CN116479067A - 一种l-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种L‑酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，通过在L‑酪氨酸结晶初期，L‑酪氨酸发酵产生大量泡沫时添加适量L‑酪氨酸晶种，增大晶体，加快L‑酪氨酸结晶速度；同时通过超声辅助结晶的方法增大晶体，优化晶型，从而减少因L‑酪氨酸结晶而带来的发酵过程泡沫过多的问题；所述方法解决了现有L‑酪氨酸在发酵过程中，由于结晶细小引起发酵液起泡严重的问题；同时降低消泡剂(有效成分为表面活性剂)消耗量，避免了菌体生长过程中表面活性剂过度使用产生的负面影响，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及发酵法生产氨基酸技术领域，尤其是一种L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法。
背景技术
L-酪氨酸是芳香族氨基酸，在人体及动物的新陈代谢和生长发育中有着重要作用，在医药、食品、化工等领域具有广泛应用。在医药领域，L-酪氨酸在人体中能够起到调节情绪和刺激大脑活动的作用。在食品和饲料领域，L-酪氨酸是一种重要的食品和饲料添加剂。在化工领域，L-酪氨酸可应用于各种新型聚合物、涂料、粘合剂、药物、生物化妆品以及健康和营养产品中。
L-酪氨酸的生产方法主要包括蛋白质水解物提取法、化学合成法、酶法和微生物发酵法。微生物发酵法较其他生产方法具有生产周期短，能耗少，绿色环保等优势，是伴随着近年来代谢工程和合成生物学发展起来的、在未来最有潜力的大规模生产L-酪氨酸的方法。然而在发酵过程中，由于酪氨酸结晶易产生泡沫，造成氧气供应不足，影响了菌体生长，且有较大染菌风险。因此，现阶段生产上通常采取添加消泡剂的方式来降低泡沫，但这种降低泡沫的方法不仅增加了生产成本，而且消泡剂有效成分为表面活性剂，过量添加会抑制菌体生长，进而影响了L-酪氨酸的产量和转化率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，在发酵前期L-酪氨酸发酵产生大量泡沫时，添加酪氨酸晶种，并通过超声辅助酪氨酸结晶，增大晶体，减少泡沫生成，提升菌株活力。
优选的，上述L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，在发酵前期L-酪氨酸产量达到2g/L时，添加0.2-0.5g/L的酪氨酸纯品作为酪氨酸晶种，超声辅助酪氨酸结晶的超声频率为12-24kHz，超声时间为0.5h-1h。
优选的，上述L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，具体步骤如下：
(1)活化培养：酪氨酸生产菌E.coli TYR03传两代斜面，活化培养；
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，并用氨水调节种子罐内的种子培养基并维持pH在6.7～7.0；
(3)发酵培养：接种15-20％的种子液到发酵罐，连续培养，中间补料，得到发酵液，用氨水调节发酵罐内的发酵培养基并维持pH在6.7-7.0，溶氧控制在40-60％，用消泡电极实时监测发酵罐内泡沫量，并利用蠕动泵自动模式添加消泡剂；其中，发酵前期L-酪氨酸产量达到2g/L时(此时L-酪氨酸发酵产生大量泡沫的时期)，添加0.2-0.5g/L的酪氨酸纯品作为酪氨酸晶种，并利用超声辅助结晶，其超声频率为12-24kHz，超声时间为0.5h-1h。
优选的，上述L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，所述步骤(3)中在发酵前期L-酪氨酸产量达到2g/L时，添加0.4g/L的L-酪氨酸纯品作为酪氨酸晶种，并在16kHZ超声频率下超声0.5h。
优选的，上述L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，所述步骤(1)中采用的斜面培养基为：葡萄糖1-2g/L，蛋白胨6-10g/L，牛肉膏6-10g/L，酵母浸出粉3-5g/L，氯化钠3-5g/L，琼脂粉15-30g/L，其余为水。
优选的，上述L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，所述步骤(2)中采用的种子培养基为：葡萄糖15-30g/L，酵母浸出粉3-6g/L，硫酸铵1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，无水硫酸镁0.5-2g/L，七水硫酸亚铁20-40mg/L，一水硫酸锰10-30mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，VB1 0.5-1mg/L，微量元素混合液1-2ml/L,消泡剂0.5g/L，其余为水。
优选的，上述L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，所述步骤(3)中采用的发酵培养基为：葡萄糖20-40g/L，酵母浸出粉3-5g/L，硫酸铵1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，无水硫酸镁0.5-2g/L，七水硫酸亚铁30-60mg/L，一水硫酸锰20-40mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，VB1 0.5-1mg/L，微量元素混合液1-2ml/L，其余为水。
优选的，上述L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，所述微量元素混合液组分含量为钼酸铵0.28mg/L，硼酸5mg/L，CoC l2 .6H2O 1.4mg/L，MnSO4 .H2O0.5mg/L，CuSO4 .7H2O0.5mg/L，ZnSO4 .7H2O 0.6mg/L，其余为水(上述成分称量固体后溶解于1L水中，在4℃保存)。
优选的，上述L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，所述酪氨酸晶种的添加策略为将酪氨酸晶种160℃干热灭菌2h，过火圈加入发酵罐中。
优选的，上述L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，所述超声辅助结晶的方式为选用超声棒插入超声夹套，对发酵液进行超声辅助结晶。
优选的，上述L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，所述发酵培养的条件为：接种量每600ml种子液，发酵体积3L,培养温度37℃，pH 6.8-7.0，转速与溶氧联动，发酵时间35h。
有益效果：
上述L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，通过在L-酪氨酸结晶初期，L-酪氨酸发酵产生大量泡沫时添加适量L-酪氨酸晶种，增大晶体，加快L-酪氨酸结晶速度；同时通过超声辅助结晶的方法增大晶体，优化晶型，从而减少因L-酪氨酸结晶而带来的发酵过程泡沫过多的问题。
所述方法解决了现有L-酪氨酸在发酵过程中，由于结晶细小引起发酵液起泡严重的问题；同时降低消泡剂(有效成分为表面活性剂)消耗量，避免了菌体生长过程中表面活性剂过度使用产生的负面影响，具有重要的应用价值。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
下述实施例中使用的酪氨酸生产菌株均为E.coli TYR03，购自天津科技大学代谢工程实验室。使用的微量元素混合液组分含量为钼酸铵0.28mg/L，硼酸5mg/L，CoC l2 .6H2O1.4mg/L，MnSO4 .H2O 0.5mg/L，CuSO4 .7H2O 0.5mg/L，ZnSO4 .7H2O 0.6mg/L，其余为水(上述成分称量固体后溶解于1L水中，在4℃保存)。发酵培养的条件为：接种量每600ml种子液，发酵体积3L,培养温度37℃，pH 6.8-7.0，转速与溶氧联动，发酵时间35h。
实施例1
一种L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，具体步骤如下：
(1)活化培养：从-80℃冰箱中取出酪氨酸生产菌E.coli TYR03保菌管，传两代斜面，活化培养，采用的斜面培养基包括：葡萄糖1g/L，蛋白胨6g/L，牛肉膏6g/L，酵母浸出粉5g/L，氯化钠3g/L，琼脂粉25g/L；
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，采用的种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母浸出粉3g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾4g/L，无水硫酸镁1.5g/L，七水硫酸亚铁20mg/L，一水硫酸锰20mg/L，VH 0.4mg/L，VB1 0.5mg/L，微量元素混合液2m l/L，消泡剂两滴(约0.5g/L)，并用氨水将培养基调节并维持pH到6.7～7.0；
(3)发酵培养：接种15％的种子液到发酵罐，连续培养，溶氧控制在40％，用氨水将发酵罐培养调节并维持pH到7.0，用消泡电极实时监测发酵罐内泡沫量，并利用蠕动泵自动模式添加消泡剂，3L体系。发酵培养基为：葡萄糖25g/L，酵母浸出粉3g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾4g/L，无水硫酸镁2g/L，七水硫酸亚铁40mg/L，一水硫酸锰30mg/L，VH 0.2mg/L，VB10.5mg/L，微量元素混合液2m l/L。
实施例2
一种L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，参照实施例1，在其基础上当发酵过程中L-酪氨酸产量达到2g/L时，添加0.2g/L的L-酪氨酸晶种。
实施例3
一种L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，参照实施例2，在其基础上将实施例2中L-酪氨酸晶种添加量由0.2g/L增加至0.3g/L。
实施例4
一种L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，参照实施例3，在其基础上将实施例3中L-酪氨酸晶种添加量由0.3g/L增加至0.4g/L。
实施例5
一种L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，参照实施例4，在其基础上将实施例4中L-酪氨酸晶种添加量由0.4g/L增加至0.5g/L。
表1不同晶种添加量与实施例产量及消泡剂使用量对比
| 实施例编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 消泡剂使用量(ml) | 6.6 | 4.6 | 3.5 | 2.8 | 2.9 |
| 产量(g/L) | 49.6 | 52.1 | 52.6 | 53.1 | 53.2 |
由表1可知，实施例2，3，4，5产量较为接近；实施例4，5消泡剂使用量较低，而实施例4晶种添加量较5更少。因此后续实施例L-酪氨酸晶种添加量均为0.4g/L。
实施例6
一种L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，具体步骤如下：
(1)活化培养：从-80℃冰箱中取出酪氨酸生产菌E.coli TYR03保菌管，传两代斜面，活化培养，采用的斜面培养基包括：葡萄糖1-2g/L，蛋白胨6-10g/L，牛肉膏6-10g/L，酵母浸出粉3-5g/L，氯化钠3-5g/L，琼脂粉15-30g/L；
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，采用的种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母浸出粉3g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾4g/L，无水硫酸镁1.5g/L，七水硫酸亚铁20mg/L，一水硫酸锰20mg/L，VH 0.4mg/L，VB1 0.5mg/L，微量元素混合液2m l/L，消泡剂两滴，并用氨水将培养基调节并维持pH到6.7～7.0；
(3)发酵培养：接种15％的种子液到发酵罐，连续培养，溶氧控制在40％，用氨水将发酵罐培养调节并维持pH到7.0，用消泡电极实时监测发酵罐内泡沫量，并利用蠕动泵自动模式添加消泡剂，3L体系；当发酵过程中L-酪氨酸产量达到2g/L时，添加0.4g/L的L-酪氨酸晶种；L-酪氨酸晶种添加后，利用超声棒对发酵液进行辅助结晶，超声频率为12kHZ，超声时间为0.5h。发酵培养基为：葡萄糖25g/L，酵母浸出粉3g/L，硫酸铵3g/L，磷酸二氢钾4g/L，无水硫酸镁2g/L，七水硫酸亚铁40mg/L，一水硫酸锰30mg/L，VH 0.2mg/L，VB1 0.5mg/L，微量元素混合液2ml/L。
实施例7
一种L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，参照实施例6，在其基础上将实施例6中超声频率由12kHz增至16kHz。
实施例8
一种L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，参照实施例7，在其基础上将实施例7中超声频率由16kHz增至20kHz。
实施例9
一种L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，参照实施例8，在其基础上将实施例8中超声频率由20kHz增至24kHz。
表2不同超声频率与消泡剂使用量及产量对比
| 实施例号 | 6 | 7 | 8 | 9 |
| 消泡剂使用量(ml) | 0.9 | 0.6 | 0.6 | 0.9 |
| 产量(g/L) | 54.6 | 54.8 | 52.9 | 51.7 |
由表2可知实施例6，7，8，9消泡剂使用量均较低，其中实施例7产量最高。因此后续实施例超声频率均为16kHz。
实施例10
一种L-酪氨酸发酵过程降低泡沫的方法，参照实施例6，其区别仅在于超声时间不同，实施例10的超声时间为1h。
表3不同超声时间对消泡剂使用量、菌体OD及产量对比
| 实施例号 | 4 | 7 | 10 |
| 超声时间(h) | 0 | 0.5 | 1 |
| 消泡剂使用量(ml) | 2.8 | 0.6 | 0.5 |
| OD600 | 100.5 | 110.8 | 98.4 |
| 产量(g/L) | 53.1 | 54.8 | 50.3 |
由表3可知超声0.5h产量最高，消泡剂使用量较少且不会对菌体生长产生负面影响。
综上，通过L-酪氨酸发酵前期，产量达到2.0g/L时，添加0.4g/L的L-酪氨酸晶种，并在16kHZ超声频率下超声0.5h，能有效降低发酵过程中泡沫量，解决了因消泡剂导致的菌体活力下降的问题，提高了L-酪氨酸产量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本发明菌株的构建步骤不分先后顺序，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，其特征在于：在发酵前期L-酪氨酸发酵产生大量泡沫时，添加酪氨酸晶种，并通过超声辅助酪氨酸结晶，增大晶体，减少泡沫生成，提升菌株活力。
2.根据权利要求1所述的L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，其特征在于：在发酵前期L-酪氨酸产量达到2g/L时，添加0.2-0.5g/L的酪氨酸纯品作为酪氨酸晶种，超声辅助酪氨酸结晶的超声频率为12-24kHz，超声时间为0.5h-1h。
3.根据权利要求1所述的L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)活化培养：酪氨酸生产菌E.coli TYR03传两代斜面，活化培养；
(2)种子培养：将活化菌株全部接种到种子罐，得到种子液，并用氨水调节种子罐内的种子培养基并维持pH在6.7～7.0；
(3)发酵培养：接种15-20％的种子液到发酵罐，连续培养，中间补料，得到发酵液，用氨水调节发酵罐内的发酵培养基并维持pH在6.7-7.0，溶氧控制在40-60％，用消泡电极实时监测发酵罐内泡沫量，并利用蠕动泵自动模式添加消泡剂；其中，发酵前期L-酪氨酸产量达到2g/L时，添加0.2-0.5g/L的酪氨酸纯品作为酪氨酸晶种，并利用超声辅助结晶，其超声频率为12-24kHz，超声时间为0.5h-1h。
4.根据权利要求3所述的L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，其特征在于：所述步骤(3)中在发酵前期L-酪氨酸产量达到2g/L时，添加0.4g/L的L-酪氨酸纯品作为酪氨酸晶种，并在16kHZ超声频率下超声0.5h。
5.根据权利要求3所述的L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，其特征在于：所述步骤(1)中采用的斜面培养基为：葡萄糖1-2g/L，蛋白胨6-10g/L，牛肉膏6-10g/L，酵母浸出粉3-5g/L，氯化钠3-5g/L，琼脂粉15-30g/L，其余为水。
6.根据权利要求3所述的L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，其特征在于：所述步骤(2)中采用的种子培养基为：葡萄糖15-30g/L，酵母浸出粉3-6g/L，硫酸铵1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，无水硫酸镁0.5-2g/L，七水硫酸亚铁20-40mg/L，一水硫酸锰10-30mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，VB1 0.5-1mg/L，微量元素混合液1-2ml/L,消泡剂0.5g/L，其余为水。
7.根据权利要求3所述的L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用的发酵培养基为：葡萄糖20-40g/L，酵母浸出粉3-5g/L，硫酸铵1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，无水硫酸镁0.5-2g/L，七水硫酸亚铁30-60mg/L，一水硫酸锰20-40mg/L，VH 0.1-0.5mg/L，VB1 0.5-1mg/L，微量元素混合液1-2ml/L，其余为水。
8.根据权利要求6或7所述的L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，其特征在于：所述微量元素混合液组分含量为钼酸铵0.28mg/L，硼酸5mg/L，CoCl2 .6H2O 1.4mg/L，MnSO4 .H2O0.5mg/L，CuSO4 .7H2O 0.5mg/L，ZnSO4 .7H2O0.6mg/L，其余为水。
9.根据权利要求3所述的L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，其特征在于：所述酪氨酸晶种的添加策略为将酪氨酸晶种160℃干热灭菌2h，过火圈加入发酵罐中。
10.根据权利要求3所述的L-酪氨酸发酵过程中降低泡沫的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为：接种量每600ml种子液，发酵体积3L,培养温度37℃，pH 6.8-7.0，转速与溶氧联动，发酵时间35h。
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