CN110100677A - 一种白及种育苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物生物技术领域，公开了一种白及种子育苗的方法，依次包括以下步骤：(1)白及果实外植体的选择与消毒；(2)白及种子的催芽；(3)播种；(4)育苗管理。在上述步骤中采用不种处理方法和不同材料。采用本发明的方法，能够快速地获得白及种苗，利于产业化生产。采用本发明方法，白及种子萌发率可达98％以上，经催芽处理后，播种7天内即可见明显的子叶，苗生长整齐，栽培3‑4个月后，假鳞茎直径可达2厘米以上，可育出5000‑10000株种苗/米²，并可于翌年春季移栽至大田种植，加快了商品白及的生产。

Description

一种白及种育苗的方法

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及使用白及种子生产种苗的方法。

背景技术

白及[Bletilla striata(Thunb.ex A.Murray)Rchb.f.]，为兰科(Orchidaceae)白及属(Bletilla Rchb.f.)多年生草本植物，分布于陕西南部、甘肃东南部、江苏、安徽、浙江、江西、福建、湖北、湖南、广东、广西、四川和贵州，生于海拔100-3200米的常绿阔叶林下，针叶林下、路边草丛或岩石缝中，假鳞茎扁球形，上面具荸荠似的环带，富粘性。假鳞茎入药名为白及，收录于《中国药典》，其性微寒，味苦、甘、涩，归肺、胃经，具收敛止血、消肿生肌之功效，主治烫灼伤、肺伤咳血、衄血、金疮出血、痈疽肿毒、溃疡疼痛、手足皱裂、肛裂等症。现代的药理研究表明白及假鳞茎浸出液具止血、保护胃粘膜、抗肿瘤和抗菌作用。现代医学研究发现，白及多糖可作生物材料，同时白及拥有良好的美白护肤作用，此外，白及花还可做花茶，具保健作用。因此对白及来说，一旦融入现代生产工艺中，白及的需要将会与日俱增。事实上，白及的价格连年攀升，由2000-2002年的13-14元/公斤，2007年升高到75-80元/公斤，2011年的200元/公斤，2017年已经达到800-950元/公斤。市场的巨大需求致使野生白及几乎被采挖殆尽，成为濒临灭绝的名贵中药材，被国家列为重点保护的野生药用植物之一，还被国际贸易公约(CITES)附录二录入加以保护，所以如何高速人工种植是解决供不应求的关键。

传统的繁育白及种苗的方法主要依靠分株繁殖，但分株繁殖周期长，繁殖效率低，而且耗种量大，成本更高。建立人工繁育方法是中药材研究中常用的行之有效的方法，人工繁育方法一方面可以保护野生资源，另一方面可为规模化种植提供大量种苗。组织培养方法是目前最为常用的人工繁育方法，然而运用该技术需要配备仪器，设备，场地，人力资源等，极大的增加了成本投入。近年来，也有少数科研机构进行了白及种子直播育苗，并初显成效。目前针对白及育苗的种子直播育苗方法，其技术关键在为白及提供营养，提高白及的萌芽率，而白及萌芽的营养最主要由苗床的基质提供，存在着基质配比复杂、成本高和种子萌芽率低等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对组织培养中场地、人力成本等不足及现有直播育苗中种子萌发率和基质成本等不足，提供短时间、低成本、操作简便、高成活率，并利于实现产业化生产的利用种子来繁殖白及种苗的方法。

为实现本发明之目的，采用以下技术方案予以实现：一种结合无菌萌发和种子直播的白及育苗方法，依次包括以下步骤：

(1)白及果实外植体的选择和消毒

于8-12月取白及果实，用70％～75％酒精擦拭表面后低温保存至少7天，取出后加入适量的洗洁精溶液搅拌浸泡2-4分钟，用流水冲洗0.5-1.0小时后，沥干后在超净台里将果实直接浸泡于均添加1滴吐温-80作为表面活性剂的0.1％HgCl₂溶液或5％次氯酸钠溶液10-120分钟，无菌水中浸洗2-3遍，每次2-5分钟，获得消毒的果实外植体；

(2)白及种子的催芽

将上一步得到的果实，剪去头尾，沿果瓣纵轴方向将果皮切开，灼烧过的镊子夹住果实，将种子抖落到无菌液体MS培养基内，培养基添加了不大于10.0毫克/升的6-苄基腺嘌呤(6-BA)，不大于1.0毫克/升的α-萘乙酸(NAA)，不大于1.0毫克/升的赤霉素(GA₃)，不大于200克/升的香蕉泥，蔗糖30克/升，pH为5.8-6.0；放入恒温摇床以0-200转/分的转度，温度23-30℃，振荡培养0-20天；

(3)播种

将上一步得到的白及种子用无菌水浸洗3-5次后，与灭菌的腐殖质土均匀混合，比例为1个白及荚果的种子配不超过50升的腐殖质土。随后将种子腐殖质混合物摊在环保无纺布，厚度不超过5厘米；环保无纺布下铺5厘米厚的灭菌腐殖质土；在种子腐殖质土上再铺1层不超过5厘米厚的灭菌腐殖质土，喷水让环保无纺布以上灭菌腐殖质湿润后，再在其上覆以透明地膜，保持室内温度15-25℃；

(4)育苗管理

待上步播种的种子萌发后，揭去透明地膜，每天早晚喷雾各1次，保持空气湿度70％-80％，每7天再喷施1次0-100％浓度MS和0-800毫克/升NaHSO₃混合溶液，用量为1升/米²。待温度适宜即可将苗移栽至大田。

作为优选方案：所述步骤(1)中选择由绿转黄但未变褐的果实，用70％酒精擦拭表面后放入冰箱4℃保存7-30天后作为外植体进行表面消毒，浸泡消毒为40-90分钟。

作为优选方案：所述步骤(2)中的MS培养基添加有6-BA 1.0-3.0毫克/升，NAA0.1-0.3毫克/升，GA3 0.1-0.2毫克/升，香蕉泥40-80克/升。恒温摇床的转速为50-100转/分钟，振荡培养3-4天，种子开始转绿，可用于播种。

作为优选方案：所述步骤(3)中的1个白及荚果的种子与5-10升的灭菌腐殖质土均匀混合后，摊在环保无纺布上的厚度为0.5-1.0厘米，上面再覆盖无菌腐殖质土厚度为0.5-1.0厘米。

作为优选方案：所述步骤(4)中的喷施的MS溶液浓度逐渐增加，刚开始喷施的叶面肥为4％MS+50毫克/升NaHSO₃混合溶液，直至升高到白及苗高5厘米以上的25％MS+200毫克/升NaHSO₃混合溶液，可促进白及苗快速生长。

与现有技术相比较，本发明的有益效果是：

1.本发明提供的方法结合白及种子无菌萌发和种子直播育苗的优点，白及无菌萌发的速度快，萌发率高且整齐，而直播育苗，可节省劳力、仪器设备的成本；此外，由于育苗放在冬季，减少了病虫害的发生，且加快了商品白及的生产；

2.本发明的方法克服了因白及种子细小无胚乳而在自然条件下极难萌发的困境，为白及快速有性繁殖开辟了一条新的途径，具有生产和经济上的双重意义。

3.采用本发明的方法，白及种子萌发率可达98％以上，经催芽处理后，播种7天内即可见明显的子叶，苗生长整齐，栽培3-4个月后，假鳞茎直径可达2厘米以上，可育出5000-10000株种苗/米²，并可于翌年春季移栽至大田种植，加快了商品白及的生产。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本申请作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

实施例1

一种白及种子育苗的方法，依次包括以下步骤：

(1)白及果实外植体的选择和消毒

于当年8-12月取白及果实，选择无虫蛀和霉变的、转黄到未变褐的果实，用70％酒精擦拭表面后放入冰箱4℃保存7天，实验前取出后加入适量的洗洁精溶液搅拌浸泡2-4分钟，用流水冲洗0.5-1.0小时后，沥干后在超净台里将果实直接浸泡于0.1％HgCl₂溶液或5％次氯酸钠溶液(均添加1滴吐温-80作为表面活性剂)40-90分钟，无菌水中浸洗2-3遍，每次2-5分钟，获得消毒的果实外植体。

(2)白及种子的催芽

将上一步得到的果实，剪去头尾，沿果瓣纵轴方向将果皮切开，灼烧过的镊子夹住果实，将种子抖落到无菌液体MS培养基内，培养基添加了6-苄基腺嘌呤(6-BA)2.0毫克/升，α-萘乙酸(NAA)0.2毫克/升，赤霉素(GA₃)0.2毫克/升，香蕉泥80克/升，蔗糖30克/升，pH为5.8-6.0；放入恒温摇床以50转/分的转度，温度23-30℃，振荡培养3天，种子开始转绿，可用于播种；

(3)播种

将上一步得到的白及种子用无菌水浸洗3-5次后，与灭菌的腐殖质土均匀混合，比例为1个白及荚果的种子配5-10升的腐殖质土。随后将种子腐殖质混合物摊在环保无纺布，厚度1厘米左右；环保无纺布下铺5厘米厚的灭菌腐殖质土。在种子腐殖质土上再铺1层1厘米左右厚的灭菌腐殖质土，喷水让环保无纺布以上灭菌腐殖质湿润后，再在其上覆以透明地膜，保持室内温度15-25℃；

(4)育苗管理

待上步播种的种子萌发后，揭去透明地膜，每天早晚喷雾各1次，保持空气湿度70％-80％，每7天再喷施1次5-25％浓度MS和0-800毫克/升NaHSO₃混合溶液，用量为1升/米²，具体为刚开始喷施的叶面肥为4％MS+50毫克/升NaHSO₃混合溶液，直至升高到白及苗高5厘米以上的25％MS+200毫克/升NaHSO₃混合溶液。待温度适宜即可将苗移栽至大田；

在本实施例中，经催芽处理后，播种7天内即可见明显的子叶，苗生长整齐，栽培3-4个月后，假鳞茎直径可达2厘米以上，可育出5000-10000株种苗/米²，并可于翌年春季移栽至大田种植，加快了商品白及的生产。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于步骤(1)：白及果实外植体的选择与消毒：于当年8-12月取白及果实，用70％酒精擦拭表面后放入冰箱4℃保存，实验前取出后加入适量的洗洁精溶液搅拌浸泡2-4分钟，用流水冲洗0.5-1.0小时后，沥干后在超净台里将果实直接浸泡于0.1％HgCl₂溶液或5％次氯酸钠溶液(均添加1滴吐温-80作为表面活性剂)10-120分钟，无菌水中浸洗2-3遍，每次2-5分钟，获得消毒的果实外植体。

表1不同消毒时间对白及果实消毒效果的影响

参见表1，随着消毒时间的延长，种子的污染率随之下降，下降幅度基本都是50％递减方式型，由0.1％HgCl₂溶液消毒10分钟后56.67％的污染率，下降到0.1％HgCl₂溶液消毒30分钟后3.67％的污染率，随后污染率均降为0，但消毒时间过久消毒液可能进入果实内部会对种子造成伤害，故选择40分钟-90分钟的消毒可确保完全消毒又对萌发无影响。另外，需要指出的是，果实里的种子是一种无菌的状态，影响污染率的是果荚附着的真菌休眠孢子。

表2列出了不同低温预处理时间对步骤2中白及种子转绿的影响：

表2不同低温预处理时间对白及种子转绿的影响

参见表2，随着低温预处理天数的延长，白及种子转绿所需的时间不断缩短，萌发率一直升高，低温处理3天时白及种子转绿已接近100％。

另外对绿色，黄色和黑色果实的萌发实验表明，黄色果实的萌发率最高，其种子基本已经成熟，而且此时蒴果并未开裂，故果实的消毒并不会对内部的种子造成伤害，而颜色为黑色的果实其蒴果可能已经成熟开裂，浸泡消毒时消毒液进入其中，伤害到了种子，且影响了浸泡清洗残存消毒液的效果，导致种子的萌发率极低。综合来看，采收黄色果实4℃冷藏于冰箱7天后的果实为最佳外植体，消毒40-90分钟为最佳消毒时间。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于步骤(2)：白及种子的催芽：将上一步得到的果实放到湿润无菌滤纸上，横切去头尾，沿果瓣纵轴方向将果皮切开，灼烧过的镊子夹住果实，将种子均匀撒在湿润无菌滤纸块上，尽量只有一层，用无菌镊子将撒好种子的湿润无菌滤纸块夹入培养基内平铺放好，培养基为添加了0-10.0毫克/升6-苄基腺嘌呤(6-BA)，0-1.0毫克/升α-萘乙酸(NAA)，0-1.0毫克/升赤霉素GA₃，80克/升香蕉泥的MS培养基中，该培养基中的蔗糖添加量为30克/升，pH为5.8-6.0，放入恒温摇床以0-200转/分的转度，温度23-30℃，振荡培养0-20天；表3列出了在MS培养基中添加不同植物生长调节剂及其配比对白及种子无菌萌发的影响试验：

表3植物生长调节剂配比对白及种子催芽的影响

结果发现，适中浓度的6-BA和NAA对于白及种子萌发起着关键作用；添加GA₃加速了种子的萌发，这可能与GA₃破除休眠、促进种子萌发及促进完整茎段伸长的生理功能有关；此外，还发现添加2,4-D作为生长素，效果要差于NAA，可能与2,4-D常会诱导形成愈伤组织而对生长不利有关。TDZ不仅具有细胞分裂素的作用，据报道还有生长素的作用，在诱导丛生芽的效果往往优于6-BA，而在促进萌发上，还是弱于6-BA。

进一步地，转速对于种子均匀接触培养基溶液非常重要，但转速太快会导致种子粘上瓶盖，带来开盖时的麻烦，故选择50转/分钟是最佳的转速，也保证了种子可充分接触培养基溶液。而在摇床里振荡催芽的时间长短是影响白及萌发的重要因素，实验发现，振荡催芽时间过短此带来在后面的育种时出苗不一，而振荡催芽时间过长容易导致白及萌发，导致后面的育种时幼苗出土率的下降；故应该选择3-4天的芽萌动，但并未萌发时为宜。

综上所述，催芽选择的培养基最佳为添加2.0毫克/升6-BA，0.2毫克/升NAA，0.1毫克/升GA3的MS液体培养基，种子添加后放到恒温摇床中以50转/分钟振荡3-4天为宜，抽检实验发现，白及种子转绿萌动率可达98％以上。

实施例4

本实施例与实施例1的区别在于步骤(3)：播种：将上一步得到的白及种子用无菌水浸洗3-5次后，与灭菌的腐殖质土均匀混合，比例为1个白及荚果的种子配0-50升的腐殖质土。随后将种子腐殖质混合物摊在环保无纺布，厚度0-5厘米左右。环保无纺布下铺5厘米厚的灭菌腐殖质土。在种子腐殖质土上再铺1层0-5厘米左右厚的灭菌腐殖质土，喷水让环保无纺布以上灭菌腐殖质湿润后，再在其上覆以透明地膜，保持室内温度15-25℃。已有研究结果表明，每个白及果实平均有种子10436粒，对于不同播种密度的实验发现，5000-10000棵/米²的幼苗种植密度下幼苗生长良好，则对应的与种子混合的腐殖质土的体积是1个荚果的种子配10-20升的灭菌腐殖质土，摊成1厘米；考虑到种子萌发后根的伸长需要空间，有孔的无纺布胜过无孔的塑料薄膜等材料，无纺布也广泛用于断坡绿化时种子喷施的固定物质。同时在种子腐殖质土混合物质的上面盖层1厘米厚的灭菌腐殖质土可以给种子层以黑暗和水分的保持，实验表明1-2厘米厚的腐殖质土层有着最高的白及幼苗出苗率，过高和过低均会降低出苗率。

实施例5

本实施例与实施例1的区别在于步骤(4)：育苗管理：待上步播种的种子萌发后，揭去透明地膜，每天早晚喷雾各1次，保持空气湿度70％-80％，每7天再喷施1次0-100％浓度MS和0-800毫克/升NaHSO₃混合溶液，用量为1升/米²。待温度适宜即可将苗移栽至大田。已经有研究表明，NaHSO₃溶液的喷施有助于提高光合作用，光合作用的进行有赖于养分的吸收，故喷施MS溶液有助于光合作用的进行，这样有助于白及幼苗的生长，实验发现，小苗对于养分的需要较小，而随着幼苗的长大，对养分和光合作用的增强，故随之变化的MS和NaHSO₃浓度有着更好的针对性，1个白及荚果的种子配5-10升的腐殖质土。随后将种子腐殖质混合物摊在环保无纺布，厚度1厘米左右。环保无纺布下铺5厘米厚的灭菌腐殖质土，在种子腐殖质土上再铺1层1厘米左右厚的灭菌腐殖质土的操作有着最佳的栽培效果，效果好于不喷施或喷施恒定浓度的混合溶液。

Claims (6)

1.一种白及种子育苗的方法，其特征在于：依次包括以下步骤：

(1)白及果实外植体的选择和消毒

于8-12月取白及果实，用70％～75％酒精擦拭表面后低温保存至少7天，取出后加入适量的洗洁精溶液搅拌浸泡2-4分钟，用流水冲洗0.5-1.0小时后，沥干后在超净台里将果实直接浸泡于均添加1滴吐温-80作为表面活性剂的0.1％HgCl₂溶液或5％次氯酸钠溶液10-120分钟，无菌水中浸洗2-3遍，每次2-5分钟，获得消毒的果实外植体；

(2)白及种子的催芽

将上一步得到的果实，剪去头尾，沿果瓣纵轴方向将果皮切开，灼烧过的镊子夹住果实，将种子抖落到无菌液体MS培养基内，培养基添加了不大于10.0毫克/升的6-苄基腺嘌呤(6-BA)，不大于1.0毫克/升的α-萘乙酸(NAA)，不大于1.0毫克/升的赤霉素(GA₃)，不大于200克/升的香蕉泥，蔗糖30克/升，pH为5.8-6.0；放入恒温摇床以0-200转/分的转度，温度23-30℃，振荡培养0-20天；

(3)播种

将上一步得到的白及种子用无菌水浸洗3-5次后，与灭菌的腐殖质土均匀混合，比例为1个白及荚果的种子配不超过50升的腐殖质土。随后将种子腐殖质混合物摊在环保无纺布，厚度不超过5厘米；环保无纺布下铺5厘米厚的灭菌腐殖质土；在种子腐殖质土上再铺1层不超过5厘米厚的灭菌腐殖质土，喷水让环保无纺布以上灭菌腐殖质湿润后，再在其上覆以透明地膜，保持室内温度15-25℃；

(4)育苗管理

待上步播种的种子萌发后，揭去透明地膜，每天早晚喷雾各1次，保持空气湿度70％-80％，每7天再喷施1次0-100％浓度MS和0-800毫克/升NaHSO₃混合溶液，用量为1升/米²。待温度适宜即可将苗移栽至大田。

2.根据权利要求1所述的白及种子育苗的方法，其特征在于：所述步骤(1)中选择由绿转黄但未变褐的果实，用70％酒精擦拭表面后放入冰箱4℃保存7-30天后作为外植体进行表面消毒，浸泡消毒为40-90分钟。

3.根据权利要求1所述的白及种子育苗的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的MS培养基添加有6-BA 1.0-3.0毫克/升，NAA 0.1-0.3毫克/升，GA3 0.1-0.2毫克/升，香蕉泥40-80克/升；恒温摇床的转速为50-100转/分钟，振荡培养3-4天，种子开始转绿，可用于播种。

4.根据权利要求1所述的白及种子育苗的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的1个白及荚果的种子与5-10升的灭菌腐殖质土均匀混合后，摊在环保无纺布上的厚度为0.5-1.0厘米，上面再覆盖无菌腐殖质土厚度为0.5-1.0厘米。

5.根据权利要求1所述的白及种子育苗的方法，其特征在于：所述步骤(4)中的喷施的MS溶液浓度逐渐增加，刚开始喷施的叶面肥为4％MS+50毫克/升NaHSO₃混合溶液，直至升高到白及苗高5厘米以上的25％MS+200毫克/升NaHSO₃混合溶液。

6.根据权利要求1所述的白及种子育苗的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的MS培养基添加有6-BA 2.0毫克/升，NAA 0.2毫克/升，GA3 0.2毫克/升，香蕉泥80克/升；恒温摇床的转速为50转/分钟，振荡培养3-4天，种子开始转绿，可用于播种。