CN116478986A - 调控百合萜类花香物质合成的转录复合体及其应用 - Google Patents

调控百合萜类花香物质合成的转录复合体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116478986A
CN116478986A CN202310292095.8A CN202310292095A CN116478986A CN 116478986 A CN116478986 A CN 116478986A CN 202310292095 A CN202310292095 A CN 202310292095A CN 116478986 A CN116478986 A CN 116478986A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lily
transcription
limyb330
transcription factor
limyb1
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310292095.8A
Other languages
English (en)
Inventor
孙明
郭子雨
张鹏
梁苡琳
钟剑
郭彦宏
张启翔
程堂仁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Forestry University
Original Assignee
Beijing Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Forestry University filed Critical Beijing Forestry University
Priority to CN202310292095.8A priority Critical patent/CN116478986A/zh
Publication of CN116478986A publication Critical patent/CN116478986A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及调控百合萜类花香物质合成的转录复合体及其应用。本发明提供了一种启动子如SEQ ID NO.5所示，能够启动百合萜类花香物质合成的关键酶LiTPS2基因的表达。进一步，本发明发现了转录因子LiMYB1和LiMYB330可以发生互作形成转录复合体，该转录复合体通过与百合单萜合成酶基因LiTPS2的启动子结合，显著增强了LiTPS2的表达，促进百合中萜烯类物质的合成，为改善百合香气性状奠定良好的应用基础，可培育出符合市场需求的百合品种。

Description

调控百合萜类花香物质合成的转录复合体及其应用
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及调控百合萜类花香物质合成的转录复合体及其应用。
背景技术
花香是指植物产生的具有芳香气味的挥发性有机化合物(Volatile OrganicCompounds，VOCs)，一般是低分子量的亲脂性混合物，在花卉的观赏性状中具有非常重要的价值。其中萜烯类化合物作为植物花香成分的第一大类物质，其普遍存在于植物的营养器官和花器官中，种类繁多，迄今在植物中已发现了25000种。萜烯类化合物的合成不仅赋予了植物丰富怡人的香气，提高了其观赏价值，同时在生理生态方面也发挥着重要作用，如植物防御、吸引授粉者以及调节植物生长发育。此外，萜烯类物质在日常生活中也被广泛应用于化妆品、医药以及食品等的生产中，具有较高的应用价值和经济效益。
目前植物萜烯类挥发物的合成途径已经基本阐明，发生在细胞质中的甲羟戊酸(mevalonate pathway,MVA)途径以及质体中的甲基赤藓醇磷酸(methylerythritol 4-phosphate pathway,MEP)途径都参与萜烯类物质的合成。然而萜烯类挥发物的合成不仅受合成途径上关键酶基因的影响，还需要转录因子(TF)的参与。转录因子又称为反式作用因子，通过结合到真核基因启动子区域特定区域从而调控其表达。TF具有“多点调控”的优势，可以激活特定代谢途径上多个基因的协同表达，因此将TF转化到不同的植物中，可有效的提高目标代谢产物的合成。MYB转录因子，作为植物中最大的一类转录因子家族之一，广泛分布于植物中，目前关于MYB转录因子家族调控植物次生代谢产物合成的研究已多有报导，但关于MYB类转录因子在萜烯次级代谢中的作用仍有大量的研究空白。此外，不同MYB转录因子之间也可以相互作用形成转录复合体，并且转录复合体对植物次生代谢产物合成的调控作用较单独的转录因子更加精准和高效，然而目前有关MYBs转录复合体调控萜类物质合成的研究鲜有报导。
百合(Lilium spp.)是世界上著名的球根花卉，其品种丰富，香气类型各异；研究表明，单萜类物质是香型百合的关键致香成分，因此百合也是研究植物花香物质代谢及萜类代谢工程的有优良模式植物。目前对百合花香的研究主要集中在花香物质的定性定量分析，单萜类物质及苯环类物质合成酶基因克隆等方面展开，极少数研究关注了转录因子对百合萜类花香物质合成的调控作用，且目前尚未有涉及转录因子复合体调控百合萜类花香物质合成的研究，因此，对调控百合萜类物质合成的转录因子及其复合体作用机制进行解析，对于系统的阐明百合萜类代谢调控机制以及百合花香育种具有重要意义，同时也为开发高效的植物萜类代谢工程提供理论依据。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种改良百合萜类花香物质合成的MYBs转录复合体及其在调控萜烯类物质合成中的应用，以高效精准调控百合花瓣中萜烯类物质的含量，从而为百合品质调控，新品种培育奠定一定的基础。
第一方面，本发明提供了一种启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
上述启动子是通过染色体步移法获得，启动子长度为990bp。上述启动子能够启动百合萜类花香物质合成的关键酶LiTPS2基因的表达。
第二方面，本发明提供了与上述启动子相结合的转录因子，其为转录因子LiMYB1或转录因子LiMYB330；转录因子LiMYB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；转录因子LiMYB330的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一些实施方案中，LiMYB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，LiMYB330的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
LiMYB1基因包含开放阅读框639bp，编码212个氨基酸；LiMYB330基因包含开放阅读框756bp，编码251个氨基酸。
第三方面，本发明提供了一种转录复合体，包括转录因子LiMYB1和转录因子LiMYB330；转录因子LiMYB1和转录因子LiMYB330的氨基酸序列同上。
在一些实施方案中，LiMYB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；LiMYB330的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第四方面，本发明提供了一种生物材料，其中包括上述启动子、或上述转录因子、或上述转录复合体；所述生物材料为重组DNA、质粒载体、病毒载体或宿主细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为酵母细胞或烟草细胞。
在一些实施方案中，所述宿主细胞为工程菌；优选为大肠杆菌或农杆菌。
在一些实施方案中，所述转录复合体在酵母双杂体系中发生互作。
第五方面，本发明提供了上述启动子、或上述转录因子、或上述转录复合体、或上述生物材料在调控百合萜烯类花香物质合成中的应用；优选为在调控百合单萜类花香物质合成中的应用。
在一些实施方案中，所述百合单萜类花香物质为罗勒烯和/或芳樟醇。
第六方面，本发明提供了上述启动子、或上述转录因子、或上述转录复合体、或上述生物材料在调控百合单萜合成关键酶基因表达中的应用；优选地，所述百合单萜合成关键酶基因为LiDXS、LiDXR或LiTPS2中的至少一种。
在本发明中，所述转录因子或转录复合体通过与所述启动子结合，调控百合萜烯类花香物质合成或调控百合单萜合成酶基因表达。具体而言，LiMYB1与LiMYB330互作形成的MYBs转录复合体通过直接与百合单萜合成酶基因LiTPS2的启动子相结合，从而促进(激活)LiTPS2的表达。当LiMYB1与LiMYB330两种转录因子构成转录复合体共同作用时，显著强于上述单独转录因子对LiTPS2表达的促进作用。
此外实验结果证实，过表达LiMYB1和LiMYB330显著提高了植物萜烯类花香物质的含量；沉默LiMYB1和LiMYB330基因后，萜烯类物质的含量显著降低。
第七方面，本发明提供了上述启动子、或上述转录因子、或上述转录复合体、或上述生物材料在制备转基因植物或植物育种中的应用。
在一些实施方案中，植物育种的目的为改良植物花香。
在一些实施方案中，所述植物为百合属植物。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
本发明提供的启动子能够启动百合萜类花香物质合成的关键酶LiTPS2基因的表达。进一步，本发明发现了转录因子LiMYB1和LiMYB330可以发生互作形成转录复合体，该转录复合体通过与百合单萜合成酶基因LiTPS2的启动子结合，显著增强了LiTPS2的表达，促进百合中萜烯类物质的合成，为改善百合香气性状奠定良好的应用基础，可培育出符合市场需求的百合品种，为香型花卉育种以及萜烯类物质的工业化生产提供理论基础，具有广阔的应用前景和可观的经济价值。
附图说明
图1是LiMYB1和LiMYB330基因克隆PCR产物胶图。
图2是LiMYB1和LiMYB330氨基酸序列分析。
图3是LiTPS2启动子序列扩增产物胶图。
图4是酵母单杂交LiMYB1、LiMYB330与LiTPS2互作分析。
图5是酵母双杂交LiMYB1与LiMYB330互作分析。
图6是双荧光素酶试验验证LiMYB1-LiMYB330转录因子复合体对LiTPS2的转录激活作用。
图7是过表达LiMYB1、LiMYB330后百合萜烯类花香物质含量变化图。
图8是过表达LiMYB1后百合萜烯类物质合成关键酶基因LiDXS、LiDXR和LiTPS2表达量变化图。
图9是过表达LiMYB330后百合萜烯类物质合成关键酶基因LiDXS、LiDXR和LiTPS2表达量变化图。
图10是沉默表达LiMYB1、LiMYB330后百合萜烯类花香物质含量变化图。
图11是沉默表达LiMYB1后百合萜烯类物质合成关键酶基因LiDXS、LiDXR和LiTPS2表达量变化图。
图12是沉默表达LiMYB330后百合萜烯类物质合成关键酶基因LiDXS、LiDXR和LiTPS2表达量变化图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，均为常规方法或者按照本领域的文献所描述的技术或条件进行，或者按照产品说明书进行。所用试剂和仪器等未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
下述实施例中用到的生物材料包括：
‘西伯利亚’百合，一种市场上常见的切花品种。
下述实施例中所采用的pSuper1300::GFP载体带有卡那霉素筛选标记和35S启动子，同时带有xba I和kpn I等多克隆位点，可用来携带和转化外源基因；基因沉默所采用的VIGS载体是一种来自烟草脆裂病毒的病毒载体(tobacco rattle virus，TRV)，所具体利用的TRV2(一种常用载体)带有卡那霉素筛选标记和35S启动子，同时TRV2带有EcoR I和BamHI等多克隆位点，可以用来携带和转化外源基因。pGreenII-62-SK、pGreen II-0800-Luc购买于北京庄盟生物基因科技有限公司；酵母试验所使用的载体pGADT7以及pGBKT7由上海欧易生物医学科技有限公司提供。相关引物合成及测序工作，由睿博生物科技有限公司合成和提供。
下述实施例中用到的实验试剂包括：
植物RNA快速提取试剂盒为E.Z.N.A.TMPlant RNA Kit(OMEGABio-Tck，R6827)、反转录试剂盒为Promega的GoScriptTM、琼脂糖凝胶回收试剂盒购买自天根生物有限公司、In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)、Genome Walking Kit试剂盒以及酵母快速转化试剂盒购于大连宝生物工程有限公司。
LB液体培养基：1L蒸馏水中加入25g LB粉末，高温高压灭菌。
LB固体培养基：1L蒸馏水中加入25g LB粉末以及15g琼脂，高温高压灭菌。
10mmol/L MES：ddH2O溶解，过滤灭菌，-20℃储存备用。
10mmol/L MgCl2：ddH2O溶解，高温高压灭菌，4℃储存备用。
200μmol/L As：二甲基亚砜(DSMO)溶解，高温高压灭菌，-20℃储存备用。
实施例1
本实施例构建了百合LiMYB1及LiMYB330基因克隆以及瞬时过表达载体、沉默载体。
(1)百合LiMYB1及LiMYB330基因克隆
根据前期对于‘西伯利亚’百合转录组研究，选择特异编码序列为目标片段，设计PCR扩增用引物序列如下：
SEQ ID NO.6：LiMYB1-F：
ATGGGGAGGTCTCCATGCTGCG
SEQ ID NO.7：LiMYB1-R：
TCATTTCATCTCAAGGCCTCTATAGTCC
以‘西伯利亚’百合盛花期花瓣(先提取基因组，再反转录为cDNA)的cDNA为模板，进行PCR扩增获得LiMYB1和LiMYB330基因；
PCR扩增程序为：98℃，2min；98℃，10s，Tm，5s/15s(Tm值为55℃以上时，设置为5s，为55℃以下时，设定为15s)，72℃，30-60s/kb，共30-35个循环，随后终止反应。
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(图1)，切胶回收和和纯化连接到TOPO载体上，转化DH5α感受态细胞，PCR筛选阳性克隆，挑取阳性单克隆送睿博生物科技有限公司进行测序。
LiMYB330基因克隆步骤同上，PCR扩增用引物序列如下：
SEQ ID NO.8：LiMYB330-F：
ATGGGCAGGTCTCCTTGCTGTG
SEQ ID NO.9：LiMYB330-R：
CTACTGATAC ATACTCTGCCATCCTCC
最终获得LiMYB1开放阅读框序列639bp，编码212个氨基酸；LiMYB330的开放阅读框为756bp，编码251个氨基酸(图2)。
(2)构建重组pSuper1300-LiMYB1和pSuper1300-LiMYB330载体
将步骤(1)中的PCR扩增产物的引物加kpn I、xba I接头重新扩增，同时对空载体pSuper1300进行kpn I、xba I双酶切，分别回收酶切产物，按照In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)的体系及操作步骤进行，线性化载体片段与目的片段按照摩尔比1：5的量加入，将体系混合完全后，于50℃连接反应15min，随后连接。结束后，将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α，转化操作结束后将转化产物涂于50mg/L Kan的LB固体培养基上，37℃过夜培养。
挑选阳性单菌落扩增后进一步进行PCR鉴定，并结合测序验证，确保获得构建正确的重组载体pSuper1300-LiMYB1及pSuper1300-LiMYB330。
(3)构建重组TRV2-LiMYB1和TRV2-LiMYB330载体
采用双酶切体系将病毒载体TRV2载体线性化，根据EcoRⅠ和BamHⅠ酶的特性，进行双酶切，于37℃酶切2-3h以使载体充分线性化。酶切后进行电泳检测并回收片段。
选择MYB转录因子序列的编码区300-500bp设计引物，以上述克隆基因所采用的cDNA为模板进行PCR扩增并测序。将测序正确的菌液提取质粒后，以质粒为模板，根据In-Fusion连接原理，进行PCR扩增，并胶回收目的产物。将纯化后的带酶切位点的目的片段以及线性化的植物表达载体，按照In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech)的体系进行载体构建。经转化、筛选、测序后得到正确的病毒重组质粒。
实施例2
LiTPS2启动子的克隆：采用染色体步移法对LiTPS2的启动子进行克隆，参照Takara的Genome Walking Kit试剂盒的操作进行，具体步骤如下：
(1)特异性引物的设计
根据LiTPS2的序列(不少于500bp)，以需要扩增的未知区域方向，设计三个特异性引物SP1、SP2以及SP3。引物长度以22-26nt为宜，GC含量在45％-55％之间，退火温度Tm值在60-70℃即可。每两个引物之间的距离没有严格的规定，位置上SP2应在SP1的内侧，SP3应在SP2的内侧，其余要求与普通引物相同，结果如表1所示。
表1LiTPS2启动子克隆特异性引物
SEQ ID NO.10 SP1-F CCAAAGCCTCTAGATCAACATGAC
SEQ ID NO.11 SP2-F GCTGAGCACTGGATCGTCTGATGC
SEQ ID NO.12 SP3-F ATCCAAGGATCGAACCTCAGGGATACC
SEQ ID NO.13 ProLiTPS2-R GACCTCTGAA TTGAATGAGGTTTTGT
SEQ ID NO.14 ProLiTPS2-P1F GTGGGGTGATCCACGTAAGATCTC
SEQ ID NO.15 ProLiTPS2-P1R GAGAGAGTCA TCGTTTTGTTGCCA
SEQ ID NO.16 ProLiTPS2-P2F GAGATATCGGAAAGAATATGATCTT
SEQ ID NO.17 ProLiTPS2-P2R TTGAGGGAGAAAGAGATAAGAAA
SEQ ID NO.18 ProLiTPS2-P3F GGGTAAAAGACAAATTACTTCCAATAAA
SEQ ID NO.19 ProLiTPS2-P3R GTTGAGGGAGAAAGAGATAAGAAAA
(2)LiTPS2启动子全长序列的获得
以上述提取的基因组DNA为模板，取0.1-1μg进行反应。以试剂盒中提供的兼并引物AP1-AP4为上游引物，特异性引物SP1为下游引物，参照Takara的Genome Walking Kit试剂盒的体系及反应程序，进行1st PCR反应。根据1st PCR反应的凝胶电泳情况，将1st PCR反应液稀释1-1000倍。以1μl稀释后的反应液为模板，上一轮中筛选出的兼并引物为上游引物，特异性引物SP2为下游引物，进行2nd PCR反应。将2nd PCR反应液稀释1-1000倍。以1μl稀释后的反应液为模板，上一轮中筛选出的兼并引物为上游引物，特异性引物SP3为下游引物，进行3rd PCR反应。对上述PCR产物测序结果进行比对分析，根据测序正确的序列，设计上下游引物，以‘西伯利亚’百合基因组DNA为模板，进行PCR扩增。对扩增产物进行回收、转化、测序等，得到长为992bp的LiTPS2启动子序列(图3)。
实施例3
酵母单杂体系的构建：在实施例1的基础上，进一步构建酵母单杂体系，对百合转录因子LiMYB1和LiMYB330与LiTPS2启动子之间的互作关系进行验证。
(1)诱饵自激活验证
选择SmaI和XhoI两个酶切位点对pAbAi载体进行双酶切，利用In-Fusion方法将LiTPS2启动子的不同片段构建于pAbAi载体上。使用BstBl限制性内切酶将1μg的重组质粒线性化，65℃酶切反应2-4h。将1-5μg线性化的proLiTPS2-AbAi质粒(体积不超过15μl)加入到100μl的Y1H Gold感受态细胞中，并依次加入10μl预变性过的carrier DNA(预先95℃-100℃5min，冰上放置5min，重复操作一次)以及500μl的PEG/LiAc并吸打混匀。将混合好的反应液于30℃水浴30min(每15min时上下翻转6-8次混匀)，随后42℃水浴15min(每7.5min上下翻转)。水浴结束后5000rpm离心40s，然后用400μl的ddH2O重悬，离心后去上清。再次用50-100μlddH2O重悬菌体后，直接涂布于SD/-Ura平板上，29℃培养3-5天至有单克隆长出，并用Insert Check PCR Mix 1进行鉴定，具体反应体系及反应程序参照说明书。挑取单克隆的酵母菌于混合液中，并充分吸打混匀，按95℃，1min；98℃，10s，55℃，30s，68℃，2min，共30个循环的反应程序进行PCR鉴定。挑取鉴定为正确的单菌落，用0.9％的NaCl溶液重悬，使得OD600为0.002，吸取100μl的菌液，均匀的涂布于加有不同浓度AbA的SD/-Ura培养基上，29℃培养3-5天观察菌落生长状况，以确定抑制诱饵自激活的AbA浓度(AbA浓度最高可到1000ng/ml，若不能抑制诱饵生长，则次诱饵不适合该酵母单杂体系)。
(2)一对一互作验证
选择EcorI和BmaHI两个酶切位点对pAbAi载体进行双酶切，利用In-Fusion方法转录因子LiMYB1和LiMYB330分别构建于pGADT7载体上。酵母单杂一对一验证的方法参照Quick&Easy Yeast Transformation Mix(Takara)试剂盒的说明书进行，具体步骤为：挑取SD/-Ura平板上的菌落在SD/-Ura液体培养基中过夜培养，使得细胞数>5×107；将carrierDNA于95℃水浴5min，然后冰上放置进行预变性，对Quick&Easy Yeast TransformationMix进行彻底涡旋，然后按说明书上的体系进行混样。将过夜培养的酵母菌11000g条件下离心5min，弃上清后用300-400μl的无菌水重悬菌体，随后再3000g离心3min，与上一步中的混合液与菌体充分混合，45℃中孵育65-70min；反应结束后，无菌水稀释10倍和100倍，涂布于SD/-Leu以及SD/-Leu+AbA的平板上，29℃倒置培养3-5天，观察菌落生长状况。
试验结果表明，含有pGADT7::LiMYB1和pAbAi::LiTPS2启动子的Y1H酵母菌株能够在含有AbA的SD/-Leu培养基上正常生长；同样，LiMYB330也可以直接与LiTPS2启动子结合，从而在缺陷培养基上正常生长。然而，阴性对照的酵母菌株生长完全受到抑制(图4)。
这些结果表明，LiMYB1和LiMYB330能在酵母中结合LiTPS2的启动子，进而调控萜类物质的合成。
实施例4
酵母双杂体系的构建：在实施例1的基础上，进一步构建酵母双杂体系，对百合转录因子LiMYB1和LiMYB330之间的互作关系进行验证。
(1)自激活验证
采用In-Fusion的方法，将LiMYB1和LiMYB330的ORF片段分别构建到pGBKT7载体上，通过转化、测序等得到正确的pGBKT7::LiMYB1和pGBKT7::LiMYB330重组质粒。将构建好的诱饵载体质粒、pGBKT7空载分别转入Y2H感受态中，具体转化方法同酵母单杂中Y1H的转化过程。将转化后的菌液依次涂布于SD/-Trp、SD/-Trp+x-α-gal以及SD/-Trp/-His/-Ade的酵母缺陷培养基上，29℃培养3-5天，观察酵母的生长状况。若不能在SD/-Trp培养基上正常生长，表明该诱饵载体产生的蛋白对酵母细胞的生长有毒性，则不能用于后续试验；若能在SD/-Trp+x-α-gal上正常生长且变蓝，证明该诱饵载体产生的蛋白能激活Y2H感受态细胞中MEL1标签基因的表达；若能在SD/-Trp/-His/-Ade培养基上生长，则证明其能激活G1、G2启动子，当3个启动子均能被激活时，则需要通过加入适当浓度的AbA或者氨基三唑(3-AT)抑制自激活活性后才能用于后续试验。
(2)一对一验证
构建相应的pGADT7::LiMYB330重组质粒，将上一步筛选的没有毒性和自激活的pGBKT7::LiMYB1质粒与pGADT7::LiMYB330按浓度比为1：2的比例共同转化到Y2H酵母感受态中，转化方法同上。将转化好的菌液依次涂布于SD/-Leu/-Trp以及SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His+x-α-gal的酵母缺陷培养基上，29℃培养3-5天，观察酵母的生长状况。
试验结果显示，转化的酵母在含有X-α-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/培养基中生长良好并呈蓝色(黑晕部分)，表明LiMYB330与LiMYB1相互作用(图5)。
实施例5
双荧光素酶体系的构建：在实施例1的基础上，进一步构建酵双荧光素酶体系，对LiMYB1-LiMYB330转录复合体调控百合萜类花香物质合成酶基因LiTPS2的表达进行功能验证。
(1)载体构建
采用In-Fusion方法，将LiTPS2的不同片段的启动子序列构建到pGreen II-0800-Luc载体上，将LiMYB1和LiMYB330的全长序列构建到pGreenII-62-SK载体上。
(2)烟草双荧光素酶体系构建
将构建好的重组载体质粒转化到GV3101(含pSoup)的农杆菌菌株中，挑取单菌落于LB液体培养基中(LB+50μg/ml Rif+50μg/ml Kan)，28℃培养12-16h。将培养好的菌液于5000rpm离心10min，去掉上清液，收集菌体，用配制好的侵染液将菌体重悬至OD600为1。随后将LiMYB1-SK和LiMYB330菌液分别与LiTPS2-promoter-LUC菌液以10：1的体积比均匀混合，选择生长4周左右长势良好的本氏烟草(N.benthamiana)，将混合好的菌液从烟草背面注射，每片叶子上都注射有空载SK+LiTPS2-promoter-LUC作为阴性对照。将注射好的烟草黑暗处理12h，正常光照培养2天。
侵染3天后，用直径7mm的圆形打孔器在注射点周围取样，每片叶子取4个圆片，取6片叶子。采用Dual-LuciferaseReporter(DLRTM)Assay System试剂盒(Promega，美国)对样品进行处理。将叶盘放于2ml的离心管中，加500μl的PLB溶液进行研磨，13000rpm离心30s后，取上清备用。检测时，在96孔板中加入100μl的LARII溶液，以及20μl的上清液，通过Envision多功能酶标仪(Perkin，英国)对LUC值进行检测，随后继续加入100μl的Stop&Reagent，对REN值进行测定。以LUC/REN的值来反映转录因子对LiTPS2的调控活性，将阴性对照空载SK+LiTPS2-promoter-LUC的比值设为1，来计算LiMYBs对LiTPS2启动子的相对LUC/REN值。
本发明对SK-LiMYB1+SK-LiMYB330共注射后的烟草叶片进行双荧光素酶分析，由图6可知，当LiMYB1与LiMYB330转录因子共同作用时，均比单独的转录因子激活LiTPS2的作用要强，因此，本发明中百合MYBs转录因子复合体可以增强对LiTPS2的转录激活能力。
实施例6
在实施例1基础上，利用农杆菌瞬时介导技术，进一步将所构建的重组载体pSuper1300-LiMYB1和pSuper1300-LiMYB330分别瞬时转化百合花瓣，并就相关植物表型变化情况做了验证分析。
(1)转化农杆菌
参考实施例1操作，制备pSuper1300-GFP重组载体作为对照，具体转化过程为：
将pSuper1300-GFP(载体对照)及pSuper1300-LiMYB1和pSuper1300-LiMYB330的阳性克隆质粒，分别通过冻融法转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，利用含50mg/L Kan和50mg/L Rif的LB平板进行培养筛选，在28℃倒置培养2d后，利用菌落PCR筛选带有目的基因的农杆菌。
(2)制备转染用菌液
将步骤(1)经过阳性克隆检测过的菌液按1/100接种于10-20ml含有两种抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm培养5-8h至OD600＝0.6-0.8，将摇好的菌液(为保证农杆菌的活性，菌液应该现用现摇)于离心机中4000rpm离心5min，去上清。用相应体积的侵染液(以无菌水为母液，10mmol/L MES、10mmol/L MgCl2、200μmol/LAs，PH＝5.6)重悬菌体至OD600为0.6-0.8。
(3)瞬时转化
将步骤(2)中的侵染液静置2-3h后，用1ml的注射器对初开期的百合内轮花瓣进行注射，从花瓣背面进行注射，空载pSuper1300-GFP为对照。为消除不同花朵开花状态对试验结果的影响，注射时保证每朵花的内轮花瓣上都注射有空载作为对照，并做好标记。将注射后的百合花瓣于黑暗中培养12h，移至正常光照环境下培养4-5天，待花瓣至盛花期时进行取样，采用固相微萃取与气质联用技术(SPME-GC/MS)对后续花香测定及qRT-PCR对关键基因表达量进行分析。
在LiMYB1-OE花瓣中，与空载对照相比，罗勒烯和芳樟醇的含量分别增加了3.9倍和4.9倍；当LiMYB330在花瓣中过度表达时，芳樟醇的含量表现出显著的上调，罗勒烯的含量出现轻微的上调(图7)。在LiMYB1-OE花瓣中，与空载对照相比，LiDXS、LiDXR和LiTPS2的表达量分别上调了2.3倍、2.4倍和4.7倍(图8)；在瞬时过表达LiMYB330后，这几个关键结构基因均表现出高于对照组的表达量，分别增加了3.7、1.5和2.5倍(图9)。
实施例7
在实施例1基础上，利用农杆菌介导的VIGS技术，进一步将所构建的重组TRV2-LiMYB1和TRV2-LiMYB330载体转化了百合，并就相关植物表型变化情况做了验证分析，
(1)转化农杆菌
将TRV2-GFP(载体对照)及TRV2-LiMYB1和RV2-LiMYB330的阳性克隆质粒，分别通过冻融法转化进入农杆菌GV3101感受态细胞中，具体过程与实施例5中的步骤(1)相同。
(2)制备转染用菌液
将步骤(1)中经过阳性克隆检测单菌落于2ml含有100μg/ml Kan+50μg/ml Rif抗生素的LB液体培养基中，28℃，200rpm摇床中培养12-16h，随后以1/20的比例，将菌液转移到诱导LB培养基(100μg/ml Kan+50μg/ml Rif+10mmol/L MES+20μmol/L AS)中继续28℃，200rpm培养12-16h。将培养好的菌液于5000rpm离心10min，去掉上清液，收集菌体。制备侵染液的过程同实施例5中的步骤(2)。
(3)瞬时转化
将步骤(2)中的侵染液静置2-3h后进行注射，侵染前需将含有TRV1载体的农杆菌与含有TRV2载体的农杆菌以1：1的体积混合后注射。花瓣注射的方法同实施例5中的步骤(3)，空载TRV1+空载TRV2的菌液为对照。取样后对花香及相关基因表达量进行测定。
结果表明，在沉默LiMYB1的花瓣中，罗勒烯和芳樟醇的含量与对照相比分别降低了2.1倍和3.2倍；当抑制LiMYB330的表达时，芳樟醇和罗勒烯含量也出现了一定程度的降低，其含量分别降低2.2倍和1.7倍(图10)。qRT-PCR结果显示，与对照相比，LiDXR和LiTPS2在沉默LiMYB1的花瓣中的表达量分别下降了30％和60％，而LiDXS的表达量没有显著的变化(图11)。LiMYB330的沉默也使LiDXS、LiDXR和LiTPS2的表达量分别下降了27％、25％和58％(图12)。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种启动子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.与权利要求1所述启动子相结合的转录因子，其特征在于，其为转录因子LiMYB1或转录因子LiMYB330；
转录因子LiMYB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
转录因子LiMYB330的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求2所述的转录因子，其特征在于，LiMYB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；和/或，LiMYB330的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.一种转录复合体，其特征在于，包括转录因子LiMYB1和转录因子LiMYB330；转录因子LiMYB1和转录因子LiMYB330的氨基酸序列同权利要求2。
5.根据权利要求4所述的转录复合体，其特征在于，转录因子LiMYB1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；转录因子LiMYB330的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种生物材料，其特征在于，其中包括权利要求1所述的启动子、或权利要求2或3所述的转录因子、或权利要求4或5所述的转录复合体；所述生物材料为重组DNA、质粒载体、病毒载体或宿主细胞。
7.权利要求1所述的启动子、或权利要求2或3所述的转录因子、或权利要求4或5所述的转录复合体、或权利要求6所述的生物材料在调控百合萜烯类花香物质合成中的应用。
8.权利要求1所述的启动子、或权利要求2或3所述的转录因子、或权利要求4或5所述的转录复合体、或权利要求6所述的生物材料在调控百合单萜合成关键酶基因表达中的应用；优选地，所述百合单萜合成关键酶基因为LiDXS、LiDXR或LiTPS2中的至少一种。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述转录因子或转录复合体通过与权利要求1所述的启动子结合，调控百合萜烯类花香物质合成或调控百合单萜合成酶基因表达。
10.权利要求1所述的启动子、或权利要求2或3所述的转录因子、或权利要求4或5所述的转录复合体、或权利要求6所述的生物材料在制备转基因植物或植物育种中的应用。
CN202310292095.8A 2023-03-23 2023-03-23 调控百合萜类花香物质合成的转录复合体及其应用 Pending CN116478986A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310292095.8A CN116478986A (zh) 2023-03-23 2023-03-23 调控百合萜类花香物质合成的转录复合体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310292095.8A CN116478986A (zh) 2023-03-23 2023-03-23 调控百合萜类花香物质合成的转录复合体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116478986A true CN116478986A (zh) 2023-07-25

Family

ID=87218554

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310292095.8A Pending CN116478986A (zh) 2023-03-23 2023-03-23 调控百合萜类花香物质合成的转录复合体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116478986A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104946665B (zh) GmMYB62在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用
CN110872598B (zh) 一种棉花抗旱相关基因GhDT1及其应用
CN111548400B (zh) 一种玫瑰花香调控基因RrMYB114及其应用
CN113563442A (zh) 抗旱相关蛋白IbSPB1及其编码基因与应用
CN114369147B (zh) Bfne基因在番茄株型改良和生物产量提高中的应用
CN111434679B (zh) 株型相关蛋白在调控植物株型中的应用
CN104829699B (zh) 一种与植物抗逆性相关蛋白Gshdz4及其编码基因与应用
CN112010955B (zh) 小麦抗赤霉病相关蛋白TaRBL及其编码基因与应用
CN106749584A (zh) 一种与植物耐碱性相关蛋白GsERF71及其编码基因与应用
CN114854703B (zh) 一种黄酮合酶i/黄烷酮-3-羟化酶及在黄酮类化合物合成领域的应用
CN115925848A (zh) 一种石斛ERF类转录因子基因DoERF5及其应用
CN112538107B (zh) 三萜相关蛋白质与其编码基因以及在提高植物三萜化合物含量中的应用
CN116478986A (zh) 调控百合萜类花香物质合成的转录复合体及其应用
CN114316008A (zh) 转录因子lcmyb4在调控山鸡椒萜类合成中的应用
JP3444412B2 (ja) アブシジン酸応答要素−結合転写因子
CN109652419B (zh) 一种受核盘菌诱导的油菜启动子pBnGH、鉴定方法和应用
CN114106122B (zh) 一种柳杉转录因子CfMYB1基因及其应用
CN114561387B (zh) 花生启动子及其应用
CN112725353B (zh) 重组载体、转化体、用于扩增AtNAC58基因的引物及其制备方法和应用
CN116949063B (zh) 一种低温响应转录因子及其应用
CN116970053B (zh) 植物类胡萝卜素合成相关蛋白DcAPRR2及其编码基因与应用
CN114524868B (zh) 甘薯叶片发育及类黄酮强化相关蛋白IbBBX29及其编码基因与应用
CN114875043B (zh) 一种参与不定根发育的白桦BpPIF4基因及其应用
CN111019954B (zh) 烟草蛋白actb及其应用
CN111118029B (zh) 一种调控马尾松开花的关键基因PmARF6及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination