CN116497145A - 一种果生炭疽菌rpa检测引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物病害检测技术领域，具体涉及一种果生炭疽菌RPA检测的特异性引物及其应用。本发明通过引物设计获得了针对果生炭疽菌RPA检测的特异性引物，并且建立了基于RPA的检测体系、试剂、试剂盒。本发明的果生炭疽菌RPA检测体系与其他常见病原菌均无交叉反应，特异性强，检测灵敏度达到10pg/μL，不需要PCR仪等热循环设备，操作简单，尤其适合在基层或者实验条件不足的实验室进行果生炭疽菌的快速检测，对果生炭疽菌的早期检测和口岸检验检疫具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物病害检测技术领域，具体涉及一种果生炭疽菌RPA检测的特异性引物及其应用。
背景技术
果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)是一种常见的致病菌，在咖啡属、柑橘属、梨属、杧果属、苹果属和山茶属等多种植物上被报道，且具有广泛的地域和物种多样性，在世界范围内均有危害报道。仅仅依赖形态学特征或者是PCR分子检测、单基因构建系统发育树等方法均很难对其进行准确鉴定，而采用传统的植物病害检测方法直接观察，会遗漏发病初期未表现出症状的情况，且易受到人为因素和环境条件的干扰，加之耗时长，程序繁琐，需要专业技术人员和仪器设备，并不适合快速检测的要求。CN202010673672.4公开了一种果生炭疽菌特异性基因序列及其应用，其通过基因组聚类分析获得果生炭疽菌的特异性序列，进而设计了引物进行PCR扩增检测，但是该方法需要专业设备，检测速度慢，检测的灵敏度不高。因此，研究快速简便的检测方法对果生炭疽菌的早期检测和口岸检验检疫具有现实意义。
重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)技术是一种在恒温条件下短时反应就可以扩增出检测产物的新型恒温扩增技术，具有反应快速、灵敏性好、特异性高等特点，且不需要昂贵的变温实验仪器，被认为是一种可以替代PCR的新型核酸扩增技术，该技术的关键在于特异性引物的设计，目前对于果生炭疽菌的RPA检测方法尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对果生炭疽菌(Colletotrichum fructicola)的RPA快速检测的问题，提供一种针对果生炭疽菌RPA检测的特异性引物，所述特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物SEQ ID NO.1：5’-CGATTGTGAGTGAGCCCTAGTGGCGAGCCT-3’，
下游引物SEQ ID NO.2：5’-CTTCGTATTTGTGGGAGTTGATTCGGGACT-3’。
本发明的一个方面提供了一种果生炭疽菌RPA检测试剂，所述检测试剂含有上述的特异性引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。所述试剂可以制备液体、冻干粉等制剂形式，试剂中还可以包括多种类型的其他试剂，例如植物总核酸的提取试剂、RPA反应所需的其他试剂。
本发明的另一方面提供了一种果生炭疽菌RPA检测试剂盒，含有上述的特异性引物。
所述果生炭疽菌RPA检测试剂盒，还含有植物总核酸提取试剂盒、RPA扩增反应试剂、阳性对照。
本发明的又一方面提供了一种果生炭疽菌RPA检测的方法，包括如下步骤：
1)提取待测样品基因组DNA；
2)利用提取的样品基因组DNA进行RPA反应，所用特异性引物为权利要求1中所述的特异性引物；
3)RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测到目标扩增对象的即为阳性样品。
在上述方法中，RPA反应的反应体系包含：RPA扩增反应试剂，特异性引物，样品基因组DNA。
在上述方法中，RPA反应条件为：反应温度为42℃，反应时间为30分钟。
在上述技术方案中，所述步骤3)中RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析或者核酸测序。
进行琼脂糖凝胶电泳分析时，检测到367bp的条带即表明待测样品是阳性样品。
本发明的又一方面提供了针对果生炭疽菌RPA检测的特异性引物、检测试剂、检测试剂盒在检测果生炭疽菌中的应用。
有益效果
本发明首次将RPA技术应用于果生炭疽菌的检测，建立了RPA快速检测体系，该检测体系与其他常见病原菌均无交叉反应，特异性强。
RPA技术最大的优点在于恒温反应，不需要PCR仪等热循环设备，操作简单，大大增强了该技术在基层的推广使用。本研究建立的果生炭疽菌RPA检测方法在兼具强特异性和高灵敏度等特点的同时，不需要PCR仪等热循环设备，操作简单，尤其适合在基层或者实验条件不足的实验室进行果生炭疽菌的快速检测，对果生炭疽菌的早期检测和口岸检验检疫具有重要的现实意义。
附图说明
图1是本发明引物设计图。
图2是引物特异性检测。泳道1-9依次为Colletotrichum fructicola，Colletotrichum gloeosporioides，colletotrichumsiamense，Alternaria alternata，Botryosphaeria dothidea，Botrytis cinerea，Fusariumoxysporum，Venturianashicola，Gymnosporangium haraeanum。
图3是灵敏度检测结果。泳道1-6：DNA模板浓度依次为1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL。
图4是样品检测结果。泳道1-8：阳性DNA对照、阴性对照、健康梨果、梨黑斑病果、梨轮纹病病果、梨炭疽病病果、梨黑星病病叶、梨锈病病叶。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到，除另有说明外，本发明采用的试剂均为分析级试剂。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：RPA引物设计与验证
根据已报道的果生炭疽菌Unknown contig序列(NCBI Reference Sequence:NW_022474237.1:811738-813106)，通过Primer 5软件设计了1对RPA引物，其中上游引物CF-RPA-F(SEQ ID NO.1)：CGATTGTGAGTGAGCCCTAGTGGCGAGCCT；下游引物CF-RPA-R(SEQ IDNO.2)：CTTCGTATTTGTGGGAGTTGATTCGGGACT，具体如图1所示，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
检测使用的RPA试剂盒为安普未来生物科技有限公司产品(货号：WLB8201KIT)。按照RPA试剂盒说明书的反应体系(总体积：50μL)，以果生炭疽菌的DNA为模板，在含固体反应物的反应管中依次加入Buffer A 29.5μL，ddH2O 16μL、上下游引物(10μmol/L)各0.5μL，DNA模板1μL，充分混匀，再加入280mM醋酸镁(MgAc)2.5μL，充分振荡混匀，瞬时离心3s，置于42℃金属浴上反应30min。RPA反应结束后，向反应物中加入3倍体积的饱和酚溶液，轻轻涡旋混匀，12000rpm离心10min，吸取上清液进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果。
结果如图1所示，CF-RPA-F/CF-RPA-R能扩增出单一目标条带，可进一步进行特异性检测实验。
实施例2RPA引物特异性评价
为了检测所设计的引物是否会与其它常见病原菌发生交叉反应，用表1中的病原菌的DNA作为模板，按照实施例1中所述的反应体系进行RPA反应，评价所设计引物的检测特异性。
表1 本实施例中用于筛选引物特异性的菌株
注：+表示具有特异性测试条带；-表示无测试条带。
结果如图2所示，本发明中的CF-RPA-F/CF-RPA-R引物只能在果生炭疽菌中扩增出单一目标条带，这表明所设计的RPA检测引物与其他病原菌无交叉反应，并且具有属间和属内特异性，可特异性检测出果生炭疽菌。
实施例3RPA引物灵敏性评价
为了确定所设计引物的检测灵敏度，梯度设置浓度依次1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL，1pg/μL，100fg/μL，10fg/μL的DNA模板，按照实施例1中所述的反应体系进行RPA反应，评价检测灵敏度。
结果如图3所示，本发明中的CF-RPA-F/CF-RPA-R引物的检测灵敏度可达10pg/μL。
实施例4田间样品检测
收集感染了梨黑斑病、梨炭疽病、梨轮纹病、梨黑星病、梨锈病的梨病叶或梨病果样品及健康对照材料，并使用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，DP305)提取总核酸，保存于-20℃冰箱备用。
按照实施例1中所述的反应体系进行RPA反应，电泳结果如图4显示，只有感染了果生炭疽菌的梨炭疽病样品扩增出单一明亮条带，检测结果呈阳性，而感染其它病原菌的病害样品和健康对照材料检测结果均呈阴性。结果表明，本发明中所建立的果生炭疽菌RPA检测方法稳定可靠，可以用于田间感染果生炭疽菌的梨炭疽病害样品的快速检测。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
Claims (10)
1.一种果生炭疽菌RPA检测的特异性引物，其特征在于，所述特异性引物的核苷酸序列为：
上游引物SEQ ID NO.1：5’-CGATTGTGAGTGAGCCCTAGTGGCGAGCCT-3’，
下游引物SEQ ID NO.2：5’-CTTCGTATTTGTGGGAGTTGATTCGGGACT-3’。
2.一种果生炭疽菌RPA检测试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1所述的特异性引物。
3.一种果生炭疽菌RPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的特异性引物。
4.如权利要求3所述的果生炭疽菌RPA检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有植物基因组DNA提取试剂盒、RPA扩增反应试剂、阳性对照。
5.一种果生炭疽菌RPA检测的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)提取待测样品基因组DNA；
2)利用提取的样品基因组DNA进行RPA反应，RPA反应中所用特异性引物为权利要求1中所述的特异性引物；
3)RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测到目标扩增对象的即为阳性样品。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的RPA反应的反应体系包含：样品基因组DNA，RPA扩增反应试剂，特异性引物。
7.如权利要求5至6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的RPA反应条件为：反应温度为42℃，反应时间为30分钟。
8.如权利要求5至6任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中RPA反应完成后对反应产物进行检测，检测方法为将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析或者核酸测序。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，进行琼脂糖凝胶电泳分析时，检测到367bp的条带即表明待测样品是阳性样品。
10.如权利要求1所述的特异性引物、如权利要求2所述的检测试剂、如权利要求3所述的检测试剂盒，在检测果生炭疽菌中的应用。
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