％、0.25wt％、0.3wt％、0.35wt％、0.4wt％、0.45wt％、0.5wt％等。
在本发明的具体实施方式中，所述透明质酸钠的分子量为1000Da～200wDa。
如在不同实施方式中，所述透明质酸钠的分子量可以示例性的为1000Da、5000Da、1wDa、5wDa、10wDa、20wDa、50wDa、100wDa、200wDa或任意两个数值之间的范围等。
采用透明质酸钠，能够与石斛多糖形成超分子作用，形成相应的网络结构，能够显著改善捕水、缓释、深透的作用。
在本发明的具体实施方式中，所述保湿组合物中，所述石斛茎提取物中的石斛多糖与所述透明质酸钠的质量比为(1～6)﹕1。
如在不同实施方式中，所述石斛茎提取物中的石斛多糖与所述透明质酸钠的质量比可以示例性
石斛茎提取物中的石斛多糖与透明质酸钠的质量比在上述范围内，能够更好的实现协同增效作用，显著提高保湿效果。
在本发明的具体实施方式中，所述保湿组合物还包括添加剂。进一步的，所述添加剂包括多元醇和/或防腐剂。所述多元醇包括甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇或护肤品中常用的其它多元醇中的至少一种；所述防腐剂包括苯氧乙醇、乙基己基甘油或护肤品中其它常用的防腐剂中的至少一种。
如在不同实施方式中，可以采用甘油、戊二醇和己二醇的组合，或者采用甘油、苯氧乙醇和乙基己基甘油的组合。
在本发明的具体实施方式中，所述保湿组合物中，所述甘油的含量为0wt％～50wt％，如10wt％～25wt％；所述保湿组合物中，戊二醇、己二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油的含量分别为1wt％～3wt％、0.5wt％～2wt％、0.45wt％～0.63wt％、0.05wt％～0.07wt％。
如在不同实施方式中，所述保湿组合物中，所述甘油的含量可以示例性的为0wt％、10wt％、15wt％、20wt％、25wt％、30wt％、35wt％、40wt％、45wt％、50wt％等；保湿组合物中的其余添加剂的用量可根据实际情况进行调整。
在本发明的具体实施方式中，所述石斛包括铁皮石斛。
本发明另一方面提供了保湿组合物的制备方法，包括如下步骤：
石斛茎提取物和绣球菌提取物混合复配。
在本发明的具体实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：以水为提取溶剂，料液比为1﹕(10～80)(m/m)对石斛茎和绣球菌进行混合提取，将提取液进行脱色脱味、过滤处理。
上述实施方式，是以水为提取溶剂，对石斛茎和绣球菌混合提取。如在不同实施方式中，所述料液比可以示例性的为1﹕10(m/m)、1﹕20(m/m)、1﹕30(m/m)、1﹕40(m/m)、1﹕50(m/m)、1﹕60(m/m)、1﹕70(m/m)、1﹕80(m/m)等。
在本发明的另一具体实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：以水为提取溶剂，料液比为1﹕(10～100)(m/m)对石斛茎和绣球菌分别进行提取，将提取液进行脱色脱味、过滤处理；然后将石斛茎提取物和绣球菌提取物混合复配。
上述实施方式，是以水为提取溶剂，对石斛茎和绣球菌分别提取，得到相应的石斛茎提取物和绣球菌提取物，再进行混合复配。如在不同实施方式中，所述料液比可以示例性的为1﹕10(m/m)、1﹕20(m/m)、1﹕30(m/m)、1﹕40(m/m)、1﹕50(m/m)、1﹕60(m/m)、1﹕70(m/m)、1﹕80(m/m)、1﹕90(m/m)、1﹕100(m/m)等。
在本发明的具体实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
(a)以水为提取溶剂，料液比为1﹕(10～80)(m/m)对石斛茎进行提取、脱色脱味、过滤，采用膜分离方式将提取液分离，收集分子量为10w～50wDa之间的石斛多糖提取液；
(b)采用石斛多糖提取液和水对绣球菌在料液比为1﹕(10～100)(m/m)条件下进行提取，然后将提取液进行脱色脱味、过滤处理。
上述实施方式，是以水为提取溶剂，先对石斛茎进行提取，将石斛茎提取物进行膜分离，收集分子量为10w～50wDa之间的石斛多糖提取液；然后将石斛多糖提取液和水作为提取溶剂再对绣球菌进行提取。如在不同实施方式中，步骤(a)中，所述料液比可以示例性的为1﹕10(m/m)、1﹕20(m/m)、1﹕30(m/m)、1﹕40(m/m)、1﹕50(m/m)、1﹕60(m/m)、1﹕70(m/m)、1﹕80(m/m)等；步骤(b)中，所述料液比可以示例性的为1﹕10(m/m)、1﹕20(m/m)、1﹕30(m/m)、1﹕40(m/m)、1﹕50(m/m)、1﹕60(m/m)、1﹕70(m/m)、1﹕80(m/m)、1﹕90(m/m)、1﹕100(m/m)等。
其中，需要说明的是，步骤(b)中，采用石斛多糖提取液和水共同作为提取溶剂对绣球菌进行提取，料液比是指绣球菌相对于石斛多糖提取液和水的质量和的比例。
在本发明的另一具体实施方式中，所述制备方法包括如下步骤：
(a1)以水为提取溶剂，料液比为1﹕(10～80)(m/m)对石斛茎进行提取、脱色脱味、过滤，采用膜分离方式将提取液分离，收集分子量为10w～50wDa之间的石斛多糖提取液；
(b1)采用水对绣球菌在料液比为1﹕(10～80)(m/m)条件下进行提取，然后将提取液进行脱色脱味、过滤处理，得到绣球菌提取物；
(c1)将所述石斛多糖提取液与所述绣球菌提取物混合复配。
上述实施方式，是以水为提取溶剂，先对石斛茎进行提取，将石斛茎提取物进行膜分离，收集分子量为10w～50wDa之间的石斛多糖提取液；然后以水作为提取溶剂对绣球菌进行提取，得到绣球菌提取液；再将石斛多糖提取液与绣球菌提取物复配。如在不同实施方式中，步骤(a1)和步骤(b1)中，所述料液比分别可以示例性的为1﹕10(m/m)、1﹕20(m/m)、1﹕30(m/m)、1﹕40(m/m)、1﹕50(m/m)、1﹕60(m/m)、1﹕70(m/m)、1﹕80(m/m)等。
在本发明的具体实施方式中，所述提取的温度为40～90℃；所述提取的时间1～4h。
如在不同实施方式中，所述提取的温度可以示例性的为40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃等；所述提取的时间可以示例性的为1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h等。
在本发明的具体实施方式中，在所述提取前，将提取溶剂和石斛茎，或提取溶剂、石斛茎和绣球菌的混合物，在常温搅拌20～60min。
如在不同实施方式中，在常温搅拌的时间可以示例性的为20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min等。
在本发明的具体实施方式中，所述脱色脱味包括：在所述提取液中添加活性炭或双氧水进行处理，收集滤液。进一步的，所述活性炭的添加量为所述提取液的0.1wt％～2wt％；所述双氧水的添加量为所述提取液的0.01wt％～1wt％。
在本发明的具体实施方式中，在所述提取前，对所述绣球菌进行高温微压或水蒸气处理。进一步的，所述高温微压处理包括：于温度为110～121℃，计示压力为0.05～0.13MPa，微压时间为5～20min；所述水蒸气处理包括：于90～100℃蒸5～20min。
在本发明的具体实施方式中，在所述提取前，将所述石斛茎粉碎过筛，取筛下物。
在本发明的具体实施方式中，所述过滤处理包括：粗滤和精滤。进一步的，所述粗滤包括纸板过滤；所述精滤包括纸板过滤和硅藻土过滤。
在实际操作中，所述粗滤中的纸板过滤可以为F100纸板过滤；在所述粗滤后，将粗滤液冷却至35℃以下，再进行精滤。所述精滤中，纸板过滤可以为H70纸板过滤。
在本发明的具体实施方式中，还包括：将所述石斛茎提取物和所述绣球菌提取物的混合物与透明质酸钠按比例混合，进行均质、微波、超声和/或微压处理。在实际操作中，向所述过滤处理得到的精滤液中复配透明质酸钠；还包括，向所述精滤液中复配甘油等多元醇。
在本发明的另一具体实施方式中，还包括：将所述石斛茎提取物与透明质酸钠按比例混合，进行均质、微波、超声和/或微压处理，然后再与所述绣球菌提取物混合。其中，所述石斛茎提取物可为未进行膜分离的石斛茎提取物，或进行膜分离的石斛多糖提取液。
在实际操作中，可将透明质酸钠和甘油一同与精滤液复配，然后进行后续均质、微波、超声和/或微压处理；或在加入绣球菌提取物混合后，再加入甘油进行复配。
在本发明的具体实施方式中，所述均质的条件包括：转速为2000～5000rpm，均质时间为5～30min；所述微压的条件包括：温度为110～121℃，计示压力为0.05～0.13MPa，微压时间为5～20min；所述微波的条件包括：微波功率为200～800W，微波时间为5～20min；所述超声的条件包括：超声功率为50～400W，超声温度为30～60℃，超声时间为5～20min。
如在不同实施方式中，所述均质中，转速可以示例性的为2000rpm、2500rpm、3000rpm、3500rpm、4000rpm、4500rpm、5000rpm等，均质时间可以示例性的为5min、8min、10min、12min、15min、18min、20min、25min、30min等；所述微压中，温度可以示例性的为110℃、112℃、115℃、118℃、120℃、121℃等，计示压力可以示例性的为0.05MPa、0.06MPa、0.08MPa、0.1MPa、0.11MPa、0.12MPa、0.13MPa等，微压时间可以示例性的为5min、8min、10min、12min、15min、18min、20min等；所述微波中，微波功率可以示例性的为200W、300W、400W、500W、600W、700W、800W等，微波时间为可以示例性的为5min、8min、10min、12min、15min、18min、20min等；所述超声中：超声功率可以示例性的为50W、100W、150W、200W、250W、300W、350W、400W等，超声温度可以示例性的为30℃、40℃、50℃、60℃等，超声时间可以示例性的为5min、8min、10min、12min、15min、18min、20min等。
在本发明的具体实施方式中，还包括：向均质、微波、超声和/或微压处理后的复配液中按实际需求添加丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇或化妆品中常用的其它多元醇中的任一种或多种，和/或，苯氧乙醇、乙基己基甘油或化妆品中其它常用的防腐剂中的任一种或多种，然后于80～100℃搅拌灭菌30～60min，冷却灌装。
本发明又一方面提供了上述任意一种所述保湿组合物在制备护肤品中的应用。
实施例1～7
实施例1～7提供了保湿组合物及其制备方法，保湿组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：称取绣球菌高温微压处理(110～121℃，5～20min)，铁皮石斛茎粉碎过80目筛。
(2)提取：按比例称取铁皮石斛茎和绣球菌，按料液比为1﹕10～1﹕80(m/m)的比例加入纯水，常温搅拌20～60min，然后在40～90℃提取1～4h；提取结束后，添加0.1％～2％的活性炭进行脱色脱味处理，然后采用纱布过滤，收集滤液。
(3)过滤：将步骤(2)得到的滤液采用F100纸板过滤，收集粗滤液；然后将粗滤液冷却至35℃以下，采用H70纸板+硅藻土过滤，收集精滤液。
(4)复配：向步骤(3)得到的精滤液中复配一定量甘油，得到复配液。
(5)灭菌：向步骤(4)的复配液中加入1,2-戊二醇和1,2-己二醇，或苯氧乙醇和乙基己基甘油，80～100℃(如98～100℃)搅拌灭菌30～60min(如40min)，冷却后灌装。
实施例1～7中不同步骤的参数条件见表1。
表1实施例1～7的参数条件设置
备注：表1中甘油的用量是指占复配液的质量分数，戊二醇、己二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油的用量是指占最终产品的质量分数
实施例8～10
实施例8～10提供了保湿组合物及其制备方法，保湿组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：称取绣球菌高温微压处理(110～121℃，5～20min)，铁皮石斛茎粉碎过80目筛。
(2)提取：称取铁皮石斛茎，按料液比为1﹕10～1﹕80(m/m)的比例加入纯水，常温搅拌20～60min，然后在40～90℃提取1～4h；提取结束后，添加0.1％～2％的活性炭进行脱色脱味处理，然后采用纱布过滤，收集滤液。
(3)向步骤(2)得到的滤液中补充一定量的水(滤液全部用，其余用水补足)，与绣球菌按料液比为1﹕10～1﹕100(m/m)，常温搅拌20～60min，然后在40～90℃提取1～4h；提取结束后，添加0.1％～2％的活性炭进行脱色脱味处理，然后采用纱布过滤，收集滤液。
(4)过滤：将步骤(3)得到的滤液采用F100纸板过滤，收集粗滤液；然后将粗滤液冷却至35℃以下，采用H70纸板+硅藻土过滤，收集精滤液。
(5)复配：向步骤(4)得到的精滤液中复配一定量甘油，得到复配液。
(6)灭菌：向步骤(5)的复配液中加入1,2-戊二醇和1,2-己二醇，或苯氧乙醇和乙基己基甘油，80～100℃(如98～100℃)搅拌灭菌30～60min(如40min)，冷却后灌装。
实施例8～10中不同步骤的参数条件见表2。
表2实施例8～10的参数条件设置
实施例8 实施例9 实施例10
高温微压处理 120℃，5min 110℃，20min 115℃，10min
石斛茎﹕绣球菌 1﹕1 4﹕3.5 3﹕1
料液比 1﹕10；1﹕100 1﹕40；1﹕60 1﹕80；1﹕10
常温搅拌时间/min 60；60 30；30 20；20
提取温度/℃ 90；90 60；60 40；40
提取时间/h 1；1 2；2 4；4
活性炭添加量/％ 0.1；0.1 0.5；0.5 0.3；0.3
甘油/％ 10 23 30
戊二醇/％ 3 1 /
己二醇/％ 0.5 1.5 /
苯氧乙醇/％ / / 0.63
乙基己基甘油/％ / / 0.07
备注：表2中甘油的用量是指占复配液的质量分数，戊二醇、己二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油的用量是指占最终产品的质量分数
实施例11～13
实施例11～13提供了保湿组合物及其制备方法，保湿组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：称取绣球菌高温微压处理(110～121℃，5～20min)，铁皮石斛茎粉碎过80目筛。
(2)提取：称取铁皮石斛茎，按料液比为1﹕10～1﹕80(m/m)的比例加入纯水，常温搅拌20～60min，然后在40～90℃提取1～4h；提取结束后，添加0.1％～2％的活性炭进行脱色脱味处理，然后精滤，收集滤液。
(3)膜分离：将步骤(2)得到的滤液采用10wDa及50wDa膜进行过滤，收集10w～50wDa分子量之间的石斛多糖提取液。
(4)向步骤(3)中的石斛多糖提取液中补充一定量的水(石斛多糖提取液全部用，其余用水补足)，与绣球菌按料液比为1﹕10～1﹕100(m/m)，常温搅拌20～60min，然后在40～90℃提取1～4h；添加0.1％～2％的活性炭进行脱色脱味处理，然后采用纱布过滤，收集滤液。
(5)过滤：将步骤(4)得到的滤液采用F100纸板过滤，收集粗滤液；然后将粗滤液冷却至35℃以下，采用H70纸板+硅藻土过滤，收集精滤液。
(6)复配：向步骤(5)得到的精滤液中复配一定量甘油，得到复配液。
(7)灭菌：向步骤(6)的复配液中加入1,2-戊二醇和1,2-己二醇，或苯氧乙醇和乙基己基甘油，80～100℃(如98～100℃)搅拌灭菌30～60min(如40min)，冷却后灌装。
实施例11～13中不同步骤的参数条件见表3。
表3实施例11～13的参数条件设置
实施例11 实施例12 实施例13
高温微压处理 120℃，5min 110℃，20min 115℃，10min
石斛茎﹕绣球菌 1﹕1 4﹕3.5 3﹕1
料液比 1﹕10；1﹕100 1﹕40；1﹕60 1﹕80；1﹕10
常温搅拌时间/min 60；60 30；30 20；20
提取温度/℃ 90；90 60；60 40；40
提取时间/h 1；1 2；2 4；4
活性炭添加量/％ 0.1；0.1 0.5；0.5 0.3；0.3
甘油/％ 10 23 30
戊二醇/％ 3 1 /
己二醇/％ 0.5 1.5 /
苯氧乙醇/％ / / 0.63
乙基己基甘油/％ / / 0.07
备注：表3中甘油的用量是指占复配液的质量分数，戊二醇、己二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油的用量是指占最终产品的质量分数
实施例14～16
实施例14～16提供了保湿组合物及其制备方法，保湿组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：称取绣球菌高温微压处理(110～121℃，5～20min)，铁皮石斛茎粉碎过80目筛。
(2)提取：按比例称取铁皮石斛茎和绣球菌，按料液比为1﹕10～1﹕80(m/m)的比例加入纯水，常温搅拌20～60min，然后在40～90℃提取1～4h；提取结束后，添加0.1％～2％的活性炭进行脱色脱味处理，然后采用纱布过滤，收集滤液。
(3)过滤：将步骤(2)得到的滤液采用F100纸板过滤，收集粗滤液；然后将粗滤液冷却至35℃以下，采用H70纸板+硅藻土过滤，收集精滤液。
(4)复配：向步骤(3)得到的精滤液中复配一定量甘油、0.05％～0.5％透明质酸钠，得到复配液。
(5)复配液处理：将步骤(4)的复配液置于均质机中在2000～5000rpm(如2500rpm)转速均质5～30min(如10min)。
(6)灭菌：向步骤(5)处理后的复配液中加入1,2-戊二醇和1,2-己二醇，或苯氧乙醇和乙基己基甘油等，80～100℃(如98～100℃)搅拌灭菌30～60min(如40min)，冷却灌装。
实施例14～16中不同步骤的参数条件见表4。
表4实施例14～16的参数条件设置
实施例14 实施例15 实施例16
高温微压处理 120℃，5min 110℃，20min 115℃，10min
石斛茎﹕绣球菌 1﹕1 4﹕3.5 3﹕1
料液比 1﹕10 1﹕40 1﹕80
常温搅拌时间/min 60 30 20
提取温度/℃ 90 60 40
提取时间/h 1 2 4
活性炭添加量/％ 0.1 0.5 0.3
甘油/％ 10 23 30
透明质酸钠/％ 0.5 0.15 0.05
戊二醇/％ 3 1 /
己二醇/％ 0.5 1.5 /
苯氧乙醇/％ / / 0.63
乙基己基甘油/％ / / 0.07
备注：表4中甘油、透明质酸钠的用量是指占复配液的质量分数，戊二醇、己二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油的用量是指占最终产品的质量分数
实施例17～19
实施例17～19提供了保湿组合物及其制备方法，保湿组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：称取绣球菌高温微压处理(110～121℃，5～20min)，铁皮石斛茎粉碎过筛。
(2)提取：称取铁皮石斛茎，按料液比为1﹕10～1﹕80(m/m)的比例加入纯水，常温搅拌20～60min，然后在40～90℃提取1～4h；提取结束后，添加0.1％～2％的活性炭进行脱色脱味处理，然后精滤，收集滤液。
(3)膜分离：将步骤(2)得到的滤液采用10wDa及50wDa膜进行过滤，收集10w～50wDa分子量之间的石斛多糖提取液。
(4)向步骤(3)中的石斛多糖提取液中补充一定量的水(石斛多糖提取液全部用，其余用水补足)，与绣球菌按料液比为1﹕10～1﹕100(m/m)，常温搅拌20～60min，然后在40～90℃提取1～4h；提取结束后，添加0.1％～2％的活性炭进行脱色脱味处理，然后采用纱布过滤，收集滤液。
(5)过滤：将步骤(4)得到的滤液采用F100纸板过滤，收集粗滤液；然后将粗滤液冷却至35℃以下，采用H70纸板+硅藻土过滤，收集精滤液。
(6)复配：向步骤(5)得到的精滤液中复配一定量甘油、0.05％～0.5％透明质酸钠，得到复配液。
(7)复配液处理：将步骤(6)的复配液置于均质机中在2000～5000rpm(如2500rpm)转速均质5～30min(如10min)。
(8)灭菌：向步骤(7)处理后的复配液中加入1,2-戊二醇和1,2-己二醇，或苯氧乙醇和乙基己基甘油等，80～100℃(如98～100℃)搅拌灭菌30～50min(如40min)，冷却后灌装。
实施例17～19中不同步骤的参数条件见表5。
表5实施例17～19的参数条件设置
实施例17 实施例18 实施例19
高温微压处理 120℃，5min 110℃，20min 115℃，10min
石斛茎﹕绣球菌 1﹕1 4﹕3.5 3﹕1
料液比 1﹕10；1﹕100 1﹕40；1﹕60 1﹕80；1﹕10
常温搅拌时间/min 60；60 30；30 20；20
提取温度/℃ 90；90 60；60 40；40
提取时间/h 1；1 2；2 4；4
活性炭添加量/％ 0.1；0.1 0.5；0.5 0.3；0.3
甘油/％ 10 23 30
透明质酸钠/％ 0.5 0.15 0.05
戊二醇/％ 3 1 /
己二醇/％ 0.5 1.5 /
苯氧乙醇/％ / / 0.63
乙基己基甘油/％ / / 0.07
备注：表5中甘油、透明质酸钠的用量是指占复配液的质量分数，戊二醇、己二醇、苯氧乙醇、乙基己基甘油的用量是指占最终产品的质量分数
实施例20
本实施例参考实施例18的保湿组合物的制备方法，区别仅在于：步骤(3)不同。
本实施例的步骤(3)包括：将步骤(2)得到的滤液采用1wDa及10wDa膜进行过滤，收集1w～10wDa分子量之间的石斛多糖提取液。
实施例21
本实施例参考实施例18的保湿组合物的制备方法，区别仅在于：步骤(3)不同。
本实施例的步骤(3)包括：将步骤(2)得到的滤液采用1000Da及1wDa膜进行过滤，收集1000Da～1wDa分子量之间的石斛多糖提取液。
实施例22
本实施例参考实施例15的保湿组合物的制备方法，区别仅在于：步骤(1)中不对绣球菌进行高温微压处理。
实施例23
实施例23提供了保湿组合物及其制备方法，保湿组合物的制备方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：称取绣球菌高温微压处理(110℃，20min)，铁皮石斛茎粉碎过筛；铁皮石斛茎与绣球菌的质量比为4﹕3.5。
(2)提取：称取铁皮石斛茎，按料液比为1﹕40(m/m)的比例加入纯水，常温搅拌30min，然后在60℃提取2h，然后添加0.5％的活性炭进行脱色脱味处理，然后精滤，收集滤液。
(3)膜分离：将步骤(2)得到的滤液采用10wDa及50wDa膜进行过滤，收集10w～50wDa分子量之间的石斛多糖提取液。
(4)向步骤(3)中的石斛多糖提取液复配透明质酸钠，得到复配液；将复配液置于均质机中，在2000～5000rpm(如2500rpm)转速均质5～30min(如10min)。
(5)绣球菌提取：将绣球菌按料液比为1﹕60(m/m)，常温搅拌30min，然后在60℃提取2h；提取结束后，添加0.5％的活性炭进行脱色脱味处理，然后精滤，收集滤液。
(6)复配：将步骤(4)均质处理后的复配液与步骤(5)得到的滤液混合，得到混合液，并加入23％的甘油(占混合液的质量分数)。
(7)灭菌：向步骤(6)得到的物料中加入1％的1,2-戊二醇和1.5％的1,2-己二醇(占最终产品的质量分数)，80～100℃(如98～100℃)搅拌灭菌30～50min(如40min)，冷却后灌装。
其中，步骤(4)中透明质酸钠的用量为步骤(3)中的石斛多糖提取液、步骤(5)得到的绣球菌提取物滤液和步骤(6)的甘油的质量和的0.15％。
对比例1
对比例1的制备方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：称取绣球菌高温微压处理(121℃，20min)，铁皮石斛茎粉碎过筛。
(2)提取：按质量比为4﹕3.5比例称取铁皮石斛茎和绣球菌，按料液比为1﹕40(m/m)的比例加入纯水，再加入料液质量0.15％的透明质酸钠，常温搅拌30min，然后在60℃提取2h；提取结束后，添加提取液质量0.5％的活性炭进行脱味处理，然后采用纱布过滤，收集滤液。
(3)过滤：将步骤(2)得到的滤液采用F100纸板过滤，收集粗滤液；然后将粗滤液冷却至35℃以下，采用H70纸板+硅藻土过滤，收集精滤液。
(4)复配：向步骤(3)得到的精滤液中复配23％甘油(占复配液)，得到复配液。
(5)灭菌：向步骤(4)处理后的复配液中加入1％戊二醇和1.5％己二醇(占最终产品的质量分数)，98～100℃搅拌灭菌40min，冷却至室温保存。
对比例2
对比例2的制备方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：称取铁皮石斛茎粉碎过80目筛。
(2)提取：将铁皮石斛茎按料液比为1﹕40(m/m)的比例加入纯水，常温搅拌30min，然后在60℃提取2h；提取结束后，添加0.5％的活性炭进行脱色处理，然后采用纱布过滤，收集滤液。
(3)过滤：将步骤(2)得到的滤液采用F100纸板过滤，收集粗滤液；然后将粗滤液冷却至35℃以下，采用H70纸板+硅藻土过滤，收集精滤液。
(4)复配：向步骤(3)得到的精滤液中复配23％甘油，得到复配液。
(5)灭菌：向步骤(4)的复配液中加入1％戊二醇和1.5％己二醇(占最终产品的质量分数)，如98～100℃搅拌灭菌40min，冷却后灌装。
对比例3
对比例3的制备方法包括如下步骤：
(1)原料预处理：称取绣球菌高温微压处理(110℃，20min)。
(2)提取：将绣球菌按料液比为1﹕60(m/m)的比例加入纯水，常温搅拌30min，然后在60℃提取2h；提取结束后，添加0.5％的活性炭进行脱味处理，然后采用纱布过滤，收集滤液。
(3)过滤：将步骤(2)得到的滤液采用F100纸板过滤，收集粗滤液；然后将粗滤液冷却至35℃以下，采用H70纸板+硅藻土过滤，收集精滤液。
(4)复配：向步骤(3)得到的精滤液中复配23％甘油，得到复配液。
(5)灭菌：向步骤(4)的复配液中加入1％戊二醇和1.5％己二醇(占最终产品的质量分数)，98～100℃搅拌灭菌40min，冷却后灌装。
实验例1
1、体外保湿测试
饱和盐溶液能提供恒定的湿度值。根据这一特点，将各样品置于含有醋酸钾饱和溶液(理论相对湿度为20％)的干燥器中，在放置前、放置2h、4h、8h、24h、48h、72h后称定质量，由放置前后样品的重量差来计算每个样品的保水率，保水率越大表示样品的保湿效果越好。
样品1：2％石斛提取物；样品2：2％绣球菌提取物；样品3：2％(石斛+绣球菌)提取物；空白对照：水。其中，样品1、样品2、样品3分别为采用对比例2、对比例3和实施例2得到的产品配制的，以液体产品整体计量，直接用水稀释成2wt％水溶液。
测试结果见图1，从图中可知，石斛和绣球菌复合样品的保湿效果优于单独样品，即二者复配具有协同增效作用。
参考同样方法，测试实施例2、实施例4～7的样品的保水率，测试结果见图2。从图2可知，石斛与绣球菌复合样品具有良好的保湿性，且改变组方比例及提取工艺条件在一定程度上影响组合物的保湿效果。
2、人体保湿测试
选择6名志愿者，在志愿者前臂屈侧不同部位涂抹含有3wt％(以液体产品整体计量)测试样品的啫喱，以及啫喱基质。分别在使用前、使用1h、2h、4h时，通过Corneometer皮肤水分含量测试仪，测定志愿者前臂屈侧相应部位的水分含量。通过组间对比，比较测试样品啫喱和啫喱基质之间的效果差异。水分含量变化率越高，说明补水效果越明显。
其中，3wt％不同测试样品的啫喱按质量百分数计包括：丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC)1.0％、各测试样品(实施例2、对比例2、对比例3)3％、甲基异噻唑啉酮/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(MTI)0.12％和水95.88％；
啫喱基质按质量百分数计包括：丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC)1.0％、甲基异噻唑啉酮/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(MTI)0.12％和水98.88％。
测试结果见图3(其中*表示与啫喱基质组相比具有显著性差异，p＜0.05)，从图中可知，石斛和绣球菌复合样品可显著提升人体皮肤水分含量，保湿效果优于单独样品。
参考同样方法，测试实施例2、实施例4～7的样品的保湿效果，测试结果见图4。从图4可知，石斛与绣球菌复合样品可有效提升人体皮肤水分含量。
实验例2
本发明通过膜分离技术对石斛中不同分子量的石斛多糖进行分离纯化，得到10w～50wDa、1w～10wDa、1000Da～1wDa、全段(不分离)石斛多糖四种样品，分别对应的是实施例12的步骤(3)得到的石斛多糖提取液、实施例20的步骤(3)得到的石斛多糖提取液、实施例21的步骤(3)得到的石斛多糖提取液、实施例12的步骤(2)得到的滤液。通过AQP3基因表达功效测试实验、肤感测评，定向筛分功效、肤感最优石斛多糖分子段。
1、AQP3基因表达测试
AQP3是人体皮肤中AQPs家族表达最丰富的水通道蛋白亚型，主要表达于人表皮基底层、棘细胞层、颗粒层，到角质层逐渐消失；AQP3在基底膜带的高表达，可以促使水、甘油及尿素的转运，一个AQP3分子每秒钟可以允许30亿个水分子通过，影响皮肤保湿及修护功效。
本实验先采用MTT法检测细胞活性，筛选细胞给样的最大安全浓度。通过荧光定量PCR检测各基因的表达量。其中，测试分组情况和测试结果分别见表6～表7。样品组的配制方法包括：将各分子段石斛多糖提取液按0.00781wt％加入培养液中，55～60℃加热搅拌10|～15min。
表6AQP3测试分组
表7不同分子量石斛多糖AQP3测试结果
样品 扩增倍数
空白对照 1.00
阳性对照 1.19
10w～50wDa 1.35
1w～10wDa 1.20
1000Da～1wDa 0.96
从上述测试结果可知，10w～50wDa及1w～10wDa分子量石斛多糖可促进AQP3基因表达，其中10w～50wDa石斛多糖效果较优。
2、肤感测试
不同分子量石斛多糖提取液：10w～50wDa(样品1)、1w～10wDa(样品2)、1000Da～1wDa(样品3)、全段(样品4)分别配置成5wt％水溶液，由8名试用者涂抹后对顺滑度等进行肤感评价，并进行喜好度排序。具体水溶液的配制包括：将各分子段石斛多糖提取液按5wt％加入水中，搅拌10～15min。测试结果见表8。
表8不同分子量石斛多糖肤感测试结果
试用者序号 喜好度
1 1＞4＞2＞3
2 1＞4＞2＞3
3 1＞4＞2＞3
4 1＞4＞2＞3
5 1＞4＞2＞3
6 1＞4＞2＞3
7 1＞4＞2＞3
8 1＞4＞2＞3
由表8可知，8名试用者一致认为10w～50wDa石斛多糖顺滑感最佳，其次为全段样品，且各样品间差异明显。综上，10w～50wDa石斛多糖保湿效果及肤感较优。
实验例3
1、超分子作用验证
(1)流变学测试
测试样品：
0.5％ HA：即0.5wt％透明质酸钠水溶液；
0.5％石斛多糖：即0.5wt％分子量为10w～50wDa石斛多糖(实施例18步骤(3)石斛多糖提取液的冻干粉)水溶液；
0.5％石斛多糖+HA溶液混合样品：即0.5wt％(透明质酸钠+分子量为10w～50wDa石斛多糖)水溶液(石斛多糖与HA质量比为5﹕2，石斛多糖为实施例18步骤(3)石斛多糖提取液的冻干粉)；
0.5％石斛多糖-HA超分子多糖组装样品：即将本发明实施例18步骤(3)分离得到的10w～50wDa石斛多糖提取液的冻干粉，与HA按质量比为5﹕2进行复配并溶于水中，于均质机中均质处理(2500rpm、10min)后进行冻干制备得到石斛多糖-HA超分子多糖组装产品，然后将该产品配置成0.5wt％的水溶液；
上述样品在制备中，按相应溶度分散溶解在蒸馏水中，40℃水浴加热搅拌1h，放置室温后，在振荡器中室温振荡4h。
对上述样品进行流变学测试，探究不同样品之间的黏度差异，验证超分子作用的存在测试结果见图5。
从流变测试结果可以看出，石斛多糖溶液和HA溶液粘度都很小，当两者组合后粘度显著增加，石斛多糖-HA超分子多糖组装溶液的粘度均高于同浓度下的HA、石斛多糖单一溶液。因此，石斛多糖与HA分子间存在协同作用，加剧多糖分子间氢键的聚合，导致了石斛多糖-HA超分子体系的粘度均高于同等浓度HA、石斛多糖单一多糖溶液的粘度，具有增粘的效果。溶液混合也具有增粘效果但不及超分子多糖，说明超分子多糖组装具有强的相互作用。
(2)红外光谱分析
对与流变分析相同的样品进行红外光谱表征，测试结果见图6。由于氢键的形成能够使参与形成氢键的原化学键力常数降低，吸收频率移向低波数方向，同时吸收强度增加，所以从谱图中可以看出在3000～3800cm-1处-OH位移情况，并对该范围进行高斯拟合来分析分子间氢键的类型和强度。
高斯拟合原理：因氢键强度不同，供体中O-H键存在不同程度的伸长，反映在红外光谱中即为氢键峰位不同程度的红移。利用计算机进行分峰的办法将红外光谱中互相重叠的各种氢键的吸收峰用高斯拟合分开，并同时得到这些氢键的强度和位置。
从红外结果可以看出石斛多糖在3361cm-1出现一个强而宽的吸收峰为多糖分子内或分子间—OH的伸缩振动吸收峰；在2932cm-1和2882cm-1的吸收峰为甲基和亚甲基C—H振动吸收峰，此两处吸收峰为石斛多糖的特征吸收峰。此外，在1730cm-1、1374cm-1和1241cm-1的吸收峰分别归属于—O—COCH3结构中的C＝O、—CH和C—O的伸缩振动吸收峰。870和806cm-1两处吸收峰的出现表明有甘露吡喃糖苷键存在。
HA光谱3280cm-1出现一个强而宽的吸收峰为—OH的伸缩振动吸收峰；在1610和1406cm-1处有吸收带,这些分别是羧酸C＝O不对称拉伸振动和羧酸C-O对称拉伸的指示性带。在1152和1029cm-1处的条带是HA骨架的C-O-C伸缩振动。在1560和1322cm-1处的两个信号表明有酰胺带；
石斛多糖-HA超分子组装在3300左右出现的—OH的伸缩振动吸收峰出现红移，在1600左右C＝O吸收峰出现红移，均说明该物质存在分子间氢键作用；1700cm-1和1600cm-1处吸收峰相对强度发生变化。
体系中氢键的比例越高，体系中分子间的相互作用越强，图7为高斯拟合结果显示的样品的分子间氢键比例，从图7可知高斯拟合结果显示超分子多糖组装的分子间氢键比例为94.92％，与HA和DOP相比分子间氢键的比例显著增加。因此表明，石斛多糖与HA之间存在协同作用。而石斛多糖-HA超分子多糖组装和石斛多糖+HA溶液混合有明显区别，超分子多糖组装分子间的作用力更强。
2、超分子组合功效提升
通过体外吸湿测试，探究石斛多糖、透明质酸钠，及石斛多糖+透明质酸钠溶液混合、石斛多糖-HA超分子多糖组装样品在高湿环境下的吸湿效果，验证超分子样品的功效。
样品1：透明质酸钠；
样品2：分子量为10w～50wDa石斛多糖(实施例18步骤(3)的石斛多糖提取液进行干燥处理)；
样品3：石斛多糖+HA溶液混合(实施例18步骤(3)的石斛多糖提取液的冻干粉与HA按质量比为5﹕2在溶液中混合后干燥处理)；
样品4：石斛多糖-HA超分子多糖组装(实施例18步骤(3)的石斛多糖提取液的冻干粉，与HA按质量比为5﹕2进行复配并溶于水中，于均质机中均质处理(2500rpm、10min)后进行干燥处理)。
以上样品(设置3个平行)，将样品烘干至恒重后置于含有硫酸铵饱和溶液(理论相对湿度为85％)的干燥器中，在设定的时间点0、2、4、8h称量其质量并记录，根据样品前后质量检测样品的吸湿率。测试结果见图8。从图8可知，在8h内，样品4的吸湿效果显著优于样品1、样品2和样品3，即石斛多糖和透明质酸钠两者超分子样品具有协同增效作用。
实验例4
1、极端干燥环境保湿
(1)人体寒冷干燥环境测试
测试方法：每组选择5～8名志愿者，在温度20～22℃、相对湿度40～60％环境下静坐30min后采集使用前皮肤水分含量本底值。每组测试人员在面部左右两侧分别涂抹测试样品及样品基质，使用样品后开始计时，在使用样品后0.5h、2.5h、3h、5h采集皮肤水分含量。评估本发明的保湿组合物在北方冬季寒冷干燥环境下保湿效果，测试结果见表9。
5h的测试周期内，受试者在冷热交替环境中循环2个周期，每个循环周期的2.5h内，在冷环境(冬天室外，温度-10～-2℃)中待0.5h，然后在温度20～22℃、相对湿度40～60％环境下静坐2h，每次转换环境后采集皮肤数据，同此操作循环2个周期。
测试样品配成5wt％测试样品(以液体产品整体计量)啫喱进行测试。
其中，5wt％测试样品啫喱按质量百分数计包括：丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物(AVC)1.0％、各样品(实施例1～3、实施例8～19、实施例22～23或对比例1)5.0％、甲基异噻唑啉酮/碘丙炔醇丁基氨甲酸酯(MTI)0.12％和水93.88％；
啫喱基质同实验例1。
表9皮肤水分含量变化率测试结果
在5h的测试周期内，本发明保湿组合物可有效提升皮肤水分含量，具有保湿功效。
(2)极端干燥部位-小腿
干燥的肌肤在纹路间隙常伴有翘起的鳞屑，肌肤外表看上去干涩、粗糙，缺乏润感。通过检测对肌肤鳞屑、平滑度的影响，评估保湿滋润功效。
选取15～20名肌肤干燥的志愿者(中老年人)，受试部位为小腿外侧。将样品涂抹于小腿外侧，分别在涂抹前、涂抹后1h、2h、4h用VisioScan VC98皮肤显微镜(德国CK公司)采集志愿者测试区域的图像，并进行皮肤表面纹理分析，得到皮肤磷屑指数SEsc(Sesc数值越小，表示皮肤鳞屑越少)和皮肤平滑度指数Sesm(越小皮肤越光滑)。
测试样品同“人体寒冷干燥环境测试”中的测试样品。测试结果见表10。
表10皮肤磷屑、平滑度测试结果
从上述测试结果可知，本发明的保湿组合物可降低小腿磷屑指数及平滑度指数，有效改善小腿鳞屑、粗糙。
(3)细胞干燥损伤模型
测试方法：本实验先采用MTT法检测细胞活性，筛选细胞给样的最大安全浓度。当表皮细胞生长至融合率达80％以上时，加入不含小牛血清的MEM培养基作同步化处理12h，胰酶消化收集，计数后调整细胞浓度，接种至24孔培养板。待细胞贴壁后，加入含待测样品的培养基中进行孵育。24h后，在干燥风速0.4m/s洁净工作台内放置10min后，加入新鲜培养基，继续培养24h，进行MTT测定。实验中以不做任何处理组作为空白对照组。按以下公式计算细胞防护率(％)。
细胞干燥死亡率(％)＝(1-检测组OD值/正常组OD值)×100％
细胞防护率(％)＝(空白组细胞干燥死亡率－样品组细胞干燥死亡率)/空白组细胞干燥死亡率×100％
测试样品：0.0313％测试样品溶液(样品以液体形式加入培养基中溶解得到相应浓度)、空白对照。测试结果见表11。
表11细胞干燥损伤测试结果
从上述测试结果可知，本发明的保湿组合物可提升细胞抵抗干燥、防止脱水死亡的能力，具有抗干燥损伤/保湿的功效。
2、以保湿超越保湿
(1)人体测试
采用皮肤弹性测试仪Cutometer(MPA580，Courage and Khazaka，德国)测试样品使用前后皮肤弹性变化，通过数字光学三维图像分析仪EvaSKIN(EOTECH，法国)测试眼部皱纹的变化，评价样品保湿超越保湿功效。
测试部位：面部-半脸对照测试(25～30岁)；
测试人数：每组5～8人；
测试样品配成5wt％测试样品乳液进行测试；
测试时间点：0、2h、4h、8h。
其中，5wt％测试样品乳液及乳液基质组成如下表12。
表12乳液配方组成(质量百分数)
测试结果见表13和图9(为实施例18对应的样品的乳液实验结果)。
表13皮肤弹性测试结果
从上述测试结果可知，本发明的保湿组合物可改善皮肤细纹，提升皮肤弹性，具有保湿超越保湿功效。
(2)促进HAS1、HAS2、HAS3表达测试
真皮层的透明质酸能吸收大量水分，像皮肤的储水库，为整个皮肤的水润提供储备，同时也填充真皮层，使真皮层结构更加完整。采用角质形成细胞模型，评价样品促进透明质酸合成酶HAS1、2、3及透明质酸合成的效果，从而内源促进人体自身水源生成，促进自身保湿机能运转，并填充肌肤，增强抗初痕能力。
测试样品：对比例3步骤(3)得到的精滤液、实施例2步骤(3)得到的精滤液、实施例4～7步骤(3)得到的精滤液；样品组配制方法：将各精滤液按照浓度添加培养液溶解稀释得到相应工作液。
本实验先采用MTT法检测细胞活性，筛选细胞给样的最大安全浓度。通过荧光定量PCR检测各基因的表达量。具体测试分组见表14。
表14HAS1、HAS2、HAS3测试分组
测试方法：
①接种：按2.5×105个/孔的接种密度接种细胞至6孔板，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育过夜。
②配液：按照测试分组(表14)配置受试物工作液。
③给药：根据表14测试分组，待6孔板中细胞铺板率达到40％～60％时，进行分组给药，每孔给药量为2mL，每组设3个复孔，培养箱(37℃、5％CO2)中孵育24h。
④收集细胞：培养24h后，吸弃旧液，PBS清洗两次，每孔加入1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收样。
⑤基因表达检测：提取RNA，反转录至cDNA后，进行荧光定量PCR检测，采用2-△△CT方法进行结果计算。
⑥结果统计分析：应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用t-test统计分析。统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
测试结果见表15。
表15HAS1、HAS2、HAS3基因测试结果
从上述测试结果可知，本发明的石斛与绣球菌复合样品可显著上调HAS1、HAS2和HAS3基因表达，进而促进皮肤中透明质酸含量升高，增强皮肤保湿能力。
(3)促进AQP3表达、促进紧密连接蛋白Claudin-1、促进丝聚蛋白FLG合成
本实验先采用MTT法检测细胞活性，筛选细胞给样的最大安全浓度。通过荧光定量PCR检测各基因的表达量。其中，测试分组情况和测试结果分别见表16～表17。
表16AQP3、FLG、Claudin-1测试分组
表17不同样品AQP3、FLG、Claudin-1测试结果
(4)单糖组成
前处理方法：
①称取适量样品于水解管中，加1mL水，加4mol/L三氟乙酸水溶液1mL，充氮，110℃烘箱中水解5h，取出后冷却至室温，取0.1mL于4mL离心管中，在60℃真空干燥箱中干燥2h；
②向干燥后的4mL离心管中加入0.05mL 0.3mol/L NaOH水溶液、0.05mL PMP甲醇溶液，充氮，70℃水浴60min，取出后冷却至室温，加0.5mL 0.3mol/L HCl水溶液、0.75mL水、1.5mL氯仿，振荡摇匀后静置分层，弃去下层氯仿，如此反复萃取三次，水层过0.45μm滤膜，上机测定。
仪器方法：
①数据采集仪器系统包括Agilent 1200，检测器：紫外检测器。
②色谱柱：C18 Agilent 4.6mm*250mm*5μm；
③流动相A：0.1mol/L KH2PO4水溶液(pH6.8)，流动相B：乙腈；
④流动相梯度：A﹕B＝82﹕18，等度洗脱；
⑤流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：254nm。
实施例12的步骤(3)的测试结果见表18和图10。
表18单糖组成测试结果
名称 保留时间/min 含量mg/kg
甘露糖 17.290～17.544 728230.00
半乳糖醛酸 24.154～24.748 715.00
葡萄糖 26.464～26.854 200125.00
半乳糖 28.041～28.625 6925.00
木糖 28.887～29.180 3780.00
阿拉伯糖 29.385～29.949 645.00
岩藻糖 31.607～31.804 715.00
从上述测试结果可知，石斛与绣球菌复合样品可显著上调AQP3基因表达，可增强水分转运能力，从而提高皮肤保湿功效；同时还可显著上调FLG和Claudin-1基因表达，具有强化锁水屏障的功效。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (16)

1.保湿组合物，其特征在于，包括按重量份数计的石斛茎提取物1~5份和绣球菌提取物1~5份；所述石斛茎提取物为石斛茎的水提物，所述绣球菌提取物为绣球菌的水提物；
所述石斛茎提取物中，石斛多糖的分子量为10w~50wDa；
所述石斛茎提取物在液相色谱检测条件下得到的色谱图中，在保留时间为17.290~17.544min、24.154~24.748min、26.464~26.854min、28.041~28.625min、28.887~29.180min、29.385~29.949min和31.607~31.804min处具有单糖吸收峰；
所述液相色谱检测条件包括：
色谱柱型号为C18 Agilent 4.6mm×250mm，5μm；
柱温为25℃；
紫外检测器波长为254nm；
流动相A为0.1mol/L、pH为6.8的KH2PO4水溶液，流动相B为乙腈，以流动相A和流动相B的体积比为82﹕18进行等度洗脱，流速为1mL/min；
进样量为10μL；
所述石斛为铁皮石斛；
所述保湿组合物的制备方法，包括如下步骤：
石斛茎提取物和绣球菌提取物混合复配；
（a）以水为提取溶剂，料液比为1﹕（10~80）对石斛茎进行提取、脱色脱味、过滤，采用膜分离方式将提取液分离，收集分子量为10w~50wDa之间的石斛多糖提取液；
（b）采用石斛多糖提取液和水对绣球菌在料液比为1﹕（10~100）的条件下进行提取，然后将提取液进行脱色脱味、过滤处理；
或者，包括如下步骤：
（a1）以水为提取溶剂，料液比为1﹕（10~80）对石斛茎进行提取、脱色脱味、过滤，采用膜分离方式将提取液分离，收集分子量为10w~50wDa之间的石斛多糖提取液；
（b1）采用水对绣球菌在料液比为1﹕（10~80）条件下进行提取，然后将提取液进行脱色脱味、过滤处理，得到绣球菌提取物；
（c1）将所述石斛多糖提取液与所述绣球菌提取物混合复配；
在所述提取前，对所述绣球菌进行高温微压处理；所述高温微压处理包括：温度为110~121°C，计示压力为0.05~0.13MPa，微压时间为5~20min。
2.根据权利要求1所述的保湿组合物，其特征在于，包括按重量份数计的所述石斛茎提取物3.5~4.5份和所述绣球菌提取物3~4份。
3.根据权利要求2所述的保湿组合物，其特征在于，包括按重量份数计的所述石斛茎提取物4份和所述绣球菌提取物3.5份。
4.根据权利要求1~3任一项所述的保湿组合物，其特征在于，还包括透明质酸钠。
5.根据权利要求4所述的保湿组合物，其特征在于，所述保湿组合物中，所述透明质酸钠的含量为0.05wt%~0.5wt%。
6.根据权利要求4所述的保湿组合物，其特征在于，所述保湿组合物中，所述透明质酸钠的含量为0.1wt%~0.2wt%。
7.根据权利要求4所述的保湿组合物，其特征在于，所述石斛茎提取物中的石斛多糖与所述透明质酸钠的质量比为（1~6）﹕1。
8.根据权利要求1所述的保湿组合物，其特征在于，还包括多元醇和/或防腐剂。
9.根据权利要求1所述的保湿组合物，其特征在于，所述提取的温度为40~90℃；所述提取的时间1~4h。
10.根据权利要求1所述的保湿组合物，其特征在于，所述脱色脱味包括：在所述提取液中添加活性炭或双氧水进行处理，收集滤液。
11.根据权利要求1所述的保湿组合物，其特征在于，还包括：将所述石斛茎提取物和所述绣球菌提取物的混合物与透明质酸钠按比例混合，进行均质、微波、超声和/或微压处理；
或者，还包括：将所述石斛茎提取物与透明质酸钠按比例混合，进行均质、微波、超声和/或微压处理，然后再与所述绣球菌提取物混合。
12.根据权利要求11所述的保湿组合物，其特征在于，所述均质的条件包括：转速为2000~5000rpm，均质时间为5~30min。
13.根据权利要求11所述的保湿组合物，其特征在于，所述微压的条件包括：温度为110~121℃，计示压力为0.05~0.13MPa，微压时间为5~20min。
14.根据权利要求11所述的保湿组合物，其特征在于，所述微波的条件包括：微波功率为200~800w，微波时间为5~20min。
15.根据权利要求11所述的保湿组合物，其特征在于，所述超声的条件包括：超声功率为50~400W，超声温度为30~60℃，超声时间为5~20min。
16.权利要求1~15任一项所述的保湿组合物在制备护肤品中的应用。
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