CN113897374B

CN113897374B - 一种柳杉转录因子CfMYB4基因及其应用

Info

Publication number: CN113897374B
Application number: CN202111381940.6A
Authority: CN
Inventors: 徐进; 杨俊杰
Original assignee: Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Forestry University
Priority date: 2021-11-19
Filing date: 2021-11-19
Publication date: 2023-01-17
Anticipated expiration: 2041-11-19
Also published as: CN113897374A

Abstract

本发明公开了一种柳杉CfMYB4基因及其应用，属于植物分子生物学技术领域。本发明所克隆的CfMYB4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过基因克隆，多重序列比对，系统进化分析及功能验证，证实了CfMYB4基因的进化关系及生物学功能，并提供了一种该基因在促进木质素合成及次生壁形成的应用手段。本发明所克隆的CfMYB4基因将在柳杉材性相关遗传改良中发挥重要的作用。

Description

一种柳杉转录因子CfMYB4基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，更具体地说，涉及一种柳杉 (Cryptomeriafortunei)转录因子CfMYB4基因及其应用。

背景技术

转录因子(Transcription factors，TF)是能调控基因表达的蛋白质分子，具有特定结构，通常与真核生物启动子区的顺式作用元件特异性结合并发挥作用。

MYB基因家族是植物特有的转录因子家族，其共同特征是在其N端有一段大约长50个氨基酸组成的高度保守的MYB结构域，在其C端通常具有富含酸性氨基酸的转录激活域，以螺旋-转角-螺旋结构(HTH)发挥生物学功能。 MYB转录因子参与到众多的生物学过程，包括冷胁迫响应、干旱胁迫响应、黄酮物质的合成与次生壁形成等。

柳杉(Cryptomeria fortunei)属杉科柳杉属，又名长叶孔雀松。乔木，高达 48米，胸径可达2米多，树冠狭圆锥形或圆锥形；树皮红棕色，纤维状，裂成长条片状脱落；大枝近轮生，平展或斜展；小枝细长，常下垂，绿色，枝条中部的叶较长，常向两端逐渐变短。叶钻形略向内弯曲，先端内曲，四边有气孔线，长1-1.5厘米，果枝的叶通常较短，幼树及萌芽枝的叶长达2.4厘米，四面有气孔线。

目前关于柳杉MYB转录因子的研究几乎为空白，缺乏大量的理论和实验基础，因此开展关于柳杉R2R3-MYB转录因子的研究，不仅有助于增加树种的优良特性，也有助于国民经济的发展和生态环境的保护。

发明内容

针对关于柳杉转录因子CfMYB4基因研究几近空白的现状，本发明所要解决的技术问题之一在于克隆了一种柳杉转录因子CfMYB4基因。本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述柳杉转录因子CfMYB4基因的具体应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种柳杉转录因子CfMYB4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述柳杉转录因子CfMYB4基因的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

含有所述柳杉转录因子CfMYB4基因的载体。

进一步地，所述载体是植物重组表达载体。

所述柳杉转录因子CfMYB4基因在使植物植株增高、叶片增大增厚或细胞壁加厚中的应用。

进一步地，所述的应用，具体为：

1)构建所述柳杉转录因子CfMYB4基因的植物重组表达载体；

2)将所构建的柳杉转录因子CfMYB4基因的植物重组表达载体转化到植物组织或植物细胞中；

3)培育筛选，得到植株增高、叶片增大增厚或细胞壁加厚的转基因植物植株。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明深度挖掘柳杉维管形成层转录组数据，筛选并成功克隆出CfMYB4 基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。通过多重序列比对、遗传进化分析及功能验证，揭示了柳杉CfMYB4基因的生物学功能，并提供了一种应用该基因促进次生壁增厚的方法，本发明所克隆的 CfMYB4基因将在柳杉材性相关遗传改良中发挥重要的作用。

附图说明

图1是柳杉CfMYB4基因凝胶电泳图；

图2是柳杉CfMYB4基因的多重序列比对图；

图3是柳杉CfMYB4基因的系统进化分析图；

图4是柳杉转录因子CfMYB4基因过表达载体图；

图5是转CfMYB4植株株高比较图，图左表示野生型，图右表示转CfMYB4 植株；

图6是转CfMYB4植株叶片比较图，图左表示野生型，图右表示转CfMYB4 植株；

图7是转CfMYB4基因植株细胞壁厚度图，图左表示野生型，图右表示转 CfMYB4植株(图中标尺为50μm)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。如以下实施例中未作具体说明的分子生物学试验方法，均参照产品说明书进行。

实施例1：柳杉转录因子CfMYB4基因的克隆

1、RNA提取

实验材料为在2019年5月13日采集于南京林业大学校园后山一株约60年生的长势良好的柳杉茎干维管形成层细胞，总RNA提取使用百泰克生物技术公司的离心柱型RNA提取试剂盒进行提取。

2、cDNA第一链的合成和反转录PCR

采用南京诺唯赞公司的反转录eDNA第一链合成试剂盒(R312-01/02)进行反转录。反应体系(按顺序添加)和条件分别为均按照说明书进行操作。

3、CfMYB4基因克隆

设计CfMYB4基因的上下游引物CfMYB4-F(ACAGTTATCTGTG TTGTGTGAATAAGAA)和CfMYB4-R(AAACCCAAACTCAGAAAAGGC)作为 PCR反应的引物(5’-3’)。

PCR扩增及反应条件均按照说明书进行。反应结束后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离得到长约1269bp，如图1所示。纯化回收后，送南京金斯瑞公司测序。测序结果如SEQID NO.1所示，核苷酸序列长度为1269bp，其编码蛋白序列如SEQ ID NO.2所示，由422个氨基酸组成的蛋白质。

实施例2：柳杉CfMYB4基因的生物信息学分析和功能验证

1、柳杉CfMYB4基因多重序列比对

使用DNAMAN将所克隆出来的基因与其他物种中已知的MYB转录因子进行序列比对，结果如图2所示，结果表明本发明所克隆的基因属于MYB转录因子家族，且每18-20个氨基酸间隔一个色氨酸(W)，R3结构域的第一个色氨酸通常会被异亮氨酸(I)/苯丙氨酸(F)/亮氨酸(L)所取代。

2、柳杉CfMYB4基因系统进化分析

使用MEGA7与其他物种已经验证研究功能的转录因子进行系统进化分析，结果如图3所示，初步推测其可能具有促进木质素合成与次生壁形成的功能。

3、柳杉CfMYB4基因遗传转化

3.1过表达载体构建

本发明所使用的过表达载体为PBI121，载体图谱如图4所示。通过选择合适的内切酶进行双酶切将载体线性化，本发明所使用的两个内切酶为BamH I酶、Xba I酶。设计同源重组引物(5’-3’)：

CE-CfMYB4-F：gagaacacgggggactctagaATGAGCTCATCCACAGAGCCC

CE-CfMYB4-R： ggactgaccacccggggatccTCAGGTGAAATACATTTGATCAAGATC

重组反应使用南京诺唯赞生物技术公司的

II One Step CloningKit C112试剂盒。

双酶切体系及重组反应体系和反应条件均严格按照说明书进行，通过将连接产物PBI121-CfMYB4转化大肠杆菌获得阳性菌株，培养阳性菌株后提取获得 PBI121-CfMYB4质粒。

3.2农杆菌GV3101转化

(1)取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或者手心融化至冰水混合状态后插入冰中；

(2)在100μL感受态细胞中加入0.01-1μg质粒DNA(PBI121-CfMYB4质粒)，用手轻弹拨打混匀；

(3)依次置于冰上冰浴5min、液氮速冻5min、37℃水浴5min、冰浴5min；

(4)加入700μL LB液体培养基(不含任何抗生素)，于28℃、200rpm，摇菌振荡3h；

(5)6000rpm离心1min；

(6)弃部分上清，留取约100-120μL菌液，轻轻吹打混匀重悬菌块，涂布于含相应抗生素的LB(Kan+)固体平板上，静置15min，待表面菌液晾干；

(7)倒置放于28℃培养箱暗培养42-48h；

(8)PCR检测阳性菌落，4℃保存，用于后续对烟草的转基因侵染。

3.3农杆菌活化与侵染

(1)将检测正确的农杆菌菌液活化扩繁，放入100mL无菌锥形瓶中，按照 1∶50稀释至50mL LB液体培养基中(Kan+Rif)，28℃、200rpm培养36-48h，直至菌液颜色浑浊，OD值A600为1.0左右；

(2)将该菌液转入无菌离心管中，于室温条件下，5000rpm离心10min，弃上清，菌体用1/2MS或MS液体培养基重悬，稀释至A600＝0.6左右，用于转化；

(3)将稀释后的菌液放入恒温摇床，28℃、200rpm培养30min，用于侵染。

3.4烟草叶盘介导侵染

(1)预培养：于超净台中，将野生型不具有抗性的烟草叶片剪成约1cm*1cm 的叶盘，暗培养2-3d，待叶片边缘卷曲；

(2)共培养：将叶盘放入稀释过的菌液中，浸泡振荡侵染10-15min，取出叶盘放于无菌滤纸上吸走多余菌液。将侵染后的叶盘放入不含任何抗生素的MS 固体培养基上(培养基上平铺一层无菌滤纸)，28℃暗培养2-3d；

(3)分化培养：将黑暗中共培养的叶盘转移到分化培养基中进行分化培养 (MS培养基，2.0mg/L 6-BA，0.05mg/L NAA，50mg/L Kan，100mg/L TMT)；

(4)筛选培养：将20-25d左右分化的愈伤组织重新接入到筛选培养基中，继续分化出不定芽(MS培养基，2.0mg/L 6-BA，0.05mg/L NAA，50mg/L Kan， 150mg/L TMT)；

(5)壮苗培养：约2-3周后，待不定芽长至1cm左右时切下，转移到壮苗培养基中进行壮苗培养(MS培养基，1.0mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，50mg/L Kan， 200mg/L TMT)；

(6)生根培养：待不定芽长至1-2cm时放入生根培养基中(1/2MS培养基， 200mg/LTMT)约10-15d长出不定根，将根系生长良好的无菌幼苗炼苗4-5d 后即可转入土中培养；

(7)同时设定未经农杆菌侵染的野生型烟草叶盘作为阴性对照。

3.5转基因烟草植株表型观察

选取阳性克隆植株观察其株高高度、叶片厚度及大小，以及利用环境扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)观察细胞壁厚度。

结果如图5-7所示，与野生型相比，转CfMYB4植株的株高增加和叶片增大增厚；另外，次生壁厚度观察结果表明：与野生型相比，转CfMYB4植株的次生壁厚度显著增加。通过表型观察及次生壁厚度观察结果表明，柳杉CfMYB4具有促进次生壁合成的作用。

序列表

<110> 南京林业大学

<120> 一种柳杉转录因子CfMYB4基因及其应用

<130> 100

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1269

<212> DNA

<213> Cryptomeria fortunei

<400> 1

atgagctcat ccacagagcc caaacccaaa ctcagaaaag gcctttggtc gcctgaagaa 60

gatgataagc tcatcaatta catgatgaaa aatgggcagg gctgttggag cgatgttgca 120

aaacaagctg gtctgcagag atgtggaaag agctgtaggc tgagatggat taactacctc 180

aggcctgacc tcaaacgagg agcattctca ccccatgaag agcaattgat tattcacttg 240

cattccatct tgggcaacag gtggtctcag attgcagctc gtttgcctgg acgtacagac 300

aatgagatca agaatttctg gaattcctgc attaaaaaga agttgaagca cctcaacaac 360

agcaataaca acaaccataa atctaccacc tcaaatacat cacacagcac caattccacc 420

atccctgcta cgcctgctcg tacacagcca ctggacgcca tgctggcaag gtaccagcct 480

tcactgcgca caatggaaaa ccagttttgt atgccagagt ttcccataaa ctcctccatg 540

aattgccaac tatggaatgc ttattctatt caagacggct ttaatcattc tctcagatcc 600

atgaatttac aggagccagc ccaaacaagg ctatgcaatc aaaactcatg gagcaacaat 660

actccacagc tccctctgaa ttacactcct cacacctcaa ttcctcctct ggttgactgc 720

gaatttctgc cattgaaaga caatgtaaag aatgataacc aaaacgagct gatgaccaat 780

tgtgattacc atgattcctc tgggctgagt gcatggagtg cttcttattc acacaacaca 840

gataactgtg acccagttgg gagtattctc gagagttatg ctaatgatga gattgtgaat 900

gctacagacc aatgcaatgc acagcccatt gcatgggcta atgaaggtga ttgcagtaag 960

ggtgacgata gctgtttcag attcaatgta aactttggaa tgcagccatt tgctgctact 1020

gataatagta atagggagaa aactagcttt gagtttggtg aggtgggaga agggtataat 1080

tgctgtggaa taaagcaagg tgaagaagaa gaagccacaa ctggtaattc attaggaggt 1140

ggaggaggag gaggtggagg aggtgatggg ttcgagtttg agtgtgaggg tgcaacagca 1200

gtgtggcatg acaatgtgta tgatattcat actgctgctt gtgatcttga tcaaatgtat 1260

ttcacctga 1269

<210> 2

<211> 422

<212> PRT

<213> Cryptomeria fortunei

<400> 2

Met Ser Ser Ser Thr Glu Pro Lys Pro Lys Leu Arg Lys Gly Leu Trp

1 5 10 15

Ser Pro Glu Glu Asp Asp Lys Leu Ile Asn Tyr Met Met Lys Asn Gly

20 25 30

Gln Gly Cys Trp Ser Asp Val Ala Lys Gln Ala Gly Leu Gln Arg Cys

35 40 45

Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Pro Asp Leu

50 55 60

Lys Arg Gly Ala Phe Ser Pro His Glu Glu Gln Leu Ile Ile His Leu

65 70 75 80

His Ser Ile Leu Gly Asn Arg Trp Ser Gln Ile Ala Ala Arg Leu Pro

85 90 95

Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Phe Trp Asn Ser Cys Ile Lys

100 105 110

Lys Lys Leu Lys His Leu Asn Asn Ser Asn Asn Asn Asn His Lys Ser

115 120 125

Thr Thr Ser Asn Thr Ser His Ser Thr Asn Ser Thr Ile Pro Ala Thr

130 135 140

Pro Ala Arg Thr Gln Pro Leu Asp Ala Met Leu Ala Arg Tyr Gln Pro

145 150 155 160

Ser Leu Arg Thr Met Glu Asn Gln Phe Cys Met Pro Glu Phe Pro Ile

165 170 175

Asn Ser Ser Met Asn Cys Gln Leu Trp Asn Ala Tyr Ser Ile Gln Asp

180 185 190

Gly Phe Asn His Ser Leu Arg Ser Met Asn Leu Gln Glu Pro Ala Gln

195 200 205

Thr Arg Leu Cys Asn Gln Asn Ser Trp Ser Asn Asn Thr Pro Gln Leu

210 215 220

Pro Leu Asn Tyr Thr Pro His Thr Ser Ile Pro Pro Leu Val Asp Cys

225 230 235 240

Glu Phe Leu Pro Leu Lys Asp Asn Val Lys Asn Asp Asn Gln Asn Glu

245 250 255

Leu Met Thr Asn Cys Asp Tyr His Asp Ser Ser Gly Leu Ser Ala Trp

260 265 270

Ser Ala Ser Tyr Ser His Asn Thr Asp Asn Cys Asp Pro Val Gly Ser

275 280 285

Ile Leu Glu Ser Tyr Ala Asn Asp Glu Ile Val Asn Ala Thr Asp Gln

290 295 300

Cys Asn Ala Gln Pro Ile Ala Trp Ala Asn Glu Gly Asp Cys Ser Lys

305 310 315 320

Gly Asp Asp Ser Cys Phe Arg Phe Asn Val Asn Phe Gly Met Gln Pro

325 330 335

Phe Ala Ala Thr Asp Asn Ser Asn Arg Glu Lys Thr Ser Phe Glu Phe

340 345 350

Gly Glu Val Gly Glu Gly Tyr Asn Cys Cys Gly Ile Lys Gln Gly Glu

355 360 365

Glu Glu Glu Ala Thr Thr Gly Asn Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Gly

370 375 380

Gly Gly Gly Gly Asp Gly Phe Glu Phe Glu Cys Glu Gly Ala Thr Ala

385 390 395 400

Val Trp His Asp Asn Val Tyr Asp Ile His Thr Ala Ala Cys Asp Leu

405 410 415

Asp Gln Met Tyr Phe Thr

420

Claims

1.一种柳杉转录因子CfMYB4基因在使植物植株增高、叶片增大增厚或细胞壁加厚中的应用，其特征在于，所述CfMYB4基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示，所述植物为烟草。