CN114106122B

CN114106122B - 一种柳杉转录因子CfMYB1基因及其应用

Info

Publication number: CN114106122B
Application number: CN202111382740.2A
Authority: CN
Inventors: 徐进; 杨俊杰
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2041-11-19
Also published as: CN114106122A

Abstract

本发明公开了一种柳杉MYB转录因子CfMYB1基因及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明所克隆的转录因子CfMYB1，属于MYB转录因子家族中的R2R3‑MYB转录因子。本发明所克隆的MYB基因其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。本发明通过基因克隆、序列分析、表达载体构建及转基因功能验证，揭示了柳杉CfMYB1转录因子的序列信息及生物学功能，并提供了一种应用该基因的方法，过表达该基因可使转基因植株的高度、叶片厚度、茎的粗细降低，表明本发明所克隆的基因将在柳杉木材性状改良及园艺技术领域中发挥重要的作用。

Description

一种柳杉转录因子CfMYB1基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种柳杉(Cryptomeriafortunei)转录因子CfMYB1基因及其应用。

背景技术

转录因子(Transcription factors，TF)是一类能够通过特异性结合到顺式作用元件，如启动子等的特定位点，从而对靶基因的转录起到促进或抑制作用的反式作用蛋白，是转录表达调控网络的主要组成部分。MYB转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一，MYB转录因子的共同特征是在其N端有一段大约长50个氨基酸组成的高度保守的MYB结构域，在其C端通常具有富含酸性氨基酸的转录激活域，它们通常折叠成双亲性的α-螺旋发挥生物学作用(Wilkins等，Plant Physiology，149(2)，981-993，2008)。MYB转录因子的结构域含有1-4个不完全重复序列，这种不完全重复序列在色氨酸的存在下可形成高度保守的螺旋-转角-螺旋(Helix-Turn-Helix，HTH)结构，根据不完全重复序列的个数，可将MYB转录因子分为R1/R2类、R2R3类、R1R2R3类以及4R类。MYB转录因子参与到众多的生物学过程，包括次生代谢调控(Yang等，Plant Physiology，175，2017)、信号转导(Kim等，Molecules，22(9)，1549-1562，2017)和木材形成(Li等，Plant Cell，119(3)，553-563，2014)等。

柳杉(Cryptomeria fortunei)属于杉科柳杉属，常绿高大乔木，为我国特有针叶树种；目前栽植范围广泛，在江苏南部、浙江、安徽南部、河南、湖北、湖南、云贵川、两广等地均有栽培，且生长良好。柳杉喜温暖湿润的气候和土壤酸碱适宜的山地；具有材质较轻软，纹理通直，结构细，耐腐蚀性强，易加工，是工业上良好的用材树种，同时因其树形美观也可用作园林树种。

目前关于柳杉MYB转录因子的研究仅限于日本柳杉(C..japonica)，而在中国柳杉中几乎为空白，缺乏大量的理论和实验基础，因此尽快开展关于柳杉转录因子的研究亟需更多的关注，不仅有助于增加树种的优良特性，也有助于国民经济的发展和生态环境的保护。

发明内容

针对关于柳杉转录因子CfMYB1基因研究几近空白的现状，本发明所要解决的技术问题之一在于克隆一种柳杉转录因子CfMYB1基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述柳杉转录因子CfMYB1基因的具体应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种柳杉转录因子CfMYB1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述柳杉转录因子CfMYB1基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述柳杉转录因子CfMYB1基因的载体。

进一步地，所述载体是植物重组表达载体。

所述柳杉转录因子CfMYB1基因在降低植物植株高度、叶片大小或次生壁厚度中的应用。

进一步地，所述的应用，具体为：

1)构建所述柳杉转录因子CfMYB1基因的植物重组表达载体；

2)将所构建的柳杉转录因子CfMYB1基因的植物重组表达载体转化到植物组织或植物细胞中；

3)培育筛选，得到高度、叶片大小和次生壁厚度降低的转基因植株。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明通过利用前期关于柳杉不同发育时期维管形成层的转录组数据，挖掘筛选出柳杉维管形成层相关的MYB转录因子，并克隆出转录因子CfMYB1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。通过序列比对、进化分析及转基因功能验证，揭示了柳杉转录因子CfMYB1基因的序列信息及生物学功能，并提供了一种应用该基因的方法，通过构建表达载体转化植株，使得转基因植株表型发生改变，包括植株高度、叶片大小、次生壁厚度等都有所降低，能使转基因植株表型发生改变的基因在园艺技术领域具有重要应用前景，因此本发明所提供的CfMYB1基因及其应用将在柳杉木材性状改良及园艺技术领域中发挥重要的作用。

附图说明

图1是柳杉转录因子CfMYB1基因的扩增产物凝胶电泳图；

图2是柳杉转录因子CfMYB1基因的氨基酸序列比对图；

图3是柳杉转录因子CfMYB1基因的系统进化树分析图；

图4是柳杉转录因子CfMYB1基因表达载体图；

图5是烟草植株株高比较图，图左边表示野生型，图右表示转CfMYB1基因植株；

图6是烟草叶片比较图，图左边表示野生型，图右表示转CfMYB1基因植株；

图7是烟草植株次生壁厚度图，图左边表示野生型，图右表示转CfMYB1植株，图中标尺为50μm。

具体实施方式

下面结合具体地实施方法对本发明所使用的方法进一步描述。如以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所具体描述的方法进行，或者按照试剂和产品说明书进行。

实施例1：柳杉转录因子CfMYB1基因的克隆

1、RNA提取

本发明所使用的实验材料为2019年5月13日于南京林业大学后山收集一株约60年生柳杉的茎干维管形成层细胞，RNA的提取使用百泰克生物技术公司的离心柱型RNA提取试剂盒进行提取，后贮存与-80度低温冰箱备用。

2、RNA浓度和完整性检测

使用Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，USA)可见光分光光度计检测提取RNA的OD260/OD280、OD260/OD230比值。取2μL提取的RNA溶液，琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1％胶浓度，1xTAE电泳缓冲液，150V，200A，20min)检测RNA的完整性。

3、eDNA第一链的合成和反转录PCR

采用南京诺唯赞公司的反转录eDNA第一链合成试剂盒(R312-01/02)进行反转录。反应体系(按顺序添加)和条件分别为：1μg总RNA，RNase-free ddH2O(到8μL)，5x gDNAwiper Mix 2μL，10x RT Mix 2μL，HiScript Enzyme Mix 2μL，Oligo(dT)20VN 1μL，RNase-Free ddH₂O 5μL；65℃加热5min，迅速置于冰上，静置2min，42℃，2min，37℃(可提高至50℃)45min，85℃5sec。反应结束后，将cDNA放在-20℃冰箱中保存并在半年内使用，长期保存置于-80℃。

4、PCR扩增柳杉转录因子CfMYB1基因的CDS区

根据前期柳杉维管形成层转录组数据及基因注释信息，获得柳杉转录因子CfMYB1基因的Unigene序列。在其CDS区域外上下游设计两条引物CfMYB1-F(5’-GCTAGACATCTCCTTGGAATCCA-3’)和CfMYB1-R(5’-ATGGGAAGATCTCCCTGCTGT-3’)作为PCR反应的引物。

所用的PCR高保真酶为南京诺唯赞生物技术公司的Phanta高保真酶(P515-01/02/03)，反应体系为50μL：2x Phanta Max Master Mix 25μL，cDNA 1μL，ddH₂O 22μL，Primer-F，R各1μL。反应程序为：95℃3min，95℃15s，55℃15s，35cycles，72℃ 30-60s/kb，72℃5min。反应结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离得到长约771bp，如图1所示。纯化回收后，送南京金斯瑞公司测序。测序结果如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列长度为771bp，其编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，由256个氨基酸组成的蛋白质。

实施例2：柳杉转录因子CfMYB1基因的功能分析

1、柳杉转录因子CfMYB1基因的序列比对分析

为了确定所克隆的基因属于R2R3-MYB转录因子，首先对其序列信息进行比对分析。使用DNAMAN将所克隆出来的基因与其他物种中已知的MYB转录因子进行序列比对，结果如图2所示，结果表明本发明所克隆的基因属于MYB转录因子家族，且每18-20个氨基酸间隔一个色氨酸(W)，R3结构域的第一个色氨酸通常会被I/F/L所取代。

2、柳杉转录因子CfMYB1基因的系统进化树分析

为了确定本发明所克隆的转录因子CfMYB1基因的系统进化关系，使用MEGA7与其他物种已经验证研究功能的转录因子进行系统进化分析，结果如图3所示，结果表明其可能具有抑制木质素合成的功能。

3、柳杉转录因子CfMYB1基因的转基因功能验证

1)过表达载体构建

本发明所使用的过表达载体为PBI121，载体图谱如图4所示。通过选择合适的内切酶进行双酶切将载体线性化，本发明所使用的两个内切酶为BamH I酶、Xba I酶。利用南京诺唯赞生物技术公司的CE Design软件设计同源重组引物(5’-3’)：

CE-CfMYB1-F：gagaacacgggggactctagaATGGGAAGATCTCCCTGCTGT

CE-CfMYB1-R：ggactgaccacccggggatccTCATAACCCTAATCCTAGCCTACTGG

引物由上海捷瑞生物技术公司合成。重组反应使用南京诺唯赞生物技术公司的II One Step Cloning Kit C112试剂盒。

双酶切体系为：PBI121载体1μg，BamH I内切酶1μL，Xba I内切酶1μL，10x QuickCut Buffer 5μL，ddH₂O添加到50μL，PCR反应条件为：37℃ 30min，80℃ 20min，反应结束后，将混合液放入-20℃冻存5min后再使用。

重组反应体系为：PBI121线性化载体(50-200ng)，目的片段(10-200ng)，5xCE IIBuffer 4μL，ExnaseII 2μL，ddH₂O添加到20μL，PCR反应条件为：37℃30min，反应结束后-20℃保存。

最终获得连接产物，即PBI121-CfMYB1质粒。

2)转化大肠杆菌DH5α

于冰上融化冻存于-80℃冰箱的Phage ResistantChemicallyCompetent Cell大肠杆菌感受态细胞；

于超净台中，在1.5mL无菌离心管中加入10μL连接产物与50-100μL刚刚解冻的感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，期间不要接触离心管，同时42℃水浴准备；

42℃水浴热激45s，迅速置于冰上1min，时间要求精确，期间不要动摇离心管；加入890μL SOC液体培养基或液体LB培养基(不含任何抗生素)，37℃、200rpm摇菌，恒温摇床中培养60min；

取8μL的500Mm IPTG和40μL的20mg/mL X-gal混合，均匀涂布在含有Kan(50mg/mL)抗性的固体LB平板上，37℃培养箱中放置30min，待吸收；

摇菌结束后，3000rpm离心4min，倒掉上清，留下约100-120μL菌液，用枪头轻柔吹打混匀；

待IPTG和X-gal被吸收后，灼烧涂布棒，用无菌涂布棒将菌液均匀涂布于LB平板上，于37℃培养箱中倒置培养12-16h。

3)转化农杆菌GV3101：

挑选阳性单克隆的菌落，进行菌落PCR检测鉴定，反应体系为：2xTaq Master Mix10.0μL，菌液1μL，引物各1μL，ddH₂O 7μL，PCR反应条件为：95℃ 5min，95℃ 15s，56℃ 15s，72℃ 1min/kb35cycles，72℃ 5min。将菌检正确的阳性克隆菌液制备质粒DNA转化农杆菌GC3101，步骤如下：

(1)取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或者手心融化至冰水混合状态后插入冰中；

(2)在100μL感受态细胞中加入0.01-1μg质粒DNA，用手轻弹拨打混匀；

(3)依次置于冰上冰浴5min、液氮速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min；

(4)加入700μL LB液体培养基(不含任何抗生素)，于28℃、200rpm，摇菌振荡3h；

(5)6000rpm离心1min；

(6)弃部分上清，留取约100-120μL菌液，轻轻吹打混匀重悬菌块，涂布于含相应抗生素的LB(Kan+)固体平板上，静置15min，待表面菌液晾干；

(7)倒置放于28℃培养箱暗培养42-48h；

(8)PCR检测阳性菌落，4℃保存，用于后续对烟草的转基因侵染。

4)农杆菌活化与侵染

(1)将检测正确的农杆菌菌液活化扩繁，放入100mL无菌锥形瓶中，按照1∶50稀释至50mL LB液体培养基中(Kan+Rif)，28℃、200rpm培养36-48h，直至菌液颜色浑浊，OD值A600为1.0左右；

(2)将该菌液转入无菌离心管中，于室温条件下，5000rpm离心10min，弃上清，菌体用1/2MS或MS液体培养基重悬，稀释至A600＝0.6左右，用于转化；

(3)将稀释后的菌液放入恒温摇床，28℃、200rpm培养30min，用于侵染。

5)烟草叶盘介导侵染

(1)预培养：于超净台中，将野生型不具有抗性的烟草叶片剪成约1cm*1cm的叶盘，暗培养2-3d，待叶片边缘卷曲；

(2)共培养：将叶盘放入稀释过的菌液中，浸泡振荡侵染10-15min，取出叶盘放于无菌滤纸上吸走多余菌液。将侵染后的叶盘放入不含任何抗生素的MS固体培养基上(培养基上平铺一层无菌滤纸)，28℃暗培养2-3d；

(3)分化培养：将黑暗中共培养的叶盘转移到分化培养基中进行分化培养(MS培养基，2.0mg/L6-BA，0.05mg/LNAA，50mg/LKan，100mg/LTMT)；

(4)筛选培养：将20-25d左右分化的愈伤组织重新接入到筛选培养基中，继续分化出不定芽(MS培养基，2.0mg/L6-BA，0.05mg/L NAA，50mg/L Kan，150mg/L TMT)；

(5)壮苗培养：约2-3周后，待不定芽长至1cm左右时切下，转移到壮苗培养基中进行壮苗培养(MS培养基，1.0mg/L6-BA，0.1mg/LNAA，50mg/L Kan，200mg/L TMT)；

(6)生根培养：待不定芽长至1-2cm时放入生根培养基中(1/2MS培养基，200mg/LTMT)约10-15d长出不定根，将根系生长良好的无菌幼苗炼苗4-5d后即可转入土中培养；

(7)同时设定未经农杆菌侵染的野生型烟草叶盘作为阴性对照。

6)烟草转基因植株阳性克隆苗的鉴定

取长势良好的烟草叶片、茎干、根系，立即置于液氮中保存，使用百泰克生物技术公司的试剂盒提取总RNA，具体步骤参见说明书。后采用Nanodrop2000(Thermo FisherScientific，Wilmington，DE，USA)可见光分光光度计检测提取RNA的OD260/OD280、OD 260/OD 230比值。取2μL提取的RNA溶液，琼脂糖凝胶电泳(电泳条件：1％胶浓度，1xTAE电泳缓冲液，150V，200A，20min)检测RNA的完整性。使用插入片段的特异性引物，所用的PCR高保真酶为南京诺唯赞生物技术公司的Phanta高保真酶(P515-01/02/03)，反应体系为50μL：2xPhanta Max Master Mix 25μL，cDNA 1μL，ddH₂O 22μL，Primer-F，R各1μL。反应程序为：95℃ 3min，95℃ 15s，55℃ 15s，35cycles，72℃ 30-60s/kb，72℃ 5min。反应结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离得到长约771bp。

7)转基因植株表型观察及次生壁厚度观测

对阳性克隆植株进行株高、叶片大小进行观察，同时使用环境扫描电镜(scanningelectron microscope，SEM)观察次生细胞壁厚度。

结果如图5-7所示，与野生型相比，转CfMYB1植株的株高降低和叶片变小；另外，次生壁厚度观察结果表明：与野生型相比，转CfMYB1植株的次生壁厚度显著下降。通过表型观察及次生壁厚度观察结果表明，柳杉CfMYB1具有抑制次生壁合成的作用。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种柳杉转录因子CfMYB1基因及其应用

<130> 100

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 771

<212> DNA

<213> Cryptomeria fortunei

<400> 1

atgggaagat ctccctgctg tgaaaaaact catacaaata aaggagcatg gaccaaagaa 60

gaagatgaca agcttattgc ctacattcaa gcccatggtg aaggctgctg gaggtccctc 120

cccaaggcag cagggcttct gagatgtggg aagagctgca ggctaaggtg gataaactat 180

ttgaggcctg atctcaagcg ggggaacttc tctgaagaag aagatgaact catcatcaag 240

ctccaactcc tcctgggaaa caaatggtct ctgattgcag ggagattgcc tgggcggaca 300

gacaatgaaa taaagaatta ctggaacacc cacatcaaga gaaaattgct gagccgggga 360

atcgacccac agtcacgccg tcctattcag cccttccata acgatggcag cagcagtagc 420

agagacagca ggtctcccaa tcaagaaatt ttaatggcgg atttctttca gactgagctt 480

tcaactgtga caagcacttt ggatcgtgct gcttcagatg gtaccagtgg aagcgaagag 540

aagcctgatg tgaatctgga tttgtctatc agtttgcctt ctttttcccc tccttgtaat 600

attagagaag ctgtggattc caaggagatg tctagcagta aatcatggaa tatggatttc 660

caaatggatt ccaaggagat gaatagcagc aaatcatgga atatcgattt ccaaatgaat 720

tacagcagat atgatgaaga aagtgccagt aggctaggat tagggttatg a 771

<210> 2

<211> 256

<212> PRT

<213> Cryptomeria fortunei

<400> 2

Met Gly Arg Ser Pro Cys Cys Glu Lys Thr His Thr Asn Lys Gly Ala

1 5 10 15

Trp Thr Lys Glu Glu Asp Asp Lys Leu Ile Ala Tyr Ile Gln Ala His

20 25 30

Gly Glu Gly Cys Trp Arg Ser Leu Pro Lys Ala Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Phe Ser Glu Glu Glu Asp Glu Leu Ile Ile Lys

65 70 75 80

Leu Gln Leu Leu Leu Gly Asn Lys Trp Ser Leu Ile Ala Gly Arg Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Ile

100 105 110

Lys Arg Lys Leu Leu Ser Arg Gly Ile Asp Pro Gln Ser Arg Arg Pro

115 120 125

Ile Gln Pro Phe His Asn Asp Gly Ser Ser Ser Ser Arg Asp Ser Arg

130 135 140

Ser Pro Asn Gln Glu Ile Leu Met Ala Asp Phe Phe Gln Thr Glu Leu

145 150 155 160

Ser Thr Val Thr Ser Thr Leu Asp Arg Ala Ala Ser Asp Gly Thr Ser

165 170 175

Gly Ser Glu Glu Lys Pro Asp Val Asn Leu Asp Leu Ser Ile Ser Leu

180 185 190

Pro Ser Phe Ser Pro Pro Cys Asn Ile Arg Glu Ala Val Asp Ser Lys

195 200 205

Glu Met Ser Ser Ser Lys Ser Trp Asn Met Asp Phe Gln Met Asp Ser

210 215 220

Lys Glu Met Asn Ser Ser Lys Ser Trp Asn Ile Asp Phe Gln Met Asn

225 230 235 240

Tyr Ser Arg Tyr Asp Glu Glu Ser Ala Ser Arg Leu Gly Leu Gly Leu

245 250 255

Claims

1.柳杉转录因子CfMYB1基因在降低烟草植株高度、叶片大小或次生壁厚度中的应用，所述柳杉转录因子CfMYB1基因核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。