CN116497001A - 一种Taq DNA聚合酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Taq DNA聚合酶突变体，是将序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行以下任一组中的任一种突变所得的突变体：(1)Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G、Y686R/E687K/Q690V、Y686R/E687K/D732A、Y686R/E687K/A744G；(2)E507Q、R716K；(3)E734N。本发明Taq DNA聚合酶突变体相较于野生型酶在热稳定性、活性或者灵敏度方面得到提高，使扩增效果更加好。
Description
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，具体涉及一种Taq DNA聚合酶突变体。
背景技术
Taq DNA聚合酶的基因全长为2496bp，编码832aa，分子量大小为94kD，是一种耐热的聚合酶，属于DNA聚合酶I家族。Taq DNA聚合酶有三个结构域，N端结构域(1～290)具有一个5’→3’核酸外切酶活性，金属离子(Zn2+和Mg2+)的结合位点也位于该区域。C端(424～832)具有5’→3’聚合酶反应的结构域，该结构域状若人之右手，主要由拇指、手指和手掌三个结构域构成。拇指区域主要作用是结合引物-模板的复合物，手指区域负责与单链DNA模板相互作用及接纳脱氧核糖核苷酸dNTPs，且每接纳一个核苷酸dNTP，手指指尖部分就会向内侧移动而形成闭合结构。手掌区域的功能是催化脱氧核糖核酸核苷酸聚合反应，同时也能起到接纳dNTP的作用。Taq DNA聚合酶的第三个结构域(292～423)与大肠杆菌的DNA聚合酶Pol I具有结构同源性但序列相似度不高，所以TaqDNA聚合酶不具有大肠杆菌DNA聚合酶Pol I的3’→5’核酸外切酶活性，在合成当中对于单核苷酸的错配不具有校正功能，从而不能使产物具有好的保真性。Taq DNA聚合酶最适温度为70～75℃(催化活性最高的温度)，其催化延伸效率可达150bp/s。Taq DNA聚合酶在92.5℃酶活性可持续130min，95℃持续40min，97.5℃下5-6min可保持约50％的酶活性。研究者将Taq DNA聚合酶应用于PCR技术，使得PCR的过程实现了自动连续循环。
Taq DNA聚合酶广泛用于基因工程技术，包括DNA克隆、基因诱变、DNA标记、测序和其他体外DNA操作。Taq DNA聚合酶在RT-PCR中发挥了至关重要的作用。不仅如此，Taq DNA聚合酶在其他人畜流行疾病的诊断和检测中也有十分广泛的应用，例如非洲猪瘟检测等。尽管如此，TaqDNA聚合酶仍存在一些不足之处，稳定性、检测灵敏性、活性等仍然有待进一步提高。随着PCR和RT-PCR技术的普遍应用，对Taq DNA聚合酶性质的研究日渐重要。
因此，通过蛋白工程的手段增强Taq DNA聚合酶的热稳定性、灵敏度以及PCR活性可以扩展现有应用范围，也可以设计新的应用形式，而且对于提升Taq DNA聚合酶的临床诊断具有重要的意义。
公开号为CN114774384A的发明申请公开了一种Taq DNA聚合酶突变体及其筛选方法，该Taq DNA聚合酶突变体是通过对732位进行饱和突变后筛选获得的，与未经改造的野生型Taq酶相比，特异性和活性均有明显的提高，但热稳定性、活性、灵敏度等方面都还待进一步提高。
发明内容
本发明针对现有技术中存在的上述不足，提供了一种Taq DNA聚合酶突变体。
一种Taq DNA聚合酶突变体，是将序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行以下任一组中的任一种突变所得的突变体：
(1)Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G、Y686R/E687K/Q690V、Y686R/E687K/D732A、Y686R/E687K/A744G；
(2)E507Q、R716K；
(3)E734N。
本发明又提供了所述Taq DNA聚合酶突变体的编码基因。
本发明又提供了一种包含所述编码基因的重组载体。
本发明又提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。
本发明又提供了一种制备所述Taq DNA聚合酶突变体的方法，包括以下步骤：发酵培养所述基因工程菌，然后分离纯化获得所述Taq DNA聚合酶突变体。
本发明还提供了所述Taq DNA聚合酶突变体作为DNA聚合酶在DNA扩增中的应用。
本发明还提供了一种用于DNA扩增的试剂盒，包括所述Taq DNA聚合酶突变体。
优选的，DNA扩增为PCR或RT-PCR。
本发明Taq DNA聚合酶突变体相较于野生型酶在热稳定性、活性或者灵敏度方面得到提高，使扩增效果更加好。
附图说明
图1为Taq DNA聚合酶与2756条同源序列的比对结果图。
图2为GREMLIN生成的Taq DNA聚合酶的共同进化图谱。
图3为嗜热微生物来源的DNA聚合酶的多序列比对预测了13个单突变结果图。
图4为突变体E507Q和R716K的qPCR初筛结果图(突变体和荧光曲线框在一起)。
图5为E507Q、R716K与野生型Taq DNA聚合酶的PCR电泳图，其中A图、B图、C图分别为不同条件下的检测结果，泳道M为标准分子量Marker，泳道Wild为野生型。
图6为突变体E507Q、E734N与野生型的Taq酶的PCR表现对比结果图，其中A图、B图分别为不同条件下的检测结果，泳道M为标准分子量Marker，泳道Wild为野生型，泳道507Q为突变体E507Q。
图7为突变体Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G和Y686R/E687K/Q690V与野生型的Taq酶的PCR表现对比结果图，其中A图、B图分别为不同条件下的检测结果，泳道M为标准分子量Marker，泳道Wild为野生型，泳道RK为突变体Y686R/E687K，泳道RK690G为突变体Y686R/E687K/Q690G，泳道RK690V为突变体Y686R/E687K/Q690V。
图8为突变体Y686R/E687K/D732A和Y686R/E687K/A744G与野生型Taq酶的PCR表现对比结果图，其中泳道M为标准分子量Marker，泳道Wild为野生型，泳道RK732A为突变体Y686R/E687K/D732A，泳道RK744A为突变体Y686R/E687K/A744G，泳道2和泳道3为其他突变体。
图9为RT-PCR等温扩增以确定Taq DNA聚合酶的活性。荧光强度与循环线性拟合野生型(Y＝250.5*X-4113)、E507Q(Y＝636.0*X-9886)和E734N(Y＝340.3*X-5460)。线性方程的斜率是酶活性的指标。
具体实施方式
实施例1：突变体的设计
(1)基于大规模多序列比对的突变体的理性设计
鉴于O-helix在维持保真度和底物特异性方面十分重要，我们选择了O-helix附近的区域作为突变靶点，以期提高酶的催化效率。首先在NCBI的蛋白质数据库中进行了blast搜索。去除重复和截断序列后，从5000条同源序列中抽取2756条DNA聚合酶序列进行多序列比对(MSA)和保守分析(图1)，显示Taq DNA聚合酶在该区域大部分区域与保守序列保持相似，只有His676/Arg677和Tyr686/Glu687两对残基与保守序列有很大差异。在676和677位点上，Taq DNA聚合酶含有两个碱性氨基酸676H/677R，而基于MSA的保守序列在这两个位点上有疏水的676F/677G。同样，在686和687的位置，Taq DNA聚合酶686Y/687E，而保守序列有两种686R/687K。Taq DNA聚合酶在这四个位置上的氨基酸与保守序列有很大的不同。所以我们设计了突变体H676F/R677G和Y686R/E687K以期提高Taq DNA聚合酶的性能。
(2)共进化突变
经过验证我们发现Y686R/E687K的活性有一定提升(见实施例4)，基于3000多条同源序列的多序列比对，利用GREMLIN对Taq DNA聚合酶进行共进化分析。在位点686和690之间存在高度的共进化耦合，P值为0.918(图2)。我们在Y686R/E687K的基础上对690位进行定点饱和突变，希望获得稳定性或活性更高的变体。我们使用CSR策略(CSR引物，CSR-F：GCTGTGCTGGAAGCGCTGCG，CSR-R：
CAGCCAATCTTCACCAATACCAAC)筛选Taq DNA聚合酶突变文库(已申请专利：专利申请号：CN202210450302.3)，这是一种基于乳化PCR(ePCR)的方法，用于筛选DNA聚合酶突变。突变库共测序了53个克隆。Y686R/E687K/Q690X库中筛选出的占比最高的突变为Y686R/E687K/Q690G和Y686R/E687K/Q690V，然后对这两个突变体进一步进行纯化和活性测试(表1)。
表1CSR筛选的结果
鉴于之前研究的732位点(已申请专利：专利申请号：CN202210450302.3)确实可以对Taq DNA聚合酶活性产生影响，我们在共进化分析时发现744位点为732位点的共进化位点(P值为0.98)，而且距离活性中心和结合部分更近，而732位点距离活性中心相对较远，所以我们推测732位点是通过和744位点的相互作用，来影响Taq DNA聚合酶的活性。所以，我们也做了744位点的CSR筛选，筛选结果为A744G占比最高。我们进一步将活性有一定提升A744G和Y686R/E687K进行了组合，以此有了突变体Y686R/E687K/D732A(D732A位点已申请专利：专利申请号：CN202210450302.3)和Y686R/E687K/A744G。
(3)基于嗜热DNA聚合酶的同源序列的突变体设计
我们又从嗜热菌的同源DNA聚合酶中得到49条与Taq DNA聚合酶高度同源的同源热序列被用于比对，设计新的突变，同源性从86.79％到99.88％不等(图3)。基于一致性序列突变，鉴定出13个单突变体，包括G499R(1)、E507Q(2)、Y535H(3)、S543N(4)、E602A(5)、R636K(6)、E641Q(7)、R651P(8)、Q690V(9)、R716K(10)、E773R(11)、K793Q(12)和E734N(13)。对于以上突变体(除E734N外)进行qPCR初步筛选，具体实施如下：
突变质粒被Dpn I消化后转化感受态细胞，涂布培养皿培养16h后，每个突变体设置6个独立平行克隆。用0.05mM IPTG在96孔板中37℃诱导8h表达。在含有10×PCR buffer2μL、dNTPs(各2.5mM)2μL、GFP-Fp(10μM)和GFP-Rp(10μM)各1μL、Template(pET21a-GFP)(10ng/μL)0.2μL、Sybr green 0.8μL、悬浮细胞1μL、ddH2O 12μL的RT-qPCR反应混合液中检测粗酶。反应在95℃循环3min；然后采集荧光数据，95℃30s，54℃15s，72℃10s，循环60次。荧光定量分析仪Steponeplus(Applied Biosystems)用于RT-qPCR和荧光测量进行活性测试。经过qPCR筛选(图4)，突变体E507Q和R716K活性最佳。E734N是qPCR未测试的基于嗜热DNA聚合酶的同源序列设计的突变体。
实施例2：突变体的构建
根据实施例1的3种策略，我们构建了相应的突变体(E507Q、R716K、E734N、Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G和Y686R/E687K/Q690V、Y686R/E687K/D732A和Y686R/E687K/A744G)，构建的方法如下：
以含有的pET-21a-Taq DNA聚合酶(野生型酶来源于水生嗜热菌(Thermusaquaticus)，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示)的环状质粒作为模板PCR扩增，环状质粒PCR体系：模板1μL，引物列表如表1所示，引物F和引物R，10μM各1μL，dNTP(2.5mM)4μL，10×高保真酶缓冲液5μL，高保真酶1μL，补水至50μL的反应体系。
所使用的引物如表2所示，其中，N表示A/T/G/C中任意一种，K表示G/T中任意一种，M表示A/C中任意一种。
表2突变体引物列表
其中E507Q、716K和E734N由编号5、6和7的引物对由野生型直接突变得到。
其中Y686R/E687K由编号1的引物对突变得到，突变体Y686R/E687K/D732A和Y686R/E687K/A744G分别是编号为2、3的引物在Y686R/E687K突变体基础上直接突变得到，突变体Y686R/E687K/Q690G和Y686R/E687K/Q690V是编号为4的引物在Y686R/E687K突变体基础上对690位点饱和突变后筛选得到。
环状质粒PCR热循环条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，(Tm-5)℃退火20s，72℃延伸4min 20s，4℃保温。反应条件进行PCR扩增30个循环。扩增产物经Dpn I消化后即可用于转化。
Dpn I消化原始质粒：扩增PCR产物需要经过Dpn I甲基化酶去除原始的拟突变质粒模板，反应体系为Dpn I 1μL，Buffer 5μL，PCR反应产物5μL，补水至50μL；反应条件为37℃孵育1h。甲基化酶消化原始质粒，进行下一步的转化实验。
取5μL反应体系，加入50μL的BL21(DE3)感受态细胞中(表达性宿主细胞)，冰上孵育20min；42℃热激45s；冰上放置3min；加入950μLLB培养基，在37℃摇床(220rpm)活化1h后，涂布平板，培养14h-16h，至长出成熟的单菌落。
实施例3：突变体的制备
本发明所有突变体的制备包括以下诱导表达和纯化两个步骤：
首先是Taq DNA聚合酶突变体在大肠杆菌细胞内的表达，具体操作流程如下：
种子培养：挑取单菌落接种入5mL的LB培养液(含抗生素)，培养13h。
发酵培养：将2mL的过夜培养液接种入100mL新鲜的LB的培养基(含抗生素，用500mL的锥形瓶)中37℃，250rpm培养约2h，至对数生长期(OD600＝0.4-0.6)。
诱导表达：加入20％的Ara阿拉伯糖终浓度(1：5000)，用终浓度0.05mM IPTG进行诱导，37℃下继续诱导培养5小时后，7000rpm，10min，收获菌体。10mL的Lysis缓冲溶液(50mM pH 8.0)悬浮菌体，超声破碎(2s，3s，10min，50％)，70℃孵育10min；8000rpm，15min离心，获取上清；电泳检测。
其次是Taq DNA聚合酶突变体的纯化，具体操作流程如下：
Ni-NTA柱蛋白纯化：两倍柱体积的Lysis缓冲溶液平衡柱子，使Buffer缓慢排出树脂；将上清液缓慢上样(两倍柱体积的样品液)；Lysis缓冲液清洗20个柱体积；再使用含有20mM咪唑的Wash Buffer清洗10个柱体积；最后使用含有250mM咪唑Elution Buffer洗脱样品，洗脱体积3mL。
将Ni-NTA纯化获得的蛋白使用50kD的超滤管进行离心浓缩，并置换为存储缓冲溶液。利用Nano Drop将蛋白统一定量至50ng/μL后，进行下一步的活性测试。
实施例4：突变体蛋白的测试应用
该实施例所有突变体蛋白的测试应用均通过PCR表现优劣来衡量突变体的性能，PCR实验反应结束后，加入6×loading buffer，上样10μL，电泳条件130V，30min后在凝胶成像仪上观看结果并拍照。
所有用于PCR的引物见表3。
表3引物序列
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| GFP-F | ATGAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCAC |
| GFP-R | GGATCCTTTGTAGAGCTCATC |
| H12-F(1.2kb) | CAAGCAGCCGCTCTGAAGCAGTT |
| H12-R(1.2kb) | CACACCACCACGTACCGCTCGAT |
| H20-F(2.0kb) | GAGTTGGAAGCCCGCATCTATCT |
| H20-R(2.0kb) | GGCTGAGTGGGACCCAGTTCCAA |
| H41.2-F(4.1kb) | GGTGTTCCCTTGATGTAGCACA |
| H41.2-R(4.1kb) | CCAGGATTTTTGATGGGACACG |
具体分为以下4个部分实施。
一、对于突变体E507Q和R716K的测试，具体实施如下：
以Hela细胞基因组DNA为模板，通过PCR测定Taq DNA聚合酶活性。为了从Hela细胞基因组中扩增不同片段，PCR在20μL反应中进行，包含105pg DNA模板，每个引物10pmol，0.25mM dNTP和0.05μg DNA聚合酶。将混合物在95℃孵育3分钟后，设置30次PCR循环，循环温度梯度为95℃/30s，54℃/15s，72℃(2.0kb/20s，4.1kb/2min)。反应混合物在1％琼脂糖凝胶中电泳。以含GFP基因的pET21a-GFP质粒为模板，通过对PCR mix的加热进行PCR测定Taq DNA聚合酶稳定性。在20μL反应中进行PCR，包含104pg DNA模板，每个引物10pmol，0.25mM dNTP和0.05μg DNA聚合酶。将PCR mix在95℃孵育150分钟后，进行30循环PCR循环，温度分布为95℃/30s，54℃/15s，72℃/10s。
电泳结果如图5所示：对于2kb的扩增，突变体E507Q和R716K的扩增效果明显优于野生型，对于4kb的扩增，突变体E507Q的扩增效果也明显优于野生型，而突变体R716K的扩增效果和野生型无明显差异，在稳定性的测试环节，突变体E507Q在经过150min的加热后，扩增效果显著优于野生型；突变体R716K的扩增效果也稍优于野生型。
二、对于突变体E734N的测试，具体实施如下：
以Hela细胞基因组DNA为模板，通过PCR测定Taq DNA聚合酶活性。扩增反应条件同实施例1(进行了2kb的扩增)；以含GFP基因的pET21a-GFP质粒为模板，通过对PCR mix加热120min和150min进行PCR测定Taq DNA聚合酶稳定性。扩增反应条件同实施例1。
电泳结果如图6所示：对于2kb的扩增，突变体E734N的扩增效果明显优于野生型，弱于突变体E507Q，在稳定性的测试环节，在PCR mix加热120min和150min后，突变体E734N扩增效果均显著优于野生型，与突变体E507Q相差不大。
三、对于突变体Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G、Y686R/E687K/Q690V的测试，具体实施如下：
以含GFP基因的pET21a-GFP质粒为模板，通过不同浓度的模板和低循环数进行PCR测定Taq DNA聚合酶灵敏度和活性。灵敏度测试条件如下，反应体系20μL，加入1μL的DNA模板(浓度10-2-10-4ng/μL)，其他PCR条件同上。进行30循环PCR循环，温度分布为95℃/30s，54℃/15s，72℃/10s；低循环数的PCR活性测试的模板浓度10ng/μL DNA模板，循环数15个，其他实施条件同上。
电泳结果如图7所示：对于10-3和10-4ng/μL，突变体Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G和Y686R/E687K/Q690V均优于野生型，说明这三个突变体的灵敏度均高于野生型。在较低的15个循环数下，突变体Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G和Y686R/E687K/Q690V的扩增效果也均优于野生型，说明三者活性也更优秀。
四、对于突变体Y686R/E687K/D732A和Y686R/E687K/A744G的测试，具体实施如下：
以Hela细胞基因组DNA为模板，通过PCR测定Taq DNA聚合酶活性。为了从Hela细胞基因组中扩增不同片段，PCR在20μL反应中进行，包含105pg DNA模板，每个引物10pmol，0.25mM dNTP和0.05μg DNA聚合酶。将混合物在95℃孵育3min后，设置30次PCR循环，循环温度梯度为95℃/30s，54℃/15s，72℃(1.2kb/12s 2.0kb/20s)。反应混合物在1％琼脂糖凝胶中电泳。
电泳结果如图8所示：无论是对于1.2kb的扩增或者2kb的扩增，Y686R/E687K/D732A和Y686R/E687K/A744G均明显优于野生型。
五、RT-PCR等温扩增测试E507Q和E734N的酶活性
使用具有序列CCCCCCCCCACCCCCCCCCACCCCCCCACCCCCCCCCACCCCCCCAAAAAAAAAAAAAAAAAA的寡链作为模板。引物具有多聚T序列TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT。RT-PCR在20μL反应中进行，含有10×PCR缓冲液2μL，dNTPs(各0.4mM)1μL，poly-Tp(0.4μM)1μL，模板(0.4μM)1μL，DNA聚合酶1μL，20×SYBRGreen I 1μL，ddH2O13μL。热循环仪设置为10s 60℃，50个循环。RT-PCR完成后，分析荧光图。以反应时间或循环数为横轴，实时荧光信号值为纵轴，以各曲线的斜率作为酶活性的指标。
结果表明(如图9所示)，qPCR荧光强度所检测到E507Q和E734N具有比野生型更高的初始速率，表明两个突变体的活性有所提高。根据拟合的线性方程，E507Q和E734N的活性分别比野生型高2.5倍和1.36倍。
Claims (8)
1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，是将序列如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列进行以下任一组中的任一种突变所得的突变体：
(1)Y686R/E687K、Y686R/E687K/Q690G、Y686R/E687K/Q690V、Y686R/E687K/D732A、Y686R/E687K/A744G；
(2)E507Q、R716K；
(3)E734N。
2.权利要求1所述Taq DNA聚合酶突变体的编码基因。
3.一种包含权利要求2所述编码基因的重组载体。
4.一种包含权利要求2所述编码基因的基因工程菌。
5.一种制备权利要求1所述Taq DNA聚合酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：发酵培养权利要求4所述基因工程菌，然后分离纯化获得所述Taq DNA聚合酶突变体。
6.权利要求1所述Taq DNA聚合酶突变体作为DNA聚合酶在DNA扩增中的应用。
7.一种用于DNA扩增的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述Taq DNA聚合酶突变体。
8.根据权利要求7所述试剂盒，其特征在于，DNA扩增为PCR或RT-PCR。
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