CN116458429A - 小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了植物培养技术领域的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法，包括以下步骤：S1：种子及种胚消毒灭菌；采摘6～8成成熟的野生小叶红叶藤果实，将其处理分成种子和种胚两部分，分别对种子和种胚进行外植体的消毒灭菌；S2：扩繁；消毒灭菌后，将种子和种胚分别接种于添加了6‑BA、NAA和无外源激素的MS始芽及继代培养基中，观察始芽诱导及芽苗不定芽分化及生长情况；S3：生根；分别挑选顶芽叶片舒展、叶色翠绿、生长健壮和高3～4cm的单芽和2～3个芽苗的丛芽接种于生根培养基中；S4：移栽，选用泥炭土和黄心土，将其按体积为1∶5的比例搅拌均匀，将单芽和丛芽分别移栽至育苗杯中培育，移栽2个月后统计成活率。
Description
技术领域
本发明属于植物培养技术领域，具体是小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法。
背景技术
小叶红叶藤[Rourea microphylla(Hook.et Arn)Planch)]，牛栓藤科红叶藤属植物，攀援灌木，多分枝，高1～4m，产于福建、广东、广西、云南等省区，生长于海拔100～600m的山坡或疏林中。小叶红叶藤具有观赏价值，其鲜红色的嫩叶和果实具有非常好的景观效果，可用于营建彩篱、孤植木、园景点缀等景观；此外，小叶红叶藤也是一种民间药，其茎叶可用于清热解毒、消肿解痛、止血，主治跌打肿痛和外伤出血等；另外，该植物具有特殊的芳香气味，在广西壮族地区常用作清热解毒、美容养颜和延年益寿的天然保健茶饮品。
小叶红叶藤主要以野生为主，少有人工种植，为了更好地利用和开发此品种，快速大量地进行人工栽培，需采用组织培养的方式进行驯化和繁殖；植物组织培养育苗繁殖周期短、效率高，不受季节和气候限制，可保持亲本的优良性状，且具有生长整齐标准等优点；通过植物组织培养对小叶红叶藤进行推广种植，利于园林景观中彩化品种选择及药材的采集；目前在对小叶红叶藤进行组织培养时，小叶红叶藤的生根率和存活率均不高；因此，有必要提出一种小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法，以野生小叶红叶藤种子为外植体，通过种胚消毒灭菌、扩繁、生根和移栽，用以提高小叶红叶藤进行组织培养时生根率和存活率，为其苗木的规模化生产提供参考依据。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法，包括以下步骤：
S1：种子及种胚消毒灭菌；采摘6～8成成熟的野生小叶红叶藤果实，将其处理分成种子和种胚两部分，分别对种子和种胚进行外植体的消毒灭菌；S2：扩繁；消毒灭菌后，分别将种子和种胚接种于添加了6-BA、NAA和无外源激素的MS始芽及继代培养基中，观察始芽诱导及2～3个芽苗的芽苗不定芽分化和生长情况；S3：生根；分别挑选出顶芽叶片舒展、叶色翠绿且色带明显、生长健壮和高3～4cm的单芽和丛芽并接种于生根培养基中；S4：移栽，选用泥炭土和黄心土，将其按体积为1∶5的比例搅拌均匀，将单芽和丛芽分别移栽至育苗杯中培育，移栽2个月后统计成活率。
进一步，S1中，消毒灭菌的方式为：先在烧杯内使用清水对种子和种胚漂洗5～10min，漂洗过程中用玻璃棒不断搅拌使种子和种胚充分洗净，漂洗完毕采用纱布封好烧杯口，置于流水下冲洗1h，用滤纸将种子和种胚吸干水分备用；将带种皮的种子和去掉种皮及假种皮的种胚分别放入不同消毒剂中消毒，消毒后进行接种，每种消毒剂均接种20瓶，每瓶接种1粒种子和种胚中的一种，培养15d后观察统计污染情况。
进一步，消毒剂可选用1‰HgCl2溶液和75％酒精。
进一步，S2中，为诱导出不定芽，抽芽后，将抽芽剪至2～3cm的单芽，接种于添加了6-BA和NAA的MS增殖培养基中，每处理接种30瓶，每瓶接种单芽5个，3个重复，培养30d。
进一步，S2中，为防止芽苗在培养过程中出现黄化、落叶和枯死现象，在增殖培养基中添加酸水解酪蛋白20～100mg/L、防落素5～15mg/L、VC 10～20mg/L和核黄素10～20mg/L，分别进行不同浓度的试验，每处理均接种30瓶，每瓶均接种丛芽4个，3个重复，培养30d。
进一步，S3中，生根培养基以1/3MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA、IAA和IBA，采用正交设计L9进行试验，每种处理均20瓶，每瓶均9株，3次重复，培养40d。
进一步，NAA的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/L；IAA的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/L；IBA的浓度分为1.0、1.5和2.0mg/L。
进一步，育苗杯内部中空且顶部开设有开口，育苗杯底部的两侧均呈斜面。
进一步，小叶红叶藤的植株可用做园林景观，小叶红叶藤的茎叶可用做制备保健茶饮品的原材料。
采用上述方案后实现了以下有益效果：
本发明以野生小叶红叶藤种子为外植体，通过种胚消毒灭菌、扩繁、生根和移栽，提高小叶红叶藤进行组织培养时生根率和存活率，为其苗木的规模化生产提供参考依据；本发明中野生小叶红叶藤种子无菌率可高至100％，其胚芽已发育完全，在接种后第7～13天开始抽芽，生长良好；将剪下的芽苗接种在含外源激素6-BA 0.8mg/L和NAA 0.3mg/L的增殖培养基中，可分化出的不定芽多且健壮。
本发明在培养基中添加CH 100mg/L、防落素15mg/L、VC 20mg/L及核黄素20mg/L，可有效地改善芽苗生长情况，使丛芽健壮和枝繁叶茂；CH是多种氨基酸的混合物，对胚状体和不定芽的分化有良好的促进作用，加快了芽苗体内的新陈代谢；VC是植物组织内广泛存在的高丰度小分子物质,具有延缓植物细胞衰老的作用；核黄素是酶辅因子黄素单核苷酸FMN和黄素腺嘌呤二核苷酸FAD的直接前体，广泛参与植物代谢中的氢、氧与电子传递反应，发挥着不可或缺的作用。
本发明中小叶红叶藤丛芽在添加NAA 1.0mg/L、IAA1.5 mg/L及IBA1.0 mg/L的改良MS生根培养基中，生根率可达97.59％，且根系健壮，适合在育苗杯中移栽，移栽成活率可达95％。
在使用育苗杯时，可以通过开口向育苗杯内放入芽苗，可以根据芽苗的长势通过育苗杯底部的斜面对育苗杯进行多角度的放置，便于育苗杯内的芽苗多角度的进行光合作用。
附图说明
图1为本发明实施例的流程图。
图2为本发明实施例不同消毒方式下种子及种胚脱毒情况示意图。
图3为本发明实施例育苗杯的轴侧图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
实施例基本如附图1-3所示：
小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用及其方法，包括以下步骤：
S1：种子及种胚消毒灭菌；采摘6～8成成熟的野生小叶红叶藤果实，将其处理分成种子和种胚两部分，分别对种子和种胚进行外植体的消毒灭菌；消毒灭菌的方式为：先在烧杯内使用清水对种子和种胚漂洗5～10min，漂洗过程中用玻璃棒不断搅拌使种子和种胚充分洗净，漂洗完毕采用纱布封好烧杯口，置于流水下冲洗1h，用滤纸将种子和种胚吸干水分备用；将带种皮的种子和去掉种皮及假种皮的种胚分别放入不同消毒剂中消毒，消毒后进行接种，每种消毒剂均接种20瓶，每瓶接种1粒种子和种胚中的一种，培养15d后观察统计污染情况；消毒剂可选用1‰HgCl2溶液和75％酒精。
S2：扩繁；消毒灭菌后，分别将种子和种胚接种于添加了6-BA、NAA和无外源激素的MS始芽及继代培养基中，观察始芽诱导及芽苗不定芽分化和生长情况。
为诱导出不定芽，抽芽后，将抽芽剪至2～3cm的单芽，接种于添加了6-BA和NAA的MS增殖培养基中，每处理接种30瓶，每瓶接种单芽5个，3个重复，培养30d。
为防止芽苗在培养过程中出现黄化、落叶和枯死现象，在增殖培养基中添加酸水解酪蛋白20～100mg/L、防落素5～15mg/L、VC 10～20mg/L和核黄素10～20mg/L，分别进行不同浓度的试验，每处理均接种30瓶，每瓶均接种丛芽4个，3个重复，培养30d。
S3：生根；分别挑选出顶芽叶片舒展、叶色翠绿且色带明显、生长健壮和高3～4cm单芽和2～3个芽苗的丛芽并接种于生根培养基中；生根培养基以1/3MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA、IAA和IBA，采用正交设计L9进行试验，每种处理均20瓶，每瓶均9株，3次重复，培养40d；NAA的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/L；IAA的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/L；IBA的浓度分为1.0、1.5和2.0mg/L。
S4：移栽，选用泥炭土和黄心土，将其按体积为1∶5的比例搅拌均匀，将单芽和丛芽分别移栽至育苗杯中培育，移栽2个月后统计成活率。育苗杯内部中空且顶部开设有开口，育苗杯底部的两侧均呈斜面。
小叶红叶藤的植株可用做园林景观，小叶红叶藤的茎叶可用做制备保健茶饮品的原材料。
具体实施过程如下：
供试种子选取来源于广西南宁市南宁树木园连山管理区阔叶林中的野生小叶红叶藤。
第一步,采摘6成成熟的野生小叶红叶藤，将其分成种子和种胚两部分，分别对种子和种胚进行外植体的消毒灭菌；消毒灭菌的方式为：将带种皮的种子和去掉种皮及假种皮的种胚分别放入不同消毒剂中消毒，消毒后进行接种，每种消毒剂均接种20瓶，每瓶接种1粒种子和种胚中的一种，培养15d后观察统计污染情况，如表1所示。
表1
如表1所示，由于小叶红叶藤种皮表面附着物较多，种子经消毒剂处理后无菌率最高为25％(处理4)。由于种子成熟度处于6～8成，种皮处于完全闭合状态，种胚外还存在一层包裹严密的假种皮，种胚受菌类感染的可能性较小，在进行消毒处理时较容易清除附着在种皮及假种皮上的部分菌类，种胚无菌率较高可达100％(处理7和处理9)。
第二步，消毒灭菌后，分别将种子和种胚接种于添加了6-BA、NAA和无外源激素的MS始芽及继代培养基中，观察始芽诱导及芽苗不定芽分化和生长情况。
从表2可知，当6-BA含量低于0.8mg/L时，单芽芽苗增殖系数小于或等于10，其不定芽疏散，叶片大；当6-BA含量达到0.8mg/L以上时，芽苗增殖系数达到18以上，但随着6-BA含量的增加，芽苗纤细，节间长且长势快，同时随着NAA含量的增加，会出现玻璃化现象。在培养的过程中，由于激素含量相对高，芽苗分化及芽抽长长势快，生长15～20d后易出现黄化、落叶和芽苗枯死现象。培养基难以在30～35d内持续提供足够的营养来满足不定芽的伸长生长及木质化需求，难以达到一周期一扩繁的目的，转接周期短，成本相对高。因此，从壮苗扩繁及降低成本方面考虑，处理7号为芽苗增殖的最佳培养基。
表2
为防止芽苗在培养过程中出现黄化、落叶和枯死现象，在增殖培养基中添加酸水解酪蛋白(CH)20～100mg/L、防落素5～15mg/L、VC 10～20mg/L和核黄素10～20mg/L，分别进行不同浓度的试验，每处理均接种30瓶，每瓶均接种丛芽4个，3个重复，培养30d。
如表3所示，观察处理6可知，芽苗在添加有不同药剂的培养基中连续培养2～3周，不定芽局部枯死或黄化现象可完全被控制，未出现芽苗整株枯死现象，大量落叶现象改善为偶有落叶，其丛芽健壮，枝繁叶茂，达到壮芽的要求，可用于生根。
CH是多种氨基酸的混合物，对胚状体和不定芽的分化有良好的促进作用，加快了芽苗体内的新陈代谢；VC是植物组织内广泛存在的高丰度小分子物质,具有延缓植物细胞衰老的作用；核黄素是酶辅因子黄素单核苷酸FMN和黄素腺嘌呤二核苷酸FAD的直接前体，广泛参与植物代谢中的氢、氧与电子传递反应，发挥着不可或缺的作用。
表3
第三步，分别挑选出顶芽叶片舒展、叶色翠绿、生长健壮和高4cm的单芽和3个芽苗的丛芽并接种于生根培养基中；生根培养基以1/3MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA、IAA和IBA，采用正交设计L9进行试验，每种处理均20瓶，每瓶均9株，3次重复，培养40d；NAA的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/L；IAA的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/L；IBA的浓度分为1.0、1.5和2.0mg/L。
从表4中可知，丛芽生根率在外源生长素正交设计L9各处理中呈显著性差异。生根率大小依次为：处理6>处理5>处理7>处理8>处理9>处理4>处理3>处理2>处理1；处理4、处理7在第8天开始生根，处理8在第9天开始生根，处理5、处理6在第10天开始生根。从丛芽生根持续时间来看，丛芽在处理5、处理6中生根持续时间约为10d，生根率均在90％以上，出根整齐，单丛生根量为3～8条，适合移栽和批量生产。
表4
第四步，选用泥炭土和黄心土，将其按体积为1∶5的比例搅拌均匀，将单芽和丛芽分别移栽至育苗杯中培育，移栽2个月后统计成活率。
在使用育苗杯时，可以通过开口向育苗杯内放入芽苗，可以根据芽苗的长势通过育苗杯底部的斜面对育苗杯进行多角度的放置，便于育苗杯内的芽苗多角度的进行光合作用。
为了验证对比，在起奎及育苗杯中分别移栽200丛生根丛芽，在摆放区域条件和管理条件一致的情况下培育2个月后统计成活率。直接移栽在奎中的苗木成活率为75％，育苗杯中的苗木成活率为95％，丛芽根系粗壮，基质中缝隙较大，生长空间良好且保水效果好；而在奎中的基质因为无固定边界，在淋水时易发生位移，与丛芽根系形成空隙且不保水，导致根系易因缺水而死亡；育苗杯中的基质因有固定围合边界，在淋水时水易下沉，且易与根系紧密结合，便于根系吸收水分与生长，促进苗木成活。
结论
本发明中野生小叶红叶藤种子无菌率可高至100％；其胚芽已发育完全，在接种后第7～13天开始抽芽，生长良好；将剪下的芽苗接种在含外源激素6-BA 0.8mg/L和NAA0.3mg/L的增殖培养基中，可分化出的不定芽多且健壮。
芽苗因增殖率高，对培养基营养元素的消耗也多，易出现玻璃化现象，因营养供应不上而出现黄化和落叶等现象；为了维持不定芽的健壮生长，在培养基中添加CH 100mg/L、防落素15mg/L、VC 20mg/L及核黄素20mg/L，可有效地改善芽苗生长情况，使丛芽健壮和枝繁叶茂。
本发明中小叶红叶藤丛芽在添加NAA 1.0mg/L、IAA1.5 mg/L及IBA1.0 mg/L的改良MS生根培养基中，生根率可达97.59％，且根系健壮，适合在育苗杯中移栽，移栽成活率可达95％。
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述，所属领域普通技术人员知晓申请日或者优先权日之前发明所属技术领域所有的普通技术知识，能够获知该领域中所有的现有技术，并且具有应用该日期之前常规实验手段的能力，所属领域普通技术人员可以在本申请给出的启示下，结合自身能力完善并实施本方案，一些典型的公知结构或者公知方法不应当成为所属领域普通技术人员实施本申请的障碍。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (9)
1.小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：种子及种胚消毒灭菌；采摘6～8成成熟的野生小叶红叶藤果实，将其处理分成种子和种胚两部分，分别对种子和种胚进行外植体的消毒灭菌；
S2：扩繁；消毒灭菌后，分别将种子和种胚接种于添加了6-BA、NAA和无外源激素的MS始芽及继代培养基中，观察始芽诱导及芽苗不定芽分化和生长情况；
S3：生根；分别挑选出顶芽叶片舒展、叶色翠绿且色带明显、生长健壮和高3～4cm单芽和2～3个芽苗的丛芽并接种于生根培养基中；
S4：移栽，选用泥炭土和黄心土，将其按体积为1∶5的比例搅拌均匀，将单芽和丛芽分别移栽至育苗杯中培育，移栽2个月后统计成活率。
2.根据权利要求1所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：S1中，消毒灭菌的方式为：先在烧杯内使用清水对种子和种胚漂洗5～10min，漂洗过程中用玻璃棒不断搅拌使种子和种胚充分洗净，漂洗完毕采用纱布封好烧杯口，置于流水下冲洗1h，用滤纸将种子和种胚吸干水分备用；将带种皮的种子和去掉种皮及假种皮的种胚分别放入不同消毒剂中消毒，消毒后进行接种，每种消毒剂均接种20瓶，每瓶接种1粒种子和种胚中的一种，培养15d后观察统计污染情况。
3.根据权利要求2所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：消毒剂可选用1‰HgCl2溶液和75％酒精。
4.根据权利要求3所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：S2中，为诱导出不定芽，抽芽后，将抽芽剪至2～3cm的单芽，接种于添加了6-BA和NAA的MS增殖培养基中，每处理接种30瓶，每瓶接种单芽5个，3个重复，培养30d。
5.根据权利要求4所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：S2中，为防止芽苗在培养过程中出现黄化、落叶和枯死现象，在增殖培养基中添加酸水解酪蛋白20～100mg/L、防落素5～15mg/L、VC10～20mg/L和核黄素10～20mg/L，分别进行不同浓度的试验，每处理均接种30瓶，每瓶均接种丛芽4个，3个重复，培养30d。
6.根据权利要求5所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：S3中，生根培养基以1/3MS为基本培养基，添加不同浓度的NAA、IAA和IBA，采用正交设计L9进行试验，每种处理均20瓶，每瓶均9株，3次重复，培养40d。
7.根据权利要求6所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：NAA的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/L；IAA的浓度分为0.5、1.0和1.5mg/L；IBA的浓度分为1.0、1.5和2.0mg/L。
8.根据权利要求7所述的小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的方法，其特征在于：育苗杯内部中空且顶部开设有开口，育苗杯底部的两侧均呈斜面。
9.小叶红叶藤种子与种胚组织培养繁殖的应用，其特征在于：根据权利要求1-8的方法所繁殖的小叶红叶藤种子与种胚组织，小叶红叶藤的植株可用做园林景观，小叶红叶藤的茎叶可用做制备保健茶饮品的原材料。
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