CN110771443A - 阳山白及单一培养基配方无菌播种成苗生产工艺流程 - Google Patents

Abstract

本发明涉及快繁技术，尤其是阳山白及单一培养基配方无菌播种成苗生产工艺流程；每一升组织培养基含有以下重量的组份：NAA0.2mg+6BA0.5mg+马铃薯100g+酸水解酪蛋白1g+蔗糖20g，余量为改良MS培养基。无菌播种成苗生产工艺操作简便、生产能力强；用单一培养基配方转接培养成苗，每果荚可培育种苗1.5～2.0万株；从播种开始到可出圃用于种植的时间约330天，时间短；如需培育大苗，可继续留床培育2～3年生大田种植半成品苗；污染率低、成苗率高；试管苗移栽管理操作简单、成活率高、生长速度快；种苗优质、生产快速、高效、成本低，可进行工厂化大规模优质种苗生产。通过一种培养基，解决了白及播种、扩繁促长和炼苗等多个问题，具有实用性。

Description

阳山白及单一培养基配方无菌播种成苗生产工艺流程

技术领域

本发明涉及快繁技术，尤其是阳山白及单一培养基配方无菌播种成苗生产工艺流程。

背景技术

白及属植物是温带地生兰科植物中最具经济价值的类群之一,不仅具有较高的经济价值,亦是我国常用的中药材之一。白及属植物为多年生草本植物,约有6种，主要分布在中国,日本以及缅甸北部。我国有4种,即白及[Bletillastriata(Thunb.)Rchb.f.]、华白及[Bletilla sinensis(Rolfe)Schltr]、小白及[Bletilla formosana(Hayata)Schltr]、黄花白及[Bletilla ochracea Schltr]。

白及的繁殖系数较低,自然繁殖困难。因其极高的经济价值与药用价值,野生白及资源遭到了无限制人工采挖。同时,加上白及生态环境遭破坏,野生资源日益减少,目前已被《中国植物红皮书——稀有濒危植物》第1册收录,同时也被写人了《濒危野生动植物国际贸易公约》(CITEs)保护种类。随着白及野生资源量的骤减,市场需求量的增加,大力推广人工栽培种植显得越来越重要。为了提高白及质量,必须建设白及种质资源保存中心,对白及种质资源进行收集、鉴定和评价,加强白及的基础研究工作,选育优良品种,扩大种苗繁殖,加强规范化栽培技术推广和区域性规模化生产,制定种苗和药材质量标准,实现基地建设的集约化和规模化,推进白及种植产业化发展。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种可实现白及快速繁殖的生产工艺。

本发明的技术方案为：

阳山白及单一培养基配方无菌播种成苗生产工艺流程，其特征在于：它包括以下步骤：

S1，优良种质资源选育

不同产地采集野生种源→种质资源圃建立观察分析→优良种质确立→优良单株筛选及株群建立→人工控制授粉及优质果荚生产→组织培养无菌播种育苗。阳山县三连阳生态农林开发有限公司通过八年的研究选育出历年白及最优种质，培育了“粤北白及1号”优质品种。

S2，组织培养无菌播种育苗繁殖体系建立

1、荚果消毒无菌播种操作：国庆节前后，取“粤北白及1号”优质品种、生长健壮、健康无病虫害的果荚(6～7个月胚龄)，用75％酒精抹擦后，在超净工作台上进行无菌操作：放入75％酒精湿润2min，用0.1％的HgCl溶液灭菌10min，用无菌水冲洗2次，再用0.1％的HgCl溶液灭菌5min，用无菌水冲洗5次，将消毒好的果荚剥开，取出种子播种于发芽播种培养基(RJ2)上。

2、发芽播种培养基(RJ2)：改良MS+NAA0.2mg/L+6BA0.5 mg/L+马铃薯100g/L+酸水解酪蛋白1g/L+蔗糖20g/L，PH＝5.4

3、无菌播种发芽培养条件(培养室)：①温度25±2℃；②光照强度2500～3500Lux；③光照时间10h。

4、结果：接种果荚10个，无菌播种50瓶。统计观察：10d转绿，20天发芽，30d苗高0.3～0.5cm,60d苗高0.7～1.0cm,60d第一次转接，污染率0.0％，发芽率96.5％

S3，无菌播种苗扩繁促长

1、无菌播种苗扩繁促长培养基(RJ2)：改良MS+NAA0.2mg/L+6BA0.5 mg/L+马铃薯100g/L+酸水解酪蛋白1g/L+蔗糖20g/L，PH＝5.4

2、无菌播种苗扩繁促长培养条件(培养室)：温度25+2℃；光照强度2500～3500Lux；光照时间10h。

3、无菌播种苗扩繁促长转接培养过程：60d为转接培养周期，连续转接培养两个周期，共转接2次，培养120天。

4、结果：经2次转接，无菌播种50瓶变为5000瓶。统计观察：120d苗高2.5～3.5cm，叶片2片、翠绿，假鳞茎直径0.1～0.2cm。180d苗高3.5～5.5cm,叶片3片、翠绿，假鳞茎直径0.2～0.4cm，根2～3条、长0.5～1.5cm，污染率2.5％，成苗率98.5％。

S4，无菌播种苗成苗炼苗培养

1、无菌播种苗成苗炼苗培养培养基(RJ2)：改良MS+NAA0.2mg/L+6BA0.5 mg/L+马铃薯100g/L+酸水解酪蛋白1g/L+蔗糖20g/L，PH＝5.4

2、无菌播种苗成苗炼苗培养培养条件(炼苗塑料大棚)：温度:18.5～28.5℃，光照强度6000～8500Lux,光照时间8～11h。

3、无菌播种苗成苗转接炼苗培养过程：转接后当天用保鲜膜立即密封瓶盖与瓶子接口处，隔天放入炼苗塑料大棚炼苗培养，炼苗培养培养周期为60d。

4、结果：经1次转接，无菌播种5000瓶变为10000瓶，炼苗培养60d统计观察：每瓶苗15～20株(丛)，240d苗高5.5～7.5cm,叶片3片、翠绿；假鳞茎直径0.5～0.7cm，根3～4条、长0.7～2.5cm，污染率4.5％，成苗率99.0％。

S5，无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化

1、无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化环境条件：光照强度6000～12000Lux，湿度50～75％，温度22.5～32.5℃。

2、无菌播种苗成苗移栽基质：分两部分，底部为混合基质，泥炭土：干净河沙为4:1，厚8～10cm,表层为纯干净河沙，厚3.0～3.5cm。

3、无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化时间：90d

4、无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化过程：塑料大棚炼苗培养→取苗冲洗→消毒晾苗→种苗种植→栽培管理。

5、结果：移栽驯化90d统计观察：苗高9.5～12.5cm,每株新芽长出0～2个，老芽叶片3片、翠绿；假鳞茎直径0.7～1.0cm；根3～5条、长0.2～6.5cm，移栽成活率92.5％，成苗率99.0％。

进一步地，培养基中每一升组织培养基含有以下重量的组份：

NAA0.2mg+6BA0.5mg+马铃薯100g+酸水解酪蛋白1g+蔗糖20g，余量为改良MS培养基。

进一步地，所述改良MS培养基由大量元素成分、络合铁成分、微量元素成分和氨基酸及维生素成分组成；

其中，所述大量元素中各成分的用量分别为硝酸铵825mg/L、硝酸钾950mg/L、磷酸二氢钾185mg/L、氯化钙220mg/L、硫酸镁185mg/L；

其中，所述络合铁成分中各成分的用量分别为硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙二钠盐37.3mg/L；

其中，所述微量元素成分中各成分的用量分别为钼酸钠0.25mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L；

其中，所述氨基酸及维生素成分中各成分的用量分别为甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆辛0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L。

进一步地，所述培养基的配置步骤：

步骤一，按照硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁的用量标准称取药剂，混合定容至1升，配置成一号母液；

步骤二，按照硫酸亚铁、乙二胺四乙二钠盐的用量标准称取药剂，将硫酸亚铁、乙二胺四乙二钠盐分别放入450mL蒸馏水中，搅拌并加热，两者完全溶解后将两者混合并定容至1升，配置成二号母液；

步骤三，按照钼酸钠、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钴、碘化钾、硼酸的用量标准称取药剂，混合定容至1升，配置成三号母液；

步骤四，按照甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、烟酸、肌醇的用量标准称取药剂，混合定容至1升，配置成四号母液；

步骤五，根据使用量吸取一号至四号母液混合并稀释获得改良MS培养基；

步骤六，将改良MS培养基与NAA、6BA、马铃薯、酸水解酪蛋白、蔗糖混合，然后按照7g/L的用量投入琼脂；

步骤七，将上述混合物分装在组培瓶高压消毒120分钟即可使用。

本发明的有益效果为：无菌播种成苗生产工艺操作简便、生产能力强；用单一培养基配方转接培养成苗，每果荚可培育种苗1.5～2.0万株；从播种开始到可出圃用于种植的时间约330天，时间短；如需培育大苗，可继续留床培育2～3年生大田种植半成品苗；污染率低、成苗率高；试管苗移栽管理操作简单、成活率高、生长速度快；种苗优质、生产快速、高效、成本低，可进行工厂化大规模优质种苗生产。

具体实施方式

下面结合具体实施方式作进一步说明：

(1)优良种质资源选育

不同产地采集野生种源→种质资源圃建立观察分析→优良种质确立→优良单株筛选及株群建立→人工控制授粉及优质果荚生产→组织培养无菌播种育苗。阳山县三连阳生态农林开发有限公司通过八年的研究选育出历年白及最优种质，培育了“粤北白及1号”优质品种。

(2)组织培养无菌播种育苗繁殖体系建立

1、荚果消毒无菌播种操作：国庆节前后，取“粤北白及1号”优质品种、生长健壮、健康无病虫害的果荚(6～7个月胚龄)，用75％酒精抹擦后，在超净工作台上进行无菌操作：放入75％酒精湿润2min，用0.1％的HgCl溶液灭菌10min，用无菌水冲洗2次，再用0.1％的HgCl溶液灭菌5min，用无菌水冲洗5次，将消毒好的果荚剥开，取出种子播种于发芽播种培养基(RJ2)上。

2、发芽播种培养基(RJ2)：改良MS+NAA0.2mg/L+6BA0.5 mg/L+马铃薯100g/L+酸水解酪蛋白1g/L+蔗糖20g/L，PH＝5.4

3、无菌播种发芽培养条件(培养室)：①温度25±2℃；②光照强度2500～3500Lux；③光照时间10h。

4、结果：接种果荚10个，无菌播种50瓶。统计观察：10d转绿，20天发芽，30d苗高0.3～0.5cm,60d苗高0.7～1.0cm,60d第一次转接，污染率0.0％，发芽率96.5％

(3)无菌播种苗扩繁促长

1、无菌播种苗扩繁促长培养基(RJ2)：改良MS+NAA0.2mg/L+6BA0.5 mg/L+马铃薯100g/L+酸水解酪蛋白1g/L+蔗糖20g/L，PH＝5.4

2、无菌播种苗扩繁促长培养条件(培养室)：温度25+2℃；光照强度2500～3500Lux；光照时间10h。

3、无菌播种苗扩繁促长转接培养过程：60d为转接培养周期，连续转接培养两个周期，共转接2次，培养120天。

4、结果：经2次转接，无菌播种50瓶变为5000瓶。统计观察：120d苗高2.5～3.5cm，叶片2片、翠绿，假鳞茎直径0.1～0.2cm。180d苗高3.5～5.5cm,叶片3片、翠绿，假鳞茎直径0.2～0.4cm，根2～3条、长0.5～1.5cm，污染率2.5％，成苗率98.5％。

(4)无菌播种苗成苗炼苗培养

1、无菌播种苗成苗炼苗培养培养基(RJ2)：改良MS+NAA0.2mg/L+6BA0.5 mg/L+马铃薯100g/L+酸水解酪蛋白1g/L+蔗糖20g/L，PH＝5.4

2、无菌播种苗成苗炼苗培养培养条件(炼苗塑料大棚)：温度:18.5～28.5℃，光照强度6000～8500Lux,光照时间8～11h。

3、无菌播种苗成苗转接炼苗培养过程：转接后当天用保鲜膜立即密封瓶盖与瓶子接口处，隔天放入炼苗塑料大棚炼苗培养，炼苗培养培养周期为60d。

4、结果：经1次转接，无菌播种5000瓶变为10000瓶，炼苗培养60d统计观察：每瓶苗15～20株(丛)，240d苗高5.5～7.5cm,叶片3片、翠绿；假鳞茎直径0.5～0.7cm，根3～4条、长0.7～2.5cm，污染率4.5％，成苗率99.0％。

(5)无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化

1、无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化环境条件：光照强度6000～12000Lux，湿度50～75％，温度22.5～32.5℃。

2、无菌播种苗成苗移栽基质：分两部分，底部为混合基质，泥炭土：干净河沙为4:1，厚8～10cm,表层为纯干净河沙，厚3.0～3.5cm。

3、无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化时间：90d4、无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化过程：塑料大棚炼苗培养→取苗冲洗→消毒晾苗→种苗种植→栽培管理。

5、结果：移栽驯化90d统计观察：苗高9.5～12.5cm,每株新芽长出0～2个，老芽叶片3片、翠绿；假鳞茎直径0.7～1.0cm；根3～5条、长0.2～6.5cm，移栽成活率92.5％，成苗率99.0％。

(6)改良MS+NAA0.2mg/L+6BA0.5 mg/L+马铃薯100g/L+蔗糖20g/L，PH＝5.4各成分组成表(表-1)

表-1改良MS+NAA0.2mg/L+6BA0.5 mg/L+马铃薯100g/L+蔗糖20g/L，PH＝5.4各成分组成表

(一)改良MS培养基成分组成表

大量元素成分组成(单位：mg/L)

络合铁成分组成(单位：mg/L)

微量元素成分组成(单位：mg/L)

氨基酸及维生素成分组成(单位：mg/L)

(二)其它附加成分组成表

本实施例的意义在于：

对于药用植物而言,种子(种苗)的质量决定了该品种的品质,对药材的安全性、稳定性及有效性都会有所影响。只有优良的中药材种子种苗，才能生产出优质的中药材。中药材的生产周期多为3～5年。因此,由于使用假种,劣种面造成的损失往往无法挽回。

我国药用作物品种选育研究尚停留在种质资源评价和野生驯化栽培层面，长期停留在以野生移植和应用主要农作物传统常规育种技术为主的初级阶段,育种手段和方法落后,尚没建立完善的新品种选育体系、评价体系和繁育体系,中药材抗病育种、中药材农药残留问题等方面的研究,也还没有取得实质进展。另外,现行《种子法》偏重粮、油、果、蔬种子管理,至今没有中药材种子(种苗)管理条例或办法。现行《药品法》也并未涉及中药材种子(种苗)新品种,导致中药材源头呈现种源混乱、种质混杂“两混”状态。总之,目前我国中药材基础研究、育种工作和栽培技术薄弱,良种对药材产量提高和质量改善贡献还微乎其微,供需矛盾突出。

白及药用历史悠久,但人工大面积栽培白及还是近几年的事。白及在我国分布较广,因生境和遗传基础不同,特别是没有经过严格的人工选择,在种间和种内其形态和基因型均表现出较高的多样性。

白及生产长期以来处于自由发展的状态,其遗传育种和良种选育工作和粮食作物相比,差距很大。近三年来白及大面积人工栽培逐渐扩大。但是由于长期未加选择纯化,以及种源乱引乱繁,造成白及田间类型混杂,整齐度差,产量、品质、抗性以及适应性等难以满足生产的要求,严重影响了白及药材产量和质量的稳定。选育和培育高产、优质的白及新品种应用于生产刻不容缓。由于遗传基础研究工作薄弱,因此，白及的育种工作做得很少,还停留在初级阶段,主要靠移植和应用农作物上的传统常规育种技术。

粤北连山县、连南县、连州县、阳山县、乳源县、乐昌市、仁化县、南雄市、始兴县等地就有白及野生资源的存在，并且有一定的数量，但由于2010～2012年左右，白及价格一路攀升，导致全国各地药商高价收购粤北一带采挖野生白及，在利益的驱动下，几乎灭绝性的采挖。我司及时采取措施保护了部分种源，并且对原生态较多的地块进行了实时保护，在院校专家的指导下，对粤北白及进行了系统性、科学性的选育，通过八年的研究选育出历年白及最优种质，培育了“粤北白及1号”优质品种。

近年来，随着白及的种植热潮，广东省内也出现了白及种植热，云浮、茂名、肇庆、韶关、惠州、阳江、汕尾、河源、梅州等地涌现了较多的种植大户，但由于种苗来自外地，种源杂乱，出现了乱引乱种的现象，导致大面积死亡，给药农造成了较大的经济损失，并且有些种植户在种苗商的诱导下采用地膜避阳棚的种植方法，不讲究海拔等详细技术指标，盲目种植，甚至使用农药、化肥、膨大剂等，既不保障药材质量，甚至加大药农的负担。

无菌播种成苗生产工艺操作简便、生产能力强；用单一培养基配方转接培养成苗，每果荚可培育种苗1.5～2.0万株；从播种开始到可出圃用于种植的时间约330天，时间短；如需培育大苗，可继续留床培育2～3年生大田种植半成品苗；污染率低、成苗率高；试管苗移栽管理操作简单、成活率高、生长速度快；种苗优质、生产快速、高效、成本低，可进行工厂化大规模优质种苗生产。通过一种培养基，解决了白及播种、扩繁促长和炼苗等多个问题，具有实用性。

上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理和最佳实施例，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

Claims (4)

1.阳山白及单一培养基配方无菌播种成苗生产工艺流程，其特征在于：它包括以下步骤：

S1，优良种质资源选育：不同产地采集野生种源→种质资源圃建立观察分析→优良种质确立→优良单株筛选及株群建立→人工控制授粉及优质果荚生产→组织培养无菌播种育苗；

S2，组织培养无菌播种育苗繁殖体系建立

荚果消毒无菌播种操作：十月一日前后，取6～7个月胚龄的生长健壮、健康无病虫害的果荚，用75％酒精抹擦后，在超净工作台上进行无菌操作：放入75％酒精湿润2min，用0.1％的HgCl溶液灭菌10min，用无菌水冲洗2次，再用0.1％的HgCl溶液灭菌5min，用无菌水冲洗5次，将消毒好的果荚剥开，取出种子播种于发芽播种培养基上；

无菌播种发芽培养条件：温度25±2℃；光照强度2500～3500Lux；光照时间10h；

S3，无菌播种苗扩繁促长

无菌播种苗扩繁促长培养条件：温度25+2℃；光照强度2500～3500Lux；光照时间10h；

无菌播种苗扩繁促长转接培养过程：60d为转接培养周期，连续转接培养两个周期，共转接2次，培养120天；

结果：经2次转接，无菌播种50瓶变为5000瓶；

S4，无菌播种苗成苗炼苗培养

无菌播种苗成苗炼苗培养培养条件：温度:18.5～28.5℃，光照强度6000～8500Lux,光照时间8～11h；

无菌播种苗成苗转接炼苗培养过程：转接后当天用保鲜膜立即密封瓶盖与瓶子接口处，隔天放入炼苗塑料大棚炼苗培养，炼苗培养培养周期为60d；

结果：经1次转接，无菌播种5000瓶变为10000瓶；

S5，无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化

无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化环境条件：光照强度6000～12000Lux，湿度50～75％，温度22.5～32.5℃；

无菌播种苗成苗移栽基质：分两部分，底部为混合基质，泥炭土：干净河沙为4:1，厚8～10cm,表层为纯干净河沙，厚3.0～3.5cm；

无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化时间：90d；

无菌播种苗成苗塑料大棚移栽驯化过程：塑料大棚炼苗培养→取苗冲洗→消毒晾苗→种苗种植→栽培管理；

结果：移栽驯化90d统计观察。

2.根据权利要求1所述的阳山白及单一培养基配方无菌播种成苗生产工艺流程，其特征在于，培养基中每一升组织培养基含有以下重量的组份：

NAA0.2mg+6BA0.5 mg+马铃薯100g+酸水解酪蛋白1g+蔗糖20g，余量为改良MS培养基。

3.根据权利要求2所述的阳山白及单一培养基配方无菌播种成苗生产工艺流程，其特征在于，所述改良MS培养基由大量元素成分、络合铁成分、微量元素成分和氨基酸及维生素成分组成；

其中，所述大量元素中各成分的用量分别为硝酸铵825mg/L、硝酸钾950mg/L、磷酸二氢钾185mg/L、氯化钙220mg/L、硫酸镁185mg/L；

其中，所述络合铁成分中各成分的用量分别为硫酸亚铁27.8mg/L、乙二胺四乙二钠盐37.3mg/L；

其中，所述微量元素成分中各成分的用量分别为钼酸钠0.25mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、硫酸铜0.025mg/L、氯化钴0.025mg/L、碘化钾0.83mg/L、硼酸6.2mg/L；

其中，所述氨基酸及维生素成分中各成分的用量分别为甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆辛0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、肌醇100mg/L。

4.根据权利要求3所述的阳山白及单一培养基配方无菌播种成苗生产工艺流程，其特征在于，所述培养基的配置步骤：

步骤一，按照硝酸铵、硝酸钾、磷酸二氢钾、氯化钙、硫酸镁的用量标准称取药剂，混合定容至1升，配置成一号母液；

步骤二，按照硫酸亚铁、乙二胺四乙二钠盐的用量标准称取药剂，将硫酸亚铁、乙二胺四乙二钠盐分别放入450mL蒸馏水中，搅拌并加热，两者完全溶解后将两者混合并定容至1升，配置成二号母液；

步骤三，按照钼酸钠、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钴、碘化钾、硼酸的用量标准称取药剂，混合定容至1升，配置成三号母液；

步骤四，按照甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆辛、烟酸、肌醇的用量标准称取药剂，混合定容至1升，配置成四号母液；

步骤五，根据使用量吸取一号至四号母液混合并稀释获得改良MS培养基；

步骤六，将改良MS培养基与NAA、6BA、马铃薯、酸水解酪蛋白、蔗糖混合，然后按照7g/L的用量投入琼脂；

步骤七，将上述混合物分装在组培瓶高压消毒120分钟即可使用。