CN116466091A - 一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒 - Google Patents

一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN116466091A
CN116466091A CN202310222696.1A CN202310222696A CN116466091A CN 116466091 A CN116466091 A CN 116466091A CN 202310222696 A CN202310222696 A CN 202310222696A CN 116466091 A CN116466091 A CN 116466091A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
kit
iga
buffer
fcar
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310222696.1A
Other languages
English (en)
Inventor
方伟东
李荣华
李锐藩
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Luwei Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Luwei Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Luwei Biotechnology Co ltd filed Critical Shenzhen Luwei Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310222696.1A priority Critical patent/CN116466091A/zh
Publication of CN116466091A publication Critical patent/CN116466091A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本申请公开了一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒，该试剂盒包括磁性微球，磁性微球包被有FCAR蛋白；抗人免疫球蛋白，抗人免疫球蛋白标记有化学发光物质。FCAR可以选择性结合带有IgA片段的IgA免疫复合物，因此，以其构建检测体系，当样品中含有对应的IgA免疫复合物时，磁性微球上的FCAR蛋白与IgA免疫复合物发生特异性结合，而抗人免疫球蛋白进一步与FCAR蛋白结合，从而可以直接根据化学发光物质的发光结果进行检测。该方法能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成对IgA免疫复合物的检测，这种检测试剂盒的检测灵敏度可以达到0.31ng/ml，相对于传统的IgA免疫复合物的检测方法灵敏度至少提高了10倍。

Description

一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒
技术领域
本申请涉及免疫检测技术领域，尤其是涉及一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒。
背景技术
在人体自身免疫反应过程中，人体免疫球蛋白A(IgA)参与时，IgA与病原体结合启动免疫反应，下游抗体IgG与IgM，补体通路的C3补体等分子的参与形成IgA-IgG，IgA-IgM，IgA-C3，IgA-IgG-IgM等，统称IgA复合物。在正常免疫反应过程中，这些结合了病原体的复合物一般被免疫系统清除，比如被巨噬细胞吞噬等。IgA免疫反应异常时，IgA复合物无法被免疫系统有效清除，使其在血液循环系统及泌尿系统长期滞留，从而导致两种疾病：IgA复合物在肾脏的沉积与滞留导致IgA肾病(IgA Nehphropathy，IgAN)；IgA复合物在血管的沉积导致紫癜，通常称为过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura，HSP)，或者IgA血管炎(IgAV)。
前期研究过程中已经发现，血清/血浆中的IgA免疫复合物的浓度与检测者罹患上述两种疾病有着密切的关联。因此，有望通过结合检测者上述样本中的IgA免疫复合物的浓度来对上述两种疾病进行更有效的诊断。对于IgA免疫复合物的测定，目前主要在实验室中开展了基于酶联免疫吸附法(ELISA)的相关实验，这种方法需要手动操作、过程繁琐、费力耗时，而且准确率因人而异难以保证。此外，在综合考虑实验成本时经济方面存在一定的不合理性。因而有必要提供一种能够有效解决上述问题的IgA免疫复合物的检测产品。
发明内容
本申请旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本申请提出一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒，利用该试剂盒能够快速高效稳定准确地对IgA免疫复合物进行检测。
本申请的第一方面，提供一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒，该试剂盒包括：
磁性微球，磁性微球包被有FCAR蛋白；
抗人免疫球蛋白，抗人免疫球蛋白标记有化学发光物质。
根据本申请实施例的试剂盒，至少具有如下有益效果：
FCAR为免疫球蛋白基因超家族成员，编码IgA Fc区受体，参与人体自身免疫反应。该蛋白可以选择性结合带有IgA片段的IgA免疫复合物，因此，以其构建检测体系，当样品中含有对应的IgA免疫复合物时，磁性微球上的FCAR蛋白与IgA免疫复合物发生特异性结合，而抗人免疫球蛋白进一步与FCAR蛋白结合，从而可以直接根据化学发光物质的发光结果进行检测。该方法能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，完成对IgA免疫复合物的检测，这种检测试剂盒的检测灵敏度可以达到0.5ng/ml，相对于传统的IgA免疫复合物的检测方法灵敏度至少提高了10倍。
以IgA慢性肾病为例，其诊断的金标准为肾穿刺，肾穿刺后进行的病理分析一方面通过显微镜评估组织切片上的病变形状与程度；另一方面进行组织切片免疫生化分析，通过荧光染色确定IgA复合物是否在组织切片上沉积，从而确诊IgA肾病。免疫系统的异常使IgA免疫复合物无法被免疫系统有效清除，导致其在肾脏沉积，引起肾脏局部免疫反应导致炎症。而这些无法被有效清除的IgA免疫复合物还一直在血液循环系统中流动，因而血液中的IgA免疫复合物异常升高为IgA肾病最直接的风险因素，有望通过对血清学IgA免疫复合物的检测来评估这一风险。
目前的酶联免疫吸附方法多以专用的微孔板作为包被用具和反应容器，在使用时只能分成若干批次或整板一次使用，无法进行独立、单人份的检测；而且在定量测定的所用的试剂种类繁多，加注试剂的操作也极为繁琐；检测试剂在检测过程中处于开放的空间，容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果的准确度；检测过程多采用手工操作，容易造成加量误差，准确度和精密度较差；而且存在着不够经济合理性的不足。综合上述因素，在本申请的实施方式中，开发了上述的化学发光检测IgA免疫复合物的试剂盒。
在本申请的一些实施方式中，化学发光物质选自吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺中的至少一种。可以理解的是，化学发光物质也可以是本领域所知的其它任一种可以实现化学发光的物质，例如，化学发光物质还可以是选自吖啶酯、吖啶酯衍生物、鲁米诺、鲁米诺衍生物、异鲁米诺、异鲁米诺衍生物中的至少一种。其中，吖啶酯衍生物可以是吖啶酯酸-NHS酯、吖啶酸丙磺酸钠盐、9-吖啶羧酸等其中至少一种，异鲁米诺衍生物可以是异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰肼)、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺、N-(6-氨基已基)-N-乙基异鲁米诺、异硫氰酸异鲁米诺、N-(4-异硫氰基丁基)-N-乙基异鲁米诺等其中至少一种。
采用上述的化学发光物质进行直接化学发光，相比较酶促化学发光，具有比较明显的优势，主要表现在：对反应不需要催化剂，只要提供碱性环境即可进行；同时反应快速，对背景发光影响低，信噪比高，干扰因素较少；同时产品对试剂的稳定性好，可以两点或多点进行定标，反应体系简短，激发液成本相对低；此外，上述这些标记能够更容易地与蛋白质进行连接，而且连接后光子产率不会减少。
在本申请的一些实施方式中，化学发光物质选自吖啶酯或其衍生物中的至少一种。吖啶酯其同样具有上述这些化学发光物质的特性并且表现得更为优异，因而将其作为化学发光物质使用具有更突出的检测性能。采用吖啶酯等在检测时为直接化学发光，与传统的酶促化学发光相比，反应过程不需要酶的参与，更加节约成本。而且，线性范围能达到0.3～500ng/ml，与传统的检测方法相比，其线性范围更宽，可以适应更大浓度范围内的直接检测。
在本申请的一些实施方式中，抗人免疫球蛋白与化学发光物质的质量比为40：(1～20)，例如可以是40：1、40：2、40：3、40：4、40：5、40：8、40：10、40：12、40：15、40：16、40：20。在其中一些实施方式中，抗人免疫球蛋白与化学发光物质的质量比为40：(1～10)、40：(1～5)、40：(1～2)、40：(2～20)、40：(5～20)、40：(8～20)。
在本申请的一些实施方式中，磁性微球为羧基化的磁性微球。在其它一些实施方式中，磁性微球也可以是甲苯酰化(Tosyl)的磁性微球，因而，磁性微球可以是羧基化的磁性微球、甲苯酰化的磁性微球中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，FCAR蛋白与磁性微球的质量比为1：(5～50)，例如，FCAR蛋白与磁性微球的质量比为1：5、1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35、1：40、1：45、1：50。在其中一些实施方式中，FCAR蛋白与磁性微球的质量比为1：(5～45)、1：(5～40)、1：(5～35)、1：(5～30)、1：(5～25)、1：(5～20)、1：(5～15)、1：(5～10)。
在本申请的一些实施方式中，磁性微球的粒径为0.01～4μm，例如，磁性微球的粒径可以是0.01μm、0.02μm、0.05μm、0.1μm、0.2μm、0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm。在其中一些实施方式中，磁性微球的粒径为0.01～3μm、0.01～2μm、0.01～1μm，0.02～4μm，0.05～4μm、0.1～4μm、0.2～4μm、0.5～4μm、1～4μm、1～3μm。
在本申请的一些实施方式中，试剂盒还包括化学发光底物液。
在本申请的一些实施方式中，化学发光底物液包括A液和B液，A液包括氧化剂，B液包括无机碱。
在本申请的一些实施方式中，氧化剂包括过氧化氢、过氧化脲中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，无机碱包括氢氧化钠、氢氧化钾中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，氧化剂包括过氧化氢，无机碱包括氢氧化钠。
在本申请的一些实施方式中，B液还包括发光增强剂，从而在检测时可以放大光信号，增强光输出，例如可以是苯酚类发光增强剂(如对位取代苯酚：4-(咪唑-1-基)苯酚、对香豆酸、4-甲氧基苯酚、4-羟基-4-碘联苯、4-(1H-吡咯基)苯酚、4-(1,2,4-三唑-1-基)苯酚)、硼酸类发光增强剂(如取代硼酸：对溴苯硼酸、对碘苯硼酸、4-苯硼酸)、洛芬类发光增强剂(如洛芬衍生物及其类似物：2,4,5-三苯基咪唑、2-(4-羟基苯基)-4,5-二苯基咪唑、2-(4-羟基苯基)-4,5-二(2-吡啶基)咪唑)等。
在本申请的一些实施方式中，A液中氧化剂的质量百分比浓度为0.01～2％，B液中无机碱的质量百分比浓度为0.1～5％。
在本申请的一些实施方式中，A液包括过氧化氢溶液，B液包括氢氧化钠溶液。
在本申请的一些实施方式中，A液中过氧化氢的质量百分比浓度为0.01～2％，B液中氢氧化钠的质量百分比浓度为0.1～5％。
在本申请的一些实施方式中，A液包括100mmol/L(0.34％质量百分比浓度)的过氧化氢溶液，B液包括0.25mol/L(1％质量百分比浓度)的NaOH溶液。
在本申请的一些实施方式中，试剂盒还包括校准品，校准品包括0～500ng/ml的IgA免疫复合物的溶液。
在本申请的一些实施方式中，校准品包括0～500ng/ml内3～8个不同浓度梯度的IgA免疫复合物的溶液。
在本申请的一些实施方式中，校准品包括0～500ng/ml内4～6个不同浓度梯度的IgA免疫复合物的溶液。
在本申请的一些实施方式中，校准品包括0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、200ng/ml、500ng/ml的IgA免疫复合物的溶液。
在本申请的一些实施方式中，第一缓冲液、第二缓冲液和第三缓冲液分别独立自选自2-(N-马咖啉)乙黄酸(MES)缓冲液、三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液、碳酸盐(Na2CO3/NaHCO3)缓冲液中的至少一种。
在本申请的一些实施方式中，MES缓冲液的浓度为20～80mmol/l，pH为5.5～6.7。在其中一些实施方式中，MES缓冲液的浓度为50mmol/l，pH为6.5。
在本申请的一些实施方式中，Tris缓冲液的浓度为10～1000mmol/L，pH为8～9。在其中一些实施方式中，Tris缓冲液中还含有牛血清白蛋白。在其中一些实施方式中，Tris缓冲液的浓度为100mmol/L，含有5％牛血清白蛋白，pH为8.5。
在本申请的一些实施方式中，碳酸盐缓冲液浓度为10～1000mmol/L，pH为8.5～9.5。在其中一些实施方式中，碳酸盐缓冲液浓度为100mmol/L，pH为9。
在本申请的一些实施方式中，第一缓冲液为MES缓冲液，第二缓冲液为Tris缓冲液，第三缓冲液为碳酸盐缓冲液。
本申请的第二方面，提供一种上述试剂盒的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
取磁性微球的悬浮液，磁分离去上清后在第一缓冲液中重悬，活化，与FCAR蛋白混合孵育，磁分离去除上清，在第二缓冲液中重悬，得到包被有FCAR蛋白的磁性微球；
抗人免疫球蛋白与第三缓冲液混匀，然后与化学发光物质混匀，室温下避光反应后除杂，得到标记有化学发光物质的抗人免疫球蛋白。
在本申请的一些实施方式中，该制备方法包括以下步骤：
取磁性微球的悬浮液，磁分离去上清后在第一缓冲液中重悬，活化后与FCAR蛋白混合，孵育1～10h后，磁分离去除上清，在第二缓冲液中重悬，得到包被有FCAR蛋白的磁性微球；
抗人免疫球蛋白与第三缓冲液混匀，然后与化学发光物质混匀，室温下避光反应1～2h后除杂，得到标记有化学发光物质的抗人免疫球蛋白。
在本申请的一些实施方式中，磁性微球为羧基化的磁性微球，羧基微球的活化方式为1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)溶液活化。
在本申请的一些实施方式中，EDC溶液的浓度为5～30mg/mL。
在本申请的一些实施方式中，EDC与羧基化的磁性微球的质量比为1：(1～50)。
在本申请的一些实施方式中，除杂包括离心脱盐柱脱盐。
在本申请的一些实施方式中，离心脱盐柱脱盐包括分别用纯化水及TBS缓冲液进行处理离心脱盐柱，最后收集离心管的溶液。
在本申请的一些实施方式中，TBS缓冲液包括40～60mM Tris-HCl，牛血清白蛋白和氯化钠。在其中一些实施方式中，TBS缓冲液包括40～60mM Tris-HCl，约1％牛血清白蛋白和约2％氯化钠。在其中一些实施方式中，TBS缓冲液的pH为8～9。在其中一些实施方式中，TBS缓冲液的pH为8.5。
综合以上可以看出，本申请实施方式中所提供的试剂盒能够以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，从而实现全自动化，试剂及样本的添加全部通过仪器完成，操作更加简便，减少了人为的误差。其检测灵敏度经过实验可以达到0.31ng/ml，相对与传统的IgA免疫复合物的检测方法灵敏度至少提高了10倍，表明这种IgA免疫复合物的化学发光免疫检测试剂盒的检测精密度较高。同时，线性范围更宽，重复性高、批内及批间差较小。
本申请的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。
附图说明
图1是本申请的实施例中根据不同浓度的校准品得到的浓度-发光值的标准曲线。
图2是本申请的实施例中根据不同浓度的校准品得到的浓度-发光值的线性分析结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本申请的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本申请的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本申请的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本申请的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本申请保护的范围。
下面详细描述本申请的实施例，描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。
在本申请的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数，约的含义是指在本数±20％、10％、8％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％、0.1％等的范围内。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本申请的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
实施例1
本实施例提供一种基于化学发光发检测IgA免疫复合物的试剂盒，该试剂盒包括：
包被有重组FCAR蛋白的羧基化磁珠，
标记有吖啶酯的小鼠抗人免疫球蛋白，
IgA免疫复合物校准品。
上述三种组分的制备过程如下：
(1)包被有重组FCAR蛋白的羧基化的磁性微球的制备
取含有60mg粒径为1.5μm的羧基化的磁性微球(JSR Life Sciences，MS160)的悬浮液，磁分离去除上清，用200mM的MES缓冲液(pH 6.5)重悬，加入1mL新配制的终浓度为20mg/mL的EDC水溶液，活化磁珠表面的羧基。加入8mg的重组FCAR蛋白，在25℃下混悬4h，磁分离，去除上清，用含2％BSA的100mM的Tris缓冲液(pH为8.5)重悬到1mg/mL。得到包被有重组FCAR蛋白的羧基化的磁性微球，按照每瓶4～10mL的体积的量分装保存在2～8℃冰箱备用。
(2)标记有吖啶酯的小鼠抗人IgA抗体的制备
在100μl浓度为4mg/mL的小鼠抗人IgA抗体溶液中加入400μl浓度为100mM、pH为8.5～9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入5μl浓度为10mg/mL的吖啶酯溶液混匀，在室温下避光反应，1小时后取出，采用2ml的离心脱盐柱分别用纯化水及TBS缓冲液进行脱盐处理，最后加上得到标记有吖啶酯的小鼠抗人IgA抗体的溶液，收集离心管中的液体至保存管，得到标记有吖啶酯的小鼠抗人IgA抗体，按照每瓶4～10mL的体积分装保存在2～8℃冰箱备用。
(3)IgA免疫复合物校准品的制备
用校准品缓冲液，把IgA免疫复合物(商品化的含IgA免疫复合物的人血清IgA)配制成浓度为0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、200ng/ml和500ng/ml的IgA免疫复合物校准品，按照每瓶0.5～1mL分装，保存在2～8℃冰箱备用。
实施例2
本实施例提供一种IgA免疫复合物的化学发光检测方法，具体如下：
用全自动化学发光免疫分析仪(透景TESMI i200)为检测工具，方法学模式是双抗夹心法，即仪器依次加入30μl的样本，100μl的包被有重组FCAR蛋白的羧基化的磁性微球以及100μl的重组FCAR蛋白处理液，反应10min，再加入100μl标记有吖啶酯的小鼠抗人IgA抗体，反应15min，进行磁性微球的分离，全自动分析仪器把反应混合物自动送入仪器内部暗室，通过加入发光底物，A液(H2O2)和B液(NaOH)进行发光反应，根据计算结果记录发光值。
预先采用该检测方法对IgA免疫复合物的不同浓度梯度的校准品进行检测，得到标准曲线如图1所示。随后测试实际样本，根据样本的发光值结合标准曲线计算样本浓度。根据图1，线性相关系数R2＝0.9982，对样本的IgA免疫复合物的线性范围为2～500ng/ml。
实施例3：性能评价
灵敏度检测：计算方法参照CLSI EP17-A文件中的推荐实验方案，计算上述试剂盒的灵敏度，结果显示检出限LOD为0.3ng/ml。
精密度检测：对于浓度为50ng/ml及200ng/ml的两个IgA免疫复合物校准品，用三批试剂盒重复做3个平行测试，计算试剂盒批内及批间差，结果显示，该试剂盒批内及批间差均小于5％。
实施例4：对比实验
灵敏度：
分别采用实施例2所提供的化学发光法的检测方法和传统的酶联免疫吸附法对浓度为0.5ng/mL、20ng/mL的IgA免疫复合物样本做检测，参考CLSI EP17-A文件的相关方法，比较两种检测方法的灵敏度，结果如表1所示(1～20为0.5ng/mL浓度的样本，21～23为20ng/mL浓度的样本)：
表1.不同方法检测效果比较
测试编号 化学发光法(RLU) 酶联免疫吸附法(OD)
1 50128 0.068
2 48096 0.071
3 50668 0.076
4 48679 0.069
5 51042 0.084
6 50501 0.086
7 49351 0.082
8 48976 0.069
9 53218 0.064
10 52193 0.075
11 50333 0.076
12 51583 0.071
13 50127 0.073
14 50639 0.071
15 50005 0.082
16 52583 0.077
17 51128 0.069
18 49955 0.085
19 50128 0.069
20 51885 0.083
Mean 50561 0.075
SD 1266.277 0.006465
M-2SD 48028.35 0.062069
21 221352 0.154
22 230157 0.149
23 220893 0.151
Mean 224134 0.151
灵敏度(ng/ml) 0.31 5.21
由表中结果可以看出，本申请实施例所提供的化学发光检测方法的灵敏度相较于现有的酶联免疫吸附法，提高了至少10倍以上，检出限LOD为0.31ng/ml。
上述实验中，酶联免疫吸附法测试中所使用的试剂盒和检测方法说明如下：
检测IgA免疫复合物的酶联免疫吸附法的试剂盒，该试剂盒中包括分子探针冻干粉、包被缓冲液、酶标板、标准品、酶标二抗、显色液、终止液、洗涤液、稀释液和封闭液。
其中，分子探针冻干粉为重组FCAR蛋白冻干粉；
包被缓冲液为0.05M的碳酸盐缓冲液(pH＝9.6)；
酶标板为96孔板；
标准品为商品化的含IgA复合物的人血清IgA；
阴性对照品为无IgA复合物的人体血清；
阳性对照品为含IgA复合物的人体血清，选定25ng的商品化人血清IgA；
酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗人的IgA；
显色液包括显色液A—3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)和显色液B—过氧化氢溶液；
终止液为10％的硫酸；
洗涤液为含0.05％吐温-20的0.15M的磷酸盐缓冲液；
稀释液为洗涤液+1‰BSA；
封闭液为洗涤液+5％ BSA。
检测方法如下：
(1)将分子探针冻干粉溶解于包被缓冲液中，得分子探针溶液；
(2)将分子探针溶液加入96孔酶标板的每个孔中，覆盖封口膜，置于4℃环境中过夜；甩去孔中的溶液，用洗涤液洗酶标板多次，向酶标板中加入封闭液，覆盖封口膜，置于4℃环境中过夜，用洗涤液洗酶标板1次，干燥得包被有分子探针的酶标板；
(3)用稀释液稀释待测品得到待测品稀释液、标准品梯度稀释液(检出量依次为50、25、12.5、6.75、3.375、1.5625ng)，阳性对照品和阴性对照品不用稀释液稀释；然后将样本稀释液、标准品梯度稀释液、阴性对照液、阳性对照液分别加入包被有分子探针的酶标板中，覆盖封口膜进行孵育，孵育结束后用洗涤液洗酶标板3次；将HRP标记的二抗加入酶标板中孵育，孵育结束后洗涤酶标板3次；将显色液A和显色液B按1：1的比例混合加入酶标板中，室温避光显色，显色结束后加入终止液，轻轻震荡后将酶标板置于酶标仪中检测吸光值(OD值)，第一波长450nm，第二波长630nm。
精密度检测：
取线性范围内的浓度50ng/ml及200ng/ml两个IgA免疫复合物校准品，使用3个批次的试剂盒重复进行3个平行测试，计算批内及批间差，判定标准±小于10％为合格。结果如图2所示，该试剂盒批内及批间差均小于5％。
表2.精密度实验结果
稳定性：
使用在4℃储存的同一批次的试剂盒，连续测试18个月时间，每个月同时测试浓度50ng/ml及200ng/ml样本，并且每个样本重测三次，计算平均值，用浓度分别用第一个月和第18个月进行比对，50ng/ml及200ng/ml样本分别浓度下降7.8％，10.2％，得出结果表面试剂盒稳定性较好。其中，稳定性判断标准为试剂储存4℃/18个月后，稳定性变化15％以内。
实施例5
本实施例提供一种基于化学发光发检测IgA免疫复合物的试剂盒，该试剂盒与实施例1的区别在于，小鼠抗人免疫球蛋白标记有异鲁米诺。
实施例6
本实施例提供一种基于化学发光发检测IgA免疫复合物的试剂盒，该试剂盒与实施例1的区别在于，小鼠抗人免疫球蛋白标记有鲁米诺。
实施例7
本实施例提供一种基于化学发光发检测IgA免疫复合物的试剂盒，该试剂盒与实施例1的区别在于，磁性微球为甲苯酰化(Tosyl)的磁性微球。
实施例8
本实施例提供一种基于化学发光发检测IgA免疫复合物的试剂盒，该试剂盒与实施例1的区别在于，小鼠抗人免疫球蛋白替换为羊抗人免疫球蛋白。
实施例9
本实施例提供一种基于化学发光发检测IgA免疫复合物的试剂盒，该试剂盒与实施例1的区别在于，A液中的H2O2溶液替换为过氧化脲溶液。
实施例10
本实施例提供一种基于化学发光发检测IgA免疫复合物的试剂盒，该试剂盒与实施例1的区别在于，B液中还包括增强剂4-甲氧基苯酚。
实施例5～10的试剂盒可以达到与实施例1类似的灵敏度、精密度、稳定性，甚至部分实施例具有更高的灵敏度、精密度、稳定性，在此不再赘述。
上面结合实施例对本申请作了详细说明，但是本申请不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本申请宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.检测IgA免疫复合物的试剂盒，其特征在于，包括：
磁性微球，所述磁性微球包被有FCAR蛋白；
抗人免疫球蛋白，所述抗人免疫球蛋白标记有化学发光物质。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光物质选自吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗人免疫球蛋白与化学发光物质的质量比为40：(1～20)。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球为羧基化的磁性微球。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述FCAR蛋白与所述磁性微球的质量比为1：(5～50)。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁性微球的粒径为0.01～2μm。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括化学发光底物液，所述化学发光底物液包括A液和B液，所述A液包括H2O2溶液，所述B液包括NaOH溶液。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品包括0～500ng/ml的IgA免疫复合物的溶液。
9.权利要求1至8任一项所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取磁性微球的悬浮液，磁分离去上清后在第一缓冲液中重悬，活化，与FCAR蛋白混合孵育，磁分离去除上清，在第二缓冲液中重悬，得到包被有FCAR蛋白的所述磁性微球；
抗人免疫球蛋白与第三缓冲液混匀，然后与化学发光物质混匀，室温下避光反应后除杂，得到标记有所述化学发光物质的所述抗人免疫球蛋白。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述第一缓冲液为MES缓冲液，和/或，第二缓冲液为Tris缓冲液，和/或，第三缓冲液为碳酸盐缓冲液。
CN202310222696.1A 2023-02-28 2023-02-28 一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒 Pending CN116466091A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310222696.1A CN116466091A (zh) 2023-02-28 2023-02-28 一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310222696.1A CN116466091A (zh) 2023-02-28 2023-02-28 一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116466091A true CN116466091A (zh) 2023-07-21

Family

ID=87176096

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310222696.1A Pending CN116466091A (zh) 2023-02-28 2023-02-28 一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116466091A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111679086B (zh) 一种hbp的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法
CA2668001C (en) A method of immunoassaying a component to be measured in a sample containing hemoglobin
CN108398550B (zh) 一种组合物、芯片及其制备方法和包含有该芯片的检测装置
US20020106708A1 (en) Assays reagents and kits for detecting or determining the concentration of analytes
CN110687286A (zh) 胶乳增强免疫比浊法试剂盒
CN109633148B (zh) Kl-6检测乳胶凝集试剂
JP2021119355A (ja) ビタミンｄをアッセイするための方法および組成物
US9046517B2 (en) Cystatin C adsorption inhibitor
CN112698041A (zh) 一种复合物及其生长分化因子15检测试剂盒与应用
CN114252594B (zh) 一种胎盘生长因子检测试剂盒及其制备方法与应用
CN116973574B (zh) 可溶性生长刺激表达基因2蛋白的测定试剂盒及其检测方法
CN111929446A (zh) 一种定量定性检测抗lkm-1抗体的试剂盒及其制备方法
US9075049B2 (en) Immunoassay method and reagent therefor
CN116466091A (zh) 一种基于化学发光法检测IgA免疫复合物的试剂盒
JP2010091308A (ja) レクチン吸収法による前立腺がんの診断方法及び判定キット
JP2014228385A (ja) 免疫試験方法および免疫試験キット
US20120238037A1 (en) Immunological assay and immunological assay kit
CN114200129B (zh) 组织金属蛋白酶抑制剂-2胶乳免疫比浊法血尿同检试剂盒
EP4286850A1 (en) Immunological assay method
JP3095275B2 (ja) リポコルチンに対する抗体の測定方法
CN114371292A (zh) 一种检测可溶性st2蛋白的试剂盒
JP2010014586A (ja) 便検体中ヘモグロビンの測定方法及び測定試薬キット
CN114965986A (zh) 用于检测血液中可溶性生长刺激表达基因2蛋白(st2)的试剂盒
CN114252592B (zh) 一种可溶性fms样酪氨酸激酶-1检测试剂盒及其制备方法与应用
US10921332B2 (en) Collagen IV binding assay for the detection of collagen VII

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination