CN116445539A - 旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用 - Google Patents
旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用 Download PDFInfo
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Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明适用于蛋白质生物技术领域，提供了旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，所述的转基因植物生物反应器中的应用是通过培育一种表达旋毛虫抗原的大豆植株来实现的。通过提供一种有效表达旋毛虫抗原的大豆植株来实现旋毛虫抗原在转基因植物生物反应器的应用，为开发安全、廉价的动物或人用蛋白提供了一种新的策略具有非常广阔的应用前景和机会。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质生物技术领域，尤其涉及旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用。
背景技术
旋毛虫引起的旋毛虫病是一种重要的人兽共患寄生虫病，其可感染150多种食肉动物和杂食动物，人主要因为生食或半生食含有旋毛虫肌幼虫的肉及肉类产品而感染。旋毛虫病不仅威胁人类公共健康，而且也给动物养殖业和食品安全带来严重的问题。此外，近些年出现了寄生虫对传统的抗蠕虫药的耐药现象，这也迫使尽快研发新的措施来控制这种传染病，开发有效的疫苗是阻止家养动物和人类感染此病的有效措施。
转基因植物生物反应器是指通过基因工程技术、利用植物细胞、组织或整株植物来生产疫苗、抗体等医用蛋白及其它生物制剂的生产体系。利用植物作为生物反应器生产医用蛋白产物、诊断试剂或功能食品在生物制药领域中受到广泛的关注，已成为当今医学和生命科学研究领域的热点。转基因植物作为生物反应器生产病原体抗原有许多优点。首先，该系统生产成本低，疫苗生产简单，易于大规模生产，便于冷藏运输。其次，植物表达系统在表达外源蛋白的折叠和组装上跟动物更为相似，从而具有与动物细胞表达产物相似的生物活性和免疫原性。第三这种蛋白加工方式仅仅是利用了土壤、空气和水，可以说是符合绿色、安全环保等特点，在社会节能减排的背景下更加具有优势。第四，植物对胃肠道的酶消化具有抗性，口服给药方法简单。因此转基因植物为开发安全、廉价的动物或人用蛋白提供了一种新的策略具有非常广阔的应用前景和机会。
同时，现有技术中针对旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备转基因植物生物反应器中的相关研究尚且不足，缺少相关的研究，无法有效的实现相关的应用。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
本发明实施例是这样实现的，旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，所述的转基因植物生物反应器中的应用是通过培育一种表达旋毛虫抗原的大豆植株来实现的。
进一步的技术方案，所述的表达旋毛虫抗原的大豆植株的培育方法包括以下步骤：
步骤1、目的基因的克隆：
根据NCBI上旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（Ts-SPI）基因序列信息，按照植物密码子偏爱性人工合成基因，同时根据植物双元表达载体多克隆位点分子特征，分别在Ts-SPI基因上游引入内切酶HidIII酶切位点，下游引入内切酶SacI酶切位点。把Ts-SPI基因片段进行HidIII和SacI酶切后连接到pTF101-35s载体上，形成pTF101-35s- Ts-SPI，具体引物序列如下：
pTF101-35s Ts-SPI F：
GCAGA ACAGCAAGCTTATGTTATCGGTAATATTTTCTGCAG，
pTF101-35sTS-SPI R：
GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACCAATACGGATACAGCTGCTGA，
下划线为酶切位点。
同时针对Ts-SPI基因的编码区，设计PCR分子检测扩增特异性引物如下：
TS-SPI-F:5 '- ATGTTATCGGTAATATTTTCTG -3 '；
TS-SPI:5 '- TTACCAATACGGATACAGCTGC -3'。
以人工合成的Ts-SPI基因为模板，以pTF101-35S-Ts-SPI F和R为引物，通过PCR扩增得到含有载体接头序列和Ts-SPI基因全长PCR片段852bp，然后通过同源重组的方法克隆到pTF101-35s载体中，构建好的质粒经过测序，验证正确的植物表达载体转入农杆菌EHA101中，用于下一步大豆遗传转化。
步骤2、农杆菌的转化：采用冻融法将质粒pTF101-35s- TS-SPI 转化至农杆菌EHA101感受态细胞中；
步骤3、农杆菌介导的大豆遗传转化：以农杆菌株EHA101为工程菌株，将pTF101-35s-Ts-SPI通过大豆子叶节方法转入受体大豆品种Williams82中；
步骤4、bar 试纸条检测：
取少量嫩绿叶子(约小指甲大小)放入1.5 mL 的离心管中，加入200μL提取缓冲液，用研磨棒捣碎混匀，将试纸条按箭头方向插入混合液中，静止5min后观察结果；若试纸条出现 2 条带表明该植株是 bar阳性植株，若出现 1 条带说明是bar阴性植株，如果没有条带说明操作有误或提取缓冲液不对；
步骤5、转基因植株的草丁膦抗性检测：
转化载体中以草丁膦作为筛选标记，因此后代采用草丁膦涂抹叶片的方法快速检测转基因苗。具体方法为：用棉签蘸取适量草丁膦( 135 mg·L-1) 溶液， 轻柔擦拭半片叶子，并做好标记，同叶未涂抹的叶子作为对照，在正常光照情况下 3～6d 后观察叶片生长情况。
步骤6、转基因植株的PCR检测，利用Ts-SPI基因引物对T0代转化植株基因组DNA进行PCR扩增检测。使用CTAB法提取转化植株及对照Willimas82的DNA，PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果利用凝胶成像系统进行拍照和分析；
步骤7、外源目的基因Western Blot检测：
对PCR 检测呈强阳性的转基因植株，利用植物总蛋白提取试剂盒(Solarbio，BC3720)提取大豆未成熟种子中的蛋白，将变性后的蛋白样品，采用分离胶为12%、浓缩胶为5％进行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后，将分离胶按照常规操作进行湿转，将蛋白转印至PVDF膜上，湿转结束后，将PVDF膜置于封闭液（5%脱脂奶粉PBST溶液）中4℃封闭过夜，之后进行一抗孵育，一抗为小鼠抗重组的Ts-SPI 多抗血清，将该血清使用封闭液体1：200稀释，用稀释后的血清覆盖封闭后的PVDF膜，室温孵育1小时，之后用PBST洗涤PVDF膜3次，5min/次，继续孵育二抗，二抗为经封闭液5000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG的抗体，二抗室温箱孵育1小时，之后经PBST洗涤后，进行ECL化学发光显影，用显影仪器采集图片。
进一步的技术方案，所述步骤2的具体操作步骤为：
步骤2.1、用冰盒取-80℃冰箱冻存的pTF101-35s感受态细胞，冰浴 10min；
步骤2.2、将1µg提取的纯化质粒pTF101-35s- Ts-SPI 加入 200µl 农杆菌感受细胞中，混匀；
步骤2.3、冰浴5-10min，转入液氮冷冻3-5min，迅速置于37℃水浴中热激5min；
步骤2.4、加入500µl 28℃预热的 YEP 液体培养基，28℃，200rpm 震荡培养3-4h；
步骤2.5、取 200µl 菌液涂布于 YEP 固体选择培养基表面（卡那霉素50mg/L+壮观霉素 50mg/L），均匀涂布于整个平板，静止30min，使充分吸收，倒置平板，28℃培养2-3d，观察结果；
步骤2.6、待培养基上长出单菌落，挑取单菌落接种于5m L 含有卡那霉素 50mg/L+壮观霉素50mg/L双抗性的YEP液体培养中，28℃，160rpm 振荡培养 12～16h。
步骤2.7、转化农杆菌 EHA101 的 PCR 鉴定：以上述菌液为模板，进行 PCR 鉴定。
步骤2.8、保留鉴定结果为阳性的菌液，菌液与甘油按照体积比为 7:3 混合，加入灭菌的2m L 离心管中，-80℃保存，备用。
进一步的技术方案，在所述步骤2.7中，PCR 反应采用 20μL 体系，根据Ts-SPI2基因序列设计引物，
上游引物 Ts-SPI-F： 5’ atgttatcggtaatattttctg -3’；
下游引物 TS-SPI-R： 5’ ttaccaatacggatacagctgc -3’。
菌液 PCR 的组分及用量 ：
组分 体积
2×Power Taq PCR Master Mix 10μL
TS-SPI2-F（10µM） 1μL
TS-SPI2-R（10µM） 1μL
模板 1μL
dd H2O 补足至 20μL；
反应程序为：94 ℃预变性1 min，95 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60s，循环30次，72 ℃后延伸10 min，4 ℃保温，PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
进一步的技术方案，在所述步骤2中，YEP 液体培养基（p H7.0）的制备步骤具体为：用电子天平精确称取胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，氯化钠5g，混合置于1L 烧杯中，加入约800m L去离子水，溶解，用1MNaOH调节pH值至7.0，容量瓶中定容至1000m L，高温高压灭菌，4℃保存，备用。
进一步的技术方案，在所述步骤2中，YEP固体培养基（p H7.0）的制备步骤具体为：用电子天平精确称取胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，氯化钠5g，琼脂16g，混合置于1L烧杯中，加入约800m L 去离子水，溶解，用1M NaOH调节pH值至7.0，容量瓶中定容至1000m L，高温高压灭菌后，于超净工作台中分装，冷却凝固后，4℃保存，备用。
进一步的技术方案，农杆菌介导大豆子叶节转化法包括以下步骤：
步骤3.1、农杆菌菌液制备：将含有pTF101-35s-Ts-SPI质粒的农杆菌28℃培养16h后收集菌体，转入YEP液体培养基中（peptone 10g/L，yeast extract10g/L，NaCl 5g/L，PH7.0）直至OD600值0 .5～0 .7备用；
步骤3.2、受体准备：选取大豆受体品种Williams82成熟无破损的种子，氯气灭菌16h，灭菌后种子放入GM萌发培养基，培养基配方参照(Olhoft et al., 2003，MS+0.8%琼脂+5-10%蔗糖 )弱光萌发16h，获得萌发的大豆种子；
步骤3.3、外植体的准备和侵染，采用子叶节法进行农杆菌的侵染转化：切子叶节，从胚轴处将大豆种子一分为二，切时刀尖蘸工程菌液，用手术刀轻刮下胚轴，制造小创口，将切开后的子叶节放入步骤3.1制备好的农杆菌菌液中，轻柔晃动30min，转入共培养基（继代培养基+AS(100µmol/L)中，避光培养(23℃，3～5d)；
步骤3.4、共培养后，将伸长的胚轴切去约3/4，保留约5mm的胚轴，插入加筛选剂的分生培养基（SIM）中诱导丛生芽生长，培养条件25℃，光照16h· d-1，光照强度2000lx；
步骤3.5、在SIM培养基中培养7d后，转入SEM筛选培养基中，间隔15d继代1次，筛选3～4轮，得到分生苗；
步骤3.6、将已经伸长的分生苗从外置体上切下，转入生根培养基中生根，生根 10d 左右，得到转化苗；
步骤3.7、生根健全的转化苗，经炼苗(3～5d)后移入盆中栽培，生根 10 d 左右，温室正常管理。
进一步的技术方案，在所述步骤6中，PCR反应体系( 20μL)为：DNA模板50 ng，10×buffer 2. 0μL，2. 5 mmol·L-1dNTP 1μL，10 μmol·L-1引物各 0. 5 μL，5 U·μL-1Taq 酶0. 5μL，加ddH2O补至20 μL；PCR 反应程序: 95℃ ，变性5 min，94℃ ，变性30 s，56℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸5 min。
进一步的技术方案，所述步骤7中的湿转条件为：4℃，70v恒压，2小时。
本发明实施例提供的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，通过提供一种有效表达旋毛虫抗原的大豆植株来实现旋毛虫抗原在转基因植物生物反应器的应用，为开发安全、廉价的动物或人用蛋白提供了一种新的策略具有有非常广阔的应用前景和机会。
附图说明
图1为SPI2基因质粒载体图谱；
图2为T0 代转化植株的 PCR 法鉴定转基因苗；
图3为外源基因旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂SPI2基因在大豆中表达Western检测结果；
图4为旋毛虫攻击感染后回收肌幼虫虫荷数；
图5为转Ts-SPI基因大豆免疫抗体水平的变化。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，所述的转基因植物生物反应器中的应用是通过培育一种表达旋毛虫抗原的大豆植株来实现的。
所述的表达旋毛虫抗原的大豆植株的培育方法包括以下步骤：
步骤1、目的基因的克隆：
根据NCBI上旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂（Ts-SPI）基因 (GenBank登录号XM_003379851)序列信息，按照植物密码子偏爱性人工合成基因。同时根据植物双元表达载体多克隆位点分子特征，分别在Ts-SPI基因上游引入内切酶SpeI酶切位点，下游引入内切酶SacI酶切位点。把Ts-SPI基因片段进行SpeI和SacI酶切后连接到pTF101-35s载体上，形成pTF101-35s- Ts-SPI。
利用Premier 5.0 软件设计具体引物序列如下：
pTF101-35s Ts-SPI F：
GCAGA ACAGCACTAGTATGTTATCGGTAATATTTTCTGCAG，
pTF101-35sTS-SPI R：
GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACCAATACGGATACAGCTGCTGA，
下划线为酶切位点。
同时针对Ts-SPI基因的编码区，设计PCR分子检测扩增特异性引物如下：
TS-SPI-F:5 '- ATGTTATCGGTAATATTTTCTG -3 '；
TS-SPI:5 '- TTACCAATACGGATACAGCTGC -3'。
以人工合成的TS-SPI基因为模板，以pTF101-35S-Ts-SPI F和R为引物，通过PCR扩增得到含有载体接头序列和Ts-SPI基因全长PCR片段852bp，然后通过同源重组的方法克隆到pTF101-35s载体中(图1)，构建好的质粒经过测序，验证正确的植物表达载体转入农杆菌EHA101中，用于下一步大豆遗传转化。
步骤2、农杆菌的转化：
采用冻融法将质粒pTF101-35s- TS-SPI 转化至农杆菌 EHA101感受态细胞中，具体操作步骤为：
步骤2.1、用冰盒取-80℃冰箱冻存的pTF101-35s感受态细胞，冰浴 10min（化开即可）。
步骤2.2、将1µg提取的纯化质粒pTF101-35s- Ts-SPI 加入 200µl 农杆菌感受细胞中，混匀。
步骤2.3、冰浴 5-10min，转入液氮冷冻 3-5min，迅速置于37℃水浴中热激5min。
步骤2.4、加入500µl 28℃预热的 YEP 液体培养基，28℃，200rpm 震荡培养3-4h。
步骤2.5、取 200µl 菌液涂布于 YEP 固体选择培养基表面（卡那霉素 50mg/L+壮观霉素 50mg/L），均匀涂布于整个平板，静止 30min，使充分吸收。倒置平板，28℃培养 2-3d，观察结果。
步骤2.6、待培养基上长出单菌落，挑取单菌落接种于 5m L 含有卡那霉素 50mg/L+壮观霉素50mg/L双抗性的 YEP液体培养中，28℃，160rpm 振荡培养 12～16h。
步骤2.7、转化农杆菌 EHA101 的 PCR 鉴定：以上述菌液为模板，进行 PCR 鉴定。PCR 反应采用 20μL 体系，根据Ts-SPI2 基因序列设计引物，
上游引物 Ts-SPI-F： 5’ atgttatcggtaatattttctg -3’；
下游引物 TS-SPI-R： 5’ ttaccaatacggatacagctgc -3’。
菌液 PCR 的组分及用量 ：
组分 体积
2×Power Taq PCR Master Mix 10μL
TS-SPI2-F（10µM） 1μL
TS-SPI2-R（10µM） 1μL
模板 1μL
dd H2O 补足至 20μL；
反应程序为：94 ℃预变性 1 min，95 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，循环 30 次，72 ℃后延伸 10 min，4 ℃保温。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
步骤2.8、保留鉴定结果为阳性的菌液，菌液与甘油按照体积比为 7:3 混合，加入灭菌的2m L 离心管中，-80℃保存，备用。
在所述步骤2中，YEP 液体培养基（p H7.0）的制备步骤具体为：用电子天平精确称取胰蛋白胨 10g，酵母提取物 10g，氯化钠 5g，混合置于 1L 烧杯中，加入约 800m L 去离子水，溶解，用 1M Na OH 调节 p H 值至 7.0，容量瓶中定容至 1000m L。高温高压灭菌，4℃保存，备用。
YEP 固体培养基（p H7.0）的制备步骤具体为：用电子天平精确称取胰蛋白胨10g，酵母提取物 10g，氯化钠 5g，琼脂 16g，混合置于 1L 烧杯中，加入约 800m L 去离子水，溶解，用 1M Na OH 调节 p H 值至 7.0，容量瓶中定容至 1000m L。高温高压灭菌后，于超净工作台中分装，冷却凝固后，4℃保存，备用。
步骤3、农杆菌介导的大豆遗传转化：
以农杆菌株EHA101为工程菌株，将pTF101-35s-Ts-SPI通过大豆子叶节方法转入受体大豆品种Williams82中。农杆菌介导大豆子叶节转化法包括以下步骤：
步骤3.1、农杆菌菌液制备：将含有pTF101-35s-Ts-SPI质粒的农杆菌28℃培养16h后收集菌体，转入YEP液体培养基中（peptone 10g/L，yeast extract10g/L，NaCl 5g/L，PH7.0）直至OD600值0 .5～0 .7备用。
步骤3.2、受体准备：选取大豆受体品种Williams82成熟无破损的种子，氯气灭菌16h。灭菌后种子放入GM萌发培养基，培养基配方参照(Olhoft et al., 2003，MS+0.8%琼脂+5-10%蔗糖 )弱光萌发16h，获得萌发的大豆种子。
步骤3.3、外植体的准备和侵染，采用子叶节法进行农杆菌的侵染转化：切子叶节，从胚轴处将大豆种子一分为二，切时刀尖蘸工程菌液，用手术刀轻刮下胚轴，制造小创口。将切开后的子叶节放入步骤3.1制备好的农杆菌菌液中，轻柔晃动30min，转入共培养基（继代培养基+AS(100µmol/L)中，避光培养(23℃，3～5d)。
步骤3.4、共培养后，将伸长的胚轴切去约3/4，保留约5mm的胚轴，插入加筛选剂的分生培养基（SIM）中诱导丛生芽生长，培养条件25℃，光照16h· d-1，光照强度2000lx。
步骤3.5、在SIM培养基中培养7d后，转入SEM筛选培养基中，间隔15d继代1次，筛选3～4轮，得到分生苗。
步骤3.6、将已经伸长的分生苗从外置体上切下，转入生根培养基中生根，生根 10d 左右，得到转化苗。
步骤3.7、生根健全的转化苗，经炼苗(3～5d)后移入盆中栽培，生根 10 d 左右，温室正常管理。
步骤4、bar 试纸条检测：
取少量嫩绿叶子(约小指甲大小)放入1.5 mL 的离心管中，加入200μL提取缓冲液，用研磨棒捣碎混匀，将试纸条按箭头方向插入混合液中，静止5min后观察结果。若试纸条出现 2 条带表明该植株是 bar阳性植株，若出现 1 条带说明是bar阴性植株，如果没有条带说明操作有误或提取缓冲液不对。
步骤5、转基因植株的草丁膦抗性检测：
转化载体中以草丁膦作为筛选标记，因此后代采用草丁膦涂抹叶片的方法快速检测转基因苗。具体方法为：用棉签蘸取适量草丁膦( 135 mg·L-1) 溶液， 轻柔擦拭半片叶子，并做好标记，同叶未涂抹的叶子作为对照，在正常光照情况下 3～6d 后观察叶片生长情况。
步骤6、转基因植株的PCR检测，利用Ts-SPI基因引物对T0代转化植株基因组DNA进行PCR扩增检测。使用CTAB法提取转化植株及对照Willimas82的DNA。PCR反应体系( 20μL) ：DNA模板50 ng，10×buffer 2. 0μL，2. 5 mmol·L-1dNTP 1μL，10 μmol·L-1引物各 0. 5μL，5 U·μL-1Taq 酶 0. 5μL， 加ddH2O补至20 μL。PCR 反应程序: 95℃ ，变性5 min，94℃，变性30 s，56℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸5 min。PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果利用凝胶成像系统进行拍照和分析。
步骤7、外源目的基因Western Blot检测：
对PCR 检测呈强阳性的转基因植株，利用植物总蛋白提取试剂盒(Solarbio，BC3720)提取大豆未成熟种子中的蛋白。将变性后的蛋白样品，采用分离胶为12%、浓缩胶为5％进行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后，将分离胶按照常规操作进行湿转，将蛋白转印至PVDF膜上。湿转条件为：4℃，70v恒压，2小时。湿转结束后，将PVDF膜置于封闭液（5%脱脂奶粉PBST溶液）中4℃封闭过夜。之后进行一抗孵育，一抗为小鼠抗重组的Ts-SPI多抗血清，将该血清使用封闭液体1：200稀释，用稀释后的血清覆盖封闭后的PVDF膜，室温孵育1小时。之后用PBST洗涤PVDF膜3次，5min/次，继续孵育二抗，二抗为经封闭液5000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG的抗体。二抗室温箱孵育1小时，之后经PBST洗涤后，进行ECL化学发光显影，用显影仪器采集图片。
实施例二：在完成上述步骤1-7的操作后，针对Ts-SPI转基因大豆的免疫保护性进行检测。
1.Ts-SPI转基因大豆的免疫程序及攻虫实验：
取 6 周龄 BALB/c 小鼠18只，随机分为3 组，每组 6只，分别为 PBS 组、野生型大豆蛋白免疫组和转Ts-SPI基因大豆蛋白免疫组，口服免疫，共进行四次免疫接种，间隔1周, 口服剂量 100 mg 大豆粉。 大豆粉被重悬于500μL 的水。第四次免疫一周后每只小鼠灌胃肌幼虫300条，攻虫后35天后，脱颈处死小鼠，解剖小鼠，去除内脏和皮毛，称取胴体的质量并记录编号，之后用绞肉机搅碎小鼠胴体，采用胃蛋白酶消化法收集小鼠体内的肌幼虫。具体方法为：用37℃预热的蒸馏水配置含1%胃蛋白酶1%HCL的消化液，每只小鼠的胴体搅碎后加入300mL消化液，置于37℃温箱磁力搅拌器上，搅拌消化2小时。消化结束后，取出消化溶液，用80目筛子滤去骨头及残渣，将滤液收集到新的烧杯中，用少量蒸馏水冲洗筛网，合并冲洗液于滤液中，将滤液室温放置1小时，用以确保肌幼虫自然沉淀完全，之后用无菌注射器小心吸取上层液体，仅留约50mL滤液，再加入200mL蒸馏水按上述方法重复洗涤、沉淀虫体一次，之后留50mL虫体混悬液，转移至100mL小烧杯中，在显微镜下目测计数肌幼虫数目。最后根据从每只小鼠中收集的肌幼虫数目和相应的胴体重，计算每只小鼠每克肌肉中肌幼虫的数量（LPG），计算各组的平均LPG，之后将各组LPG与PBS组相比，计算其他各组的减虫率。各组小鼠在免疫接种前及攻虫感染前，分别采集小鼠尾静脉血，4℃静置过夜，次日室温离心（3000rpm，10分钟）收集血清，−20℃保存，用于后续各项指标检测。
2. 抗体水平检测
采用间接ELISA方法（酶联免疫吸附实验）检测各组小鼠血清中IgG和IgG 亚型(IgG1和IgG2a)的水平。所有样品做三次重复检测。实验方法如下：
（1）抗原包被：
以上各抗体指标检测抗原包被浓度均采用5μg/mL，即使用包被液将重组蛋白rTs-SPI浓度稀释为5μg/mL，每孔加100μL，4℃包被过夜。使用前将包被抗原弃掉，用PBST洗涤ELISA板5次，每次3分钟。
（2）待检血清的稀释及孵育：
检测以上各抗体指标时均使用封闭液（5%脱脂奶粉PBST溶液）将待检血清稀释100倍，每孔加入100μL，37℃温箱孵育2小时，进行相应抗体指标检测。对于IgG抗体效价的检测,每支血清样品取按照10倍比稀释至最大稀释倍数100万倍，每个稀释倍数取100μL加入每孔中。
（3）检测抗体(二抗)的稀释及孵育：
弃掉板孔中的血清，按照上述方法洗涤板孔，之后每孔加入100μL检测抗体。小鼠血清中IgG检测抗体为羊抗鼠IgG HRP偶联二抗，1：5000倍稀释；小鼠血清IgG1和IgG2a的检测抗体均为HRP标记的羊源二抗，稀释倍数均为500倍。所有二抗均采用37℃温箱1小时孵育条件。
（4）显色反应：
二抗孵育结束后，弃掉二抗，洗涤孔板，之后每孔加入100μL TMB底物液，室温避光静置10分钟，之后每孔加入100μL 2N H2SO4终止反应，使用酶标仪，读取OD450吸光值，并记录数据。
3.结果分析：
（1）大豆转目的基因Ts-SPI阳性材料的获得：
选择带有目的基因Tsp-SP的农杆菌菌株EHA101，利用根癌农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法，对大豆受体品种Williams进行遗传转化，共切取420个大豆外植体，经过继代筛选，生根成苗，最终得到 T0 代转基因再生植株31株，其中经bar试纸条检测呈阳性为23株，转化率为5.4％(阳性苗/诱导的外植体)。初步检测呈阳性的再生植株移栽后，利用草丁膦涂抹叶片的方法快速检测，其中不抗除草剂的叶片明显变黄干枯，阳性植株叶片正常。检测23株转基因植株中，得到20株抗草丁膦的转化苗，通过 PCR 检测目的基因Ts-SPI，检测出12株呈阳性的T0 代转基因植株(图2，M: DNA Marker；“ +”阳性对照；“ -”阴性对照；1-20依次为SPI2转基因后代材料)。
（2）Western检测结果：
对PCR 检测呈强阳性的转基因植株T1代材料进行了外源蛋白表达情况检测，结果发现来源于旋毛虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Ts-SPI能够在转基因株系中能够正常表达(图3，M: Marker；1-9依次为SPI2转基因后代材料；10非转基因大豆)。
（3）减虫率：
不同处理组小鼠攻虫35天后，处死小鼠，收集肌幼虫并计算减虫率，通过计算各实验组平均LPG，以PBS组作为对照计算个组的减虫率，即减虫率=（PBS组LPG-阳性豆粉疫苗组LPG）/ PBS组LPG×100%。结果如图4, 与PBS 组相比，转Ts-SPI基因大豆蛋白免疫组的减虫率为57.3%。结果表明，口服转 Ts-SPI基因大豆，可以诱导保护性免疫反应，以部分保护小鼠免于旋毛虫感染。
（4）抗体滴度及亚型分析：
在最后一次免疫后一周进行尾静脉采血，检测小鼠血清特异性的抗体效价。结果如图 5A 所示，转Ts-SPI基因大豆蛋白免疫组血清抗体滴度明显高于非转基因大豆组及PBS 组，存在显著差异（p<0.05）。小鼠口服免疫实验结果说明转基因大豆所表达的Ts-SPI蛋白具有较好的免疫原性，能有效引起小鼠的免疫系统产生相应的免疫应答。进一步血清IgG亚型分析，结果显示（图5B 和 C），转Ts-SPI基因大豆蛋白免疫组小鼠与非转基因大豆组及 PBS 组小鼠相比抗Ts-SPI特异性IgG1和IgG2a水平均显著升高（P<0.001）。免疫小鼠均可诱导机体产生混合型IgG1/IgG2a（Th1/Th2）反应，并以IgG1（Th2）为主。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，所述的转基因植物生物反应器中的应用是通过培育一种表达旋毛虫抗原的大豆植株来实现的。
2.根据权利要求1所述的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，所述的表达旋毛虫抗原的大豆植株的培育方法包括以下步骤：
步骤1、目的基因的克隆：
根据NCBI上旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因序列信息，登录号：XM_003379851， 按照植物密码子偏爱性人工合成基因，分别在Ts-SPI基因上游引入内切酶HidIII酶切位点，下游引入内切酶SacI酶切位点；把Ts-SPI基因片段进行HidIII和SacI酶切后连接到pTF101-35s载体上，形成pTF101-35s- Ts-SPI，具体引物序列如下：
pTF101-35s Ts-SPI F：
GCAGA ACAGC AAGCTTATGTTATCGGTAATATTTTCTGCAG，
pTF101-35sTS-SPI R：
GATCGGGGAAATTCGAGCTCTTACCAATACGGATACAGCTGCTGA，
下划线为酶切位点；
同时针对Ts-SPI基因的编码区，设计PCR分子检测扩增特异性引物如下：
TS-SPI-F:5 '- ATGTTATCGGTAATATTTTCTG -3 '；
TS-SPI:5 '- TTACCAATACGGATACAGCTGC -3'；
以人工合成的Ts-SPI基因为模板，以pTF101-35S-Ts-SPI F和R为引物，通过PCR扩增得到含有载体接头序列和Ts-SPI基因全长PCR片段852bp，然后通过同源重组的方法克隆到pTF101-35s载体中，构建好的质粒经过测序，验证正确的植物表达载体转入农杆菌EHA101中，用于下一步大豆遗传转化；
步骤2、农杆菌的转化：采用冻融法将质粒pTF101-35s- TS-SPI 转化至农杆菌 EHA101感受态细胞中；
步骤3、农杆菌介导的大豆遗传转化：以农杆菌株EHA101为工程菌株，将pTF101-35s-Ts-SPI通过大豆子叶节方法转入受体大豆品种Williams82中；
步骤4、bar 试纸条检测：
取嫩叶放入1.5 mL 的离心管中，加入200μL提取缓冲液，用研磨棒捣碎混匀，将试纸条按箭头方向插入混合液中，静止5min后观察结果；若试纸条出现 2 条带表明该植株是 bar阳性植株，若出现 1 条带说明是bar阴性植株，如果没有条带说明操作有误或提取缓冲液不对；
步骤5、转基因植株的草丁膦抗性检测：
转化载体中以草丁膦作为筛选标记，因此后代采用草丁膦涂抹叶片的方法快速检测转基因苗；
步骤6、转基因植株的PCR检测，利用Ts-SPI基因引物对T0代转化植株基因组DNA进行PCR扩增检测；使用CTAB法提取转化植株及对照Willimas82的DNA，PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，电泳结果利用凝胶成像系统进行拍照和分析；
步骤7、外源目的基因Western Blot检测：
对PCR 检测呈强阳性的转基因植株，提取大豆未成熟种子中的蛋白，将变性后的蛋白样品，采用分离胶为12%、浓缩胶为5％进行SDS-PAGE凝胶电泳；电泳结束后，将分离胶按照常规操作进行湿转，将蛋白转印至PVDF膜上，湿转结束后，将PVDF膜置于封闭液中4℃封闭过夜，之后进行一抗孵育，一抗为小鼠抗重组的Ts-SPI 多抗血清，将该血清使用封闭液体1：200稀释，用稀释后的血清覆盖封闭后的PVDF膜，室温孵育1小时，之后用PBST洗涤PVDF膜3次，5min/次，继续孵育二抗，二抗为经封闭液5000倍稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG的抗体，二抗室温箱孵育1小时，之后经PBST洗涤后，进行ECL化学发光显影，用显影仪器采集图片。
3.根据权利要求2所述的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，所述步骤2的具体操作步骤为：
步骤2.1、用冰盒取-80℃冰箱冻存的pTF101-35s感受态细胞，冰浴 10min；
步骤2.2、将1µg提取的纯化质粒pTF101-35s- Ts-SPI 加入 200µl 农杆菌感受细胞中，混匀；
步骤2.3、冰浴5-10min，转入液氮冷冻3-5min，迅速置于37℃水浴中热激5min；
步骤2.4、加入500µl 28℃预热的 YEP 液体培养基，28℃，200rpm 震荡培养3-4h；
步骤2.5、取 200µl 菌液涂布于 YEP 固体选择培养基表面，均匀涂布于整个平板，静止30min，倒置平板，28℃培养2-3d，观察结果；
步骤2.6、待培养基上长出单菌落，挑取单菌落接种于5m L 含有卡那霉素 50mg/L+壮观霉素50mg/L双抗性的YEP液体培养中，28℃，160rpm 振荡培养 12～16h；
步骤2.7、转化农杆菌EHA101的PCR鉴定：以上述菌液为模板，进行 PCR 鉴定；
步骤2.8、保留鉴定结果为阳性的菌液，菌液与甘油按照体积比为 7:3 混合，加入灭菌的2m L 离心管中，-80℃保存，备用。
4.根据权利要求3所述的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，在所述步骤2.7中，PCR 反应采用 20μL 体系，根据Ts-SPI2 基因序列设计引物，
上游引物 Ts-SPI-F： 5’ atgttatcggtaatattttctg -3’；
下游引物 TS-SPI-R： 5’ ttaccaatacggatacagctgc -3’；
菌液 PCR 的组分及用量 ：
组分 体积
2×Power Taq PCR Master Mix 10μL
TS-SPI2-F 1μL
TS-SPI2-R 1μL
模板 1μL
dd H2O 补足至 20μL；
反应程序为：94 ℃预变性1 min，95 ℃变性 30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60s，循环30次，72 ℃后延伸10 min，4 ℃保温，PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。
5.根据权利要求3所述的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，在所述步骤2中，YEP 液体培养基的制备步骤具体为：用电子天平精确称取胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，氯化钠5g，混合置于1L 烧杯中，加入800m L去离子水，溶解，用1M NaOH调pH值至7.0，容量瓶中定容至1000m L，灭菌，4℃保存，备用。
6.根据权利要求3所述的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，在所述步骤2中，YEP固体培养基的制备步骤具体为：用电子天平精确称取胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，氯化钠5g，琼脂16g，混合置于1L烧杯中，加入800m L 去离子水，溶解，用1M NaOH调节pH值至7.0，容量瓶中定容至1000m L，灭菌后，于超净工作台中分装，冷却凝固后，4℃保存，备用。
7.根据权利要求2所述的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，所述步骤3中的农杆菌介导大豆子叶节转化法包括以下步骤：
步骤3.1、农杆菌菌液制备：将含有pTF101-35s-Ts-SPI质粒的农杆菌28℃培养16h后收集菌体，转入YEP液体培养基中直至OD600值0 .5～0 .7备用；
步骤3.2、受体准备：选取大豆受体品种Williams82成熟无破损的种子，氯气灭菌16h，灭菌后种子放入GM萌发培养基弱光萌发16h，获得萌发的大豆种子；
步骤3.3、外植体的准备和侵染，采用子叶节法进行农杆菌的侵染转化：切子叶节，从胚轴处将大豆种子一分为二，切时刀尖蘸工程菌液，用手术刀刮下胚轴，制造创口，将切开后的子叶节放入步骤3.1制备好的农杆菌菌液中，晃动30min，转入共培养基中，23℃避光培养3～5d；
步骤3.4、共培养后，将伸长的胚轴切去3/4，保留5mm的胚轴，插入加筛选剂的分生培养基中诱导丛生芽生长，培养条件25℃，光照16h· d-1，光照强度2000lx；
步骤3.5、在SIM培养基中培养7d后，转入SEM筛选培养基中，间隔15d继代1次，筛选3～4轮，得到分生苗；
步骤3.6、将已经伸长的分生苗从外置体上切下，转入生根培养基中生根，生根10 d，得到转化苗；
步骤3.7、生根健全的转化苗，经3～5d炼苗后移入盆中栽培，生根10 d，温室正常管理。
8.根据权利要求2所述的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，在所述步骤6中，20μL 的PCR反应体系为：DNA模板50 ng，10×buffer 2. 0μL，2. 5 mmol·L-1 dNTP 1μL，10 μmol·L-1 引物各 0. 5 μL，5 U·μL-1Taq 酶 0. 5μL，加ddH2O补至20 μL；PCR 反应程序: 95℃ ，变性5 min，94℃ ，变性30 s，56℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72℃延伸5 min。
9.根据权利要求2所述的旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制剂在转基因植物生物反应器中的应用，其特征在于，所述步骤7中的湿转条件为：4℃，70v恒压，2小时。
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Non-Patent Citations (1)
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| J. XU 等: "Effect of two recombinant Trichinella spiralis serine protease inhibitors on TNBS-induced experimental colitis of mice", CLINICAL AND EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, vol. 194, pages 400 - 413 * |
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