CN116445334A - 一种伯克霍尔德菌d6、微生物制剂及其应用 - Google Patents

一种伯克霍尔德菌d6、微生物制剂及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116445334A
CN116445334A CN202310252590.6A CN202310252590A CN116445334A CN 116445334 A CN116445334 A CN 116445334A CN 202310252590 A CN202310252590 A CN 202310252590A CN 116445334 A CN116445334 A CN 116445334A
Authority
CN
China
Prior art keywords
burkholderia
fermentation
aflatoxin
bioactive peptide
culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310252590.6A
Other languages
English (en)
Inventor
杨趁仙
陈毅保
刘昆仑
段晓杰
布冠好
辛颖
李天赐
易智伟
王建
侯春艳
王怡雯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan University of Technology
Yihai Kerry Qingdao Food Innovation Center Co Ltd
Original Assignee
Henan University of Technology
Yihai Kerry Qingdao Food Innovation Center Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan University of Technology, Yihai Kerry Qingdao Food Innovation Center Co Ltd filed Critical Henan University of Technology
Publication of CN116445334A publication Critical patent/CN116445334A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L5/00—Preparation or treatment of foods or foodstuffs, in general; Food or foodstuffs obtained thereby; Materials therefor
    • A23L5/20—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification
    • A23L5/28—Removal of unwanted matter, e.g. deodorisation or detoxification using microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/80—Food processing, e.g. use of renewable energies or variable speed drives in handling, conveying or stacking
    • Y02P60/87—Re-use of by-products of food processing for fodder production

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Water Supply & Treatment (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种伯克霍尔德菌D6、微生物制剂及其应用，包括保藏编号为CCTCC M20221126的伯克霍尔德菌D6；含有伯克霍尔德菌D6的微生物制剂；伯克霍尔德菌D6或微生物制剂在制备抗氧化性生物活性肽及制备含抗氧化性活性肽产品中的应用或在降解黄曲霉毒素中的应用。其优点在于，将本发明的伯克霍尔德菌D6及其微生物制剂应用于制备抗氧化性生物活性肽及制备含抗氧化性活性肽产品中，能够有效制备抗氧化性生物活性肽，提高产品的抗氧化活性；同时，本发明的伯克霍尔德菌D6及其微生物制剂能够降解黄曲霉毒素，具有较好的脱毒作用，在粮食、饲料和食品加工中具有很好的应用前景，尤其对油料副产物价值的提升和品质的改善具有较好的应用前景。

Description

一种伯克霍尔德菌D6、微生物制剂及其应用
技术领域
本发明涉及微生物应用技术领域，尤其涉及一种伯克霍尔德菌D6、微生物制剂及其应用。
背景技术
花生粕作为花生制油后的副产品，含有约50％的蛋白，花生蛋白有较高的营养价值，为了提高花生粕蛋白的利用价值，近年来利用花生粕蛋白制取花生多肽备受关注，但花生粕容易感染黄曲霉毒素。
花生肽的生产方式主要有酶解法和发酵法。发酵法不仅可有效的去除黄曲霉毒素，也能将微生物产酶和酶解两步合二为一，省去了酶的分离和提纯步骤，且制备的花生多肽没有苦味，具有发酵的天然芳香味，适口性好。花生粕经微生物发酵后，蛋白质、氨基酸、小肽、水溶性蛋白和总酸含量均显著增加，营养价值明显提升，小肽、水溶性蛋白含量的增加可提高动物的消化利用率；同时，黄曲霉毒素含量下降，提高了产品安全性。
微生物发酵法脱毒和制备抗氧化肽是一种高效、绿色、安全的方法，在粮食、饲料和食品加工中具有很好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种伯克霍尔德菌D6、微生物制剂及其应用，将本发明的伯克霍尔德菌D6及其微生物制剂应用于制备抗氧化性生物活性肽及制备含抗氧化性活性肽产品中，能够有效制备抗氧化性生物活性肽；同时，本发明的伯克霍尔德菌D6及其微生物制剂能够降解黄曲霉毒素，在粮食、饲料和食品加工中具有很好的应用前景。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
第一方面，本发明提供一种伯克霍尔德菌D6，保藏编号为CCTCC M 20221126。
在其中的一些实施例中，所述伯克霍尔德菌D6含有如序列号(ID):1所示的基因序列。
在其中的一些实施例中，所述伯克霍尔德菌D6产生抗氧化性生物活性肽。
第二方面，本发明提供一种微生物制剂，包含如第一方面所述的伯克霍尔德菌D6。
在其中的一些实施例中，还包含如第一方面所述的伯克霍尔德菌D6的发酵液、菌悬液、全培养物、粗提物、胞外代谢物中的至少一种。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的伯克霍尔德菌D6在制备抗氧化性生物活性肽及制备含抗氧化性活性肽产品中的应用。
第四方面，本发明提供一种如第二方面所述的微生物制剂在制备抗氧化性生物活性肽及制备含抗氧化性活性肽产品中的应用。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的伯克霍尔德菌D6在降解黄曲霉毒素中的应用。
第六方面，本发明提供一种如第二方面所述的微生物制剂在降解黄曲霉毒素中的应用。
第七方面，本发明提供一种制备抗氧化性生物活性肽的方法，包括以下步骤：
S01：将如第一方面所述的伯克霍尔德菌D6接种于粮食、饲料或食品中发酵，得到发酵液；
S02：对步骤S01得到的发酵液进行分级超滤提取，得到抗氧化性生物活性肽。
在其中的一些实施例中，在所述步骤S01中：
将如第一方面所述的伯克霍尔德菌D6接种于花生粕中发酵。
在其中的一些实施例中，在所述步骤S01中：
发酵温度为28℃～40℃。
在其中的一些实施例中，在所述步骤S01中：
接菌量为6％～14％。
在其中的一些实施例中，在所述步骤S01中：
料液比为10％～50％。
在其中的一些实施例中，在所述步骤S01中：
发酵时间为12h～60h。
在其中的一些实施例中，在所述步骤S01中：
发酵温度为40℃，接菌量为12％，料液比为30％，发酵时间为24h。
在其中的一些实施例中，在所述步骤S02中：
对所述步骤S01得到的发酵液采用截留分子量为10000Da的超滤管进行超滤，得到滤过液，再将滤过液采用截留分子量为3000Da的超滤管进行超滤，得到分子量在3000Da以下的抗氧化性生物活性肽。
第八方面，本发明提供一种降解黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：
S11：将如权利要求1～3任一所述的伯克霍尔德菌D6接种于LB液体培养基培养，得到种子液，得到的种子液于发酵培养基培养，得到发酵液；
S12：将步骤S11得到的发酵液与含黄曲霉毒素的产品混合培养，降解黄曲霉毒素。
在其中的一些实施例中，具体包括如下步骤：
S11：将如权利要求1～3任一所述的伯克霍尔德菌D6接种于LB液体培养基培养的培养条件为于37℃，160rpm的摇床上过夜培养，得到种子液；
得到的种子液于发酵培养基培养的培养条件为于37℃，160rpm震荡培养2d，得到发酵液；
得到的发酵液中伯克霍尔德菌D6的含量至少为2.8×108cfu/mL。
在其中的一些实施例中，具体包括如下步骤：
S12：将步骤S11得到的发酵液与含黄曲霉毒素的产品混匀后，于37℃，160rpm震荡培养3d。
在其中的一些实施例中，步骤S12中：
所述步骤S12中的含黄曲霉毒素的产品包括含黄曲霉毒素的花生粕。
第九方面，本发明提供一种如第七方面或第八方面的方法制备的花生粕产品。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的一种伯克霍尔德菌D6、微生物制剂及其应用，将本发明的伯克霍尔德菌D6及其微生物制剂应用于制备抗氧化性生物活性肽及制备含抗氧化性活性肽产品中，能够有效制备抗氧化性生物活性肽，提高产品的抗氧化活性；同时，本发明的伯克霍尔德菌D6及其微生物制剂能够降解黄曲霉毒素，具有较好的脱毒作用，在粮食、饲料和食品加工中具有很好的应用前景，尤其对油料副产物价值的提升和品质的改善具有较好的应用前景。
附图说明
图1是根据本发明实施例的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6的菌落形态图(左)及镜检结果图(右)；
图2是根据本发明实施例的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6的系统发育树；
图3a是根据本发明实施例的AFB1降解未接种伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6的对照的液相色谱图；
图3b是根据本发明实施例的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6对AFB1降解后的液相色谱图
图4是根据本发明实施例的接种量对伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6发酵花生粕产物DPPH自由基清除率的影响；
图5是根据本发明实施例的料液比对伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6发酵花生粕产物DPPH自由基清除率的影响；
图6是根据本发明实施例的发酵温度对伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6发酵花生粕产物DPPH自由基清除率的影响；
图7是根据本发明实施例的发酵时间对伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6发酵花生粕产物DPPH自由基清除率的影响；
图8是根据本发明实施例的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6以最佳固态发酵条件发酵花生粕产物DPPH自由基清除效果。
【保藏信息】伯克霍尔德菌D6(Burkholderia sp.D6)，其保藏编号为CCTCC M20221126，保藏日期为2022年7月18日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮政编码430072。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
实施例1
本实施例涉及本发明的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6及伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6的应用。
一种伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6，保藏编号为CCTCC M 20221126。
上述伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6于2022年7月18日在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)登记保藏，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，邮政编码430072。
该保藏编号为CCTCC M 20221126的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6为革兰氏阳性菌，短杆状。菌落表面光滑，不透明，呈淡黄色。
在其中的一些实施例中，伯克霍尔德菌D6含有如序列号(ID):1所示的基因序列。
在其中的一些实施例中，伯克霍尔德菌D6产生抗氧化性生物活性肽。
上述伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6在制备抗氧化性生物活性肽及制备含抗氧化性活性肽产品中的应用。
具体地，伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6能够使粮食、食品或副产物产生抗氧化性生物活性肽，从而使粮食、食品或副产物被伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6处理后得到的产物抗氧化性高。
上述伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6在降解黄曲霉毒素中的应用。
具体地，伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6能够对黄曲霉毒素有效降解，使得含黄曲霉毒素的产品脱毒。
实施例2
本实施例涉及本发明的微生物制剂及其应用。
一种微生物制剂，包含如实施例1所述的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6。
在其中的一些实施例中，还包含如实施例1所述的伯克霍尔德菌Burkholderiasp.D6的发酵液、菌悬液、全培养物、粗提物、胞外代谢物中的至少一种。
上述微生物制剂在制备抗氧化性生物活性肽及制备含抗氧化性活性肽产品中的应用。
上述微生物制剂在降解黄曲霉毒素中的应用。
实施例3
本实施例为本发明制备抗氧化性生物活性肽的方法。
一种制备抗氧化性生物活性肽的方法，包括以下步骤：
S01：将如实施例1所述的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6接种于粮食、食品或副产物中发酵，得到发酵液；
S02：对步骤S01得到的发酵液进行分级超滤提取，得到抗氧化性生物活性肽。
在其中的一些实施例中，步骤S01中：
将如实施例1所述的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6接种于花生粕中发酵，花生粕的用量为10g，于121℃灭菌30min后冷却备用。
在其中的一些实施例中，步骤S01中：
发酵温度为28℃～40℃。
在其中的一些实施例中，步骤S01中：
接菌量为6％～14％。
在其中的一些实施例中，步骤S01中：
料液比为10％～50％。
在其中的一些实施例中，步骤S01中：
发酵时间为12h～60h。
在其中的一些实施例中，步骤S01中：
发酵温度为40℃，接菌量为12％，料液比为30％，发酵时间为24h。
在其中的一些实施例中，步骤S02中：
对步骤S01得到的发酵液采用截留分子量为10000Da的超滤管进行超滤，得到滤过液，再将滤过液采用截留分子量为3000Da的超滤管进行超滤，得到分子量在3000Da以下的小分子抗氧化性生物活性肽和10000-3000Da之间的固态发酵混合物。
上述方法制备的花生粕产品具有较高的抗氧化性。
实施例4
本实施例为本发明的降解黄曲霉毒素的方法。
一种降解黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：
S11：将如实施例1所述的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6接种于LB液体培养基培养，得到种子液，得到的种子液于发酵培养基培养，得到发酵液；
S12：将步骤S11得到的发酵液与含黄曲霉毒素的产品混合培养，降解黄曲霉毒素。
在其中的一些实施例中，步骤S11中：
伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6接种于LB液体培养基培养的培养条件为于37℃，160rpm的摇床上过夜培养，得到种子液；
得到的种子液于发酵培养基培养的培养条件为于37℃，160rpm震荡培养2d，得到发酵液；
得到的发酵液中伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6的含量至少为2.8×108cfu/mL。
在其中的一些实施例中，步骤S12中：
将步骤S11得到的发酵液与含黄曲霉毒素的产品混匀后，于37℃，160rpm震荡培养3d。
在其中的一些实施例中，步骤S12中：
含黄曲霉毒素的产品包括含黄曲霉毒素的花生粕。
对含黄曲霉毒素的花生粕产品应用上述方法后，该花生粕产品能够脱毒。
实施例5
本实施例为本发明的伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6分离、鉴定及应用。
(一)菌株D6的分离、筛选和鉴定
表1培养基配方
1.菌株D6的分离、筛选
取10g河南省舞钢市的花生种植地的土壤加入100mL无菌水中，用玻璃珠打散，37℃震摇2h得到细菌菌悬液，取10％的菌悬液接到营养肉汤培养基(NB)中，37℃下培养得到细菌富集液，营养肉汤培养基(NB)依照上表1进行配置。取10％的细菌富集液接到初筛液体培养基，在37℃，160rpm的摇床上震荡培养5d，初筛液体培养基依照上表1进行配置，灭菌后加入加入浓度为0.041g/mL的香豆素-乙醇溶液，调整其终浓度为1mg/mL。以37℃，130r/min于摇床中培养7d。用无菌PBS稀释细菌培养液(10-2、10-3、10-4、10-5)，分别吸取20μL的稀释液涂布于香豆素初筛平板上，37℃培养5d，选取生长良好的单菌株连续三次划线于香豆素初筛平板上，纯化菌株得到的纯化菌株为菌株D6，香豆素初筛平板依照上表1进行配置。
2.菌株D6的鉴定
(1)对菌株D6进行革兰氏染色并镜检
挑取单菌落划线分离得到纯培养的菌株D6，菌落形态及镜检结果如图1所示，菌株D6为革兰氏阳性菌，短杆状。菌落表面光滑，不透明，呈淡黄色。
(2)16s rDNA鉴定及构建发育树
以1％的添加量吸取冻存的纯培养菌株D6加入到LB液体培养基中，以37℃、150r/min于气浴恒温震荡器中摇瓶培养至OD600为1.0，获得菌株D6的活化培养液，其中，LB液体培养基依照上表1进行配置。
按照天根细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取菌株D6的基因组DNA，采用引物27F和1492R对DNA进行PCR扩增。PCR反应体系(单位以μL计)：灭菌水，19；Mix，25；27F，2；1492R，2；DNA，2；PCR反应条件：95℃，3min；95℃，30s；60℃，30s；72℃，90s；循环数35；72℃，10min。采用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。
将PCR产物送生工生物工程测定16s rDNA序列，采用BLAST在NCBI数据库中进行序列比对，并利用MEGA5.05构建系统发育树，对菌株D6的种属进行分类和鉴定。
菌株D6的序列如说明书核苷酸与氨基酸序列表的内容所示，根据测序结果比对，筛选的菌株D6与Burkholderia territorii strain S2相似度为99.86％；构建系统发育树如图2所示，菌株D6为伯克霍尔德菌属(Burkholderia)。将Burkholderia sp.D6序列上传至Genbank数据库，登录号为ON945598。
(二)伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6对黄曲霉毒素B1(AFB1)的降解效果验证
将(一)中纯化的单菌株接种到(一)中的LB液体培养基，于37℃，160rpm的摇床上过夜培养，得到种子液，吸取种子液到新鲜的LB液体培养基，37℃，160rpm震荡培养2d得到发酵液，发酵液中伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6含量≥2.8×108cfu/mL。
取100μL浓度为1mg/L的黄曲霉毒素B1(AFB1)溶液加入灭菌的10mL离心管中，另加900μL发酵液，混匀，37℃，160rpm震荡培养3d。对照组用900μL无菌发酵培养基与100μLAFB1溶液混合，37℃，160rpm震荡培养3d后，测量AFB1的含量。
AFB1残留量的测定方法：经过72h的降解反应后，向离心管中加入3mL二氯甲烷进行萃取，吸取下层有机相液体并收集。将收集的有机相放入氮吹仪中，待二氯甲烷彻底挥发后，再用1mL混合溶液(水:甲醇:乙腈＝6:2:2)溶解残留的物质，经过0.22μm有机滤膜过滤后，用高效液相色谱(HPLC)检测。
色谱条件：LC-20AD高效液相色谱仪；色谱柱C18(5μm，250mm×4.6mm)；流动相：水/甲醇/乙腈(6/2/2)流速：1mL/min；进样量：20μL。检测波长：365nm，柱温30℃。
测定结果表明，与未接种菌株的AFB1发酵培养基相比，Burkholderia sp.D6处理后的AFB1含量降低，AFB1降解率为(84.71±1.53)％，结果如图3a～3b所示，表明Burkholderia sp.D6对AFB1有一定的降解作用。
(三)伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6固态发酵花生粕制备抗氧化肽
称取10.00g花生粕，121℃灭菌30min，冷却后对花生粕进行固态发酵，采用单一变量法于不同发酵温度(28℃、31℃、34℃、37℃、40℃)、不同伯克霍尔德菌Burkholderiasp.D6的接菌量(6％、8％、10％、12％、14％)、10.00g花生粕占不同量菌液和无菌水混合液的料液比(10％、20％、30％、40％、50％)、不同发酵时间(12h、24h、36h、48h、60h)下进行处理，以DPPH自由基清除率为指标，比较确定最佳发酵条件。经固态发酵后，准确称取2.00g发酵样品，加水10mL后涡旋1min，混合均匀，5000r/min离心分离10min，取上清液定容到10mL，得到发酵液。
测定发酵液的DPPH自由基清除率的方法为：取3个试管，分别加入2.0mL待测样品和2.0mL DPPH-无水乙醇溶液；2.0mL待测样品和2.0mL无水乙醇；2.0mL DPPH无水-乙醇溶液和2.0mL蒸馏水。混合均匀，反应20min，5000r/min离心分离10min，取上清液在517nm处测吸光值。三个反应液的吸光值分别为Ai、Aj和A0。按照下列公式计算：
接种量对Burkholderia sp.D6发酵产物DPPH自由基清除率的影响如图4所示。随着接菌量的变化，整体先升高后降低且趋于平稳，在接菌量10％达到最大85.7％。
料液比对Burkholderia sp.D6发酵产物DPPH自由基清除率的影响如图5所示。整体呈现先升高后降低的趋势，在料液比20％时达到最大，为82.9％。D6菌株的生长不需要过于湿润的环境，相反的，试验过程中发现过于湿润的环境适宜霉菌的生长，使花生粕被污染，产生不良气味，所以水分不宜过高。最终确定10％-30％的料液比为正交试验料液比范围。
发酵温度对菌株的生长具有较大的影响，过高或者过低的温度都会使菌株的活性降低甚至使菌株死亡，在适合的温度范围内，菌株才能快速繁殖生长，产生大量的蛋白酶水解底物蛋白，从而生成活性抗氧化物质，进而使得发酵产物的清除自由基活性较高。发酵温度对DPPH自由基清除率的影响如图6所示。整体呈现先升高后降低的趋势，在37℃达到最大，为86.5％。
发酵时间对DPPH自由基清除率的影响如图7所示。随着发酵时间的延长，DPPH清除率呈现先升高后降低再趋于平稳的趋势，在36h最大，达到85.9％。
在单因素实验的基础上，对接菌量A(％)、料液比B(％)、发酵时间C(h)、发酵温度D(℃)进行L9(34)正交试验。根据单因素的结果，选取较好水平进行正交试验，正交试验设计表如下表2所示：
表2正交试验设计
正交试验设计与极差分析如下表3所示：
表3正交试验设计与极差分析
对表3进行极差分析，发现四个因素对DPPH自由基清除率的影响顺序为A>C>D>B，较优的发酵条件是A3B3C1D3，即接菌量12％，料液比30％，发酵时间24h，发酵温度40℃。
表4正交试验方差分析
对表3和表4分析可知，接菌量是影响DPPH自由基清除率的显著性因素，四个因素的排序为A>C>D>B，与极差分析结果一致。综合极差分析和方差分析的结果，最终确定A3B3C1D3为最优发酵条件，也就是接菌量为12％，料液比30％，发酵时间24h，发酵温度40℃。
(四)伯克霍尔德菌Burkholderia sp.D6以最佳固态发酵条件发酵花生粕制备抗氧化肽
取10.00g花生粕，121℃灭菌30min，冷却后将Burkholderia sp.D6接种于花生粕中进行固态发酵，采用最佳固态发酵条件：接菌量12％，料液比30％，发酵时间24h，发酵温度40℃。
发酵花生粕产物的分级提取方法：取发酵液采用截留分子量为10000Da的超滤管进行超滤，再将滤过液采用截留分子量为3000Da的超滤管进行超滤，得到分子量在3000Da以下和10000-3000Da之间的固态发酵混合物，分别标记为PPH-1和PPH-2。测定发酵液、PPH-1、PPH-2的DPPH自由基清除率。
测定结果表明，采用Burkholderia sp.D6对花生粕进行固态发酵后，发酵产物的DPPH自由基清除率为91.18％，具有很高的抗氧化活性。经过对固态发酵花生粕的产物进行分级分离，测定不同组分的抗氧化活性，结果如图8所示。发酵后分子量低于3000Da的小分子物质PPH-1的清除率达到60.93％，而分子量在3000Da-10000 Da之间的大分子混合物PPH-2的清除率达到34.82％，说明分子量较小的发酵产物清除率更强，产物的抗氧化性主要由小分子物质决定。
以上所述仅为本发明较佳的实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种伯克霍尔德菌D6，其特征在于，保藏编号为CCTCC M 20221126。
2.根据权利要求1所述的伯克霍尔德菌D6，其特征在于，所述伯克霍尔德菌D6含有如序列号(ID):1所示的基因序列。
3.根据权利要求1所述的伯克霍尔德菌D6，其特征在于，所述伯克霍尔德菌D6产生抗氧化性生物活性肽。
4.一种微生物制剂，其特征在于，包含如权利要求1～3任一所述的伯克霍尔德菌D6。
5.根据权利要求4所述的微生物制剂，其特征在于，包含如权利要求1～3任一所述的伯克霍尔德菌D6的发酵液、菌悬液、全培养物、粗提物、胞外代谢物中的至少一种。
6.一种如权利要求1～3任一所述的伯克霍尔德菌D6或如权利要求4或5所述的微生物制剂在制备抗氧化性生物活性肽及制备含抗氧化性活性肽产品中的应用或在降解黄曲霉毒素中的应用。
7.一种制备抗氧化性生物活性肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01：将如权利要求1～3任一所述的伯克霍尔德菌D6接种于粮食、饲料或食品中发酵，得到发酵液；
S02：对步骤S01得到的发酵液进行提取，优选进行分级超滤提取，得到抗氧化性生物活性肽。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤S01中：
将如权利要求1～3任一所述的伯克霍尔德菌D6接种于花生粕中发酵；和/或
发酵温度为28℃～40℃；和/或
接菌量为6％～14％；和/或
料液比为10％～50％；和/或
发酵时间为12h～60h；和/或
在所述步骤S02中：
对所述步骤S01得到的发酵液采用截留分子量为10000Da的超滤管进行超滤，得到滤过液，再将滤过液采用截留分子量为3000Da的超滤管进行超滤，得到分子量在3000Da以下的抗氧化性生物活性肽。
9.一种降解黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11：将如权利要求1～3任一所述的伯克霍尔德菌D6接种于LB液体培养基培养，得到种子液，得到的种子液于发酵培养基培养，得到发酵液；
S12：将步骤S11得到的发酵液与含黄曲霉毒素的产品混合培养，降解黄曲霉毒素。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
S11：将如权利要求1～3任一所述的伯克霍尔德菌D6接种于LB液体培养基培养的培养条件为于37℃，160rpm的摇床上过夜培养，得到种子液；
得到的种子液于发酵培养基培养的培养条件为于37℃，160rpm震荡培养2d，得到发酵液；
得到的发酵液中伯克霍尔德菌D6的含量至少为2.8×108cfu/mL；和/或
S12：将步骤S11得到的发酵液与含黄曲霉毒素的产品混匀后，于37℃，160rpm震荡培养3d；和/或
所述步骤S12中的含黄曲霉毒素的产品包括含黄曲霉毒素的花生粕。
CN202310252590.6A 2022-10-25 2023-03-15 一种伯克霍尔德菌d6、微生物制剂及其应用 Pending CN116445334A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2022113137134 2022-10-25
CN202211313713 2022-10-25

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116445334A true CN116445334A (zh) 2023-07-18

Family

ID=87134699

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310252590.6A Pending CN116445334A (zh) 2022-10-25 2023-03-15 一种伯克霍尔德菌d6、微生物制剂及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116445334A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111826295B (zh) 豆粕发酵用贝莱斯芽孢杆菌菌株
CN111676156B (zh) 一株提高还原活性的贝莱斯芽孢杆菌mrs及其发酵物和应用
CN106701610A (zh) 一种多粘类芽孢杆菌及其培养方法和应用
CN109182147B (zh) 一种青霉及其生产烟曲霉素的方法
CN110331102A (zh) 异常威克汉姆酵母菌1027jm-2在酱油酿造中的应用
CN102925361B (zh) 一种afb1降解菌及降解酶
CN112251388B (zh) 一种植物乳杆菌及其乳酸菌发酵剂的应用
CN113308418A (zh) 一株发酵用的谷糠乳杆菌及其发酵制备工艺
CN115011515B (zh) 一株提高苜蓿青贮中植物醇含量的菌株及其应用
CN113801800B (zh) 一株酿酒酵母及其应用
CN116445334A (zh) 一种伯克霍尔德菌d6、微生物制剂及其应用
CN113151018B (zh) 一种发酵毕赤酵母rs-13及其应用
CN113637605B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其在制备1-脱氧野尻霉素中的应用
CN113308419B (zh) 一株发酵用的谷糠乳杆菌及其应用
CN112715758B (zh) 一株布氏乳杆菌bl4及其制备青贮饲料的方法
CN111718868B (zh) 一株提高自由基清除能力的艾丁湖土地芽孢杆菌lbx及其发酵物和应用
CN114916610A (zh) 一种枯草芽孢杆菌发酵银杏叶渣制备富硒饲料添加剂的方法及应用
CN113999881A (zh) 微生物发酵制备l-2-氨基己二酸的方法及抑制蓝藻的应用
CN111040969B (zh) 一种复合乳杆菌剂及其在水牛青贮饲料中的应用
CN116004418B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌z-1及其制备水解产物的应用
CN116083268B (zh) 一种阿氏芽孢杆菌及其在改善雪茄香气中的应用
CN113854470B (zh) 鞘氨醇杆菌sc015及其在制备诺如病毒吸附剂中的应用
CN113025533B (zh) 一株产丁酸的芽孢杆菌菌株筛选及其应用
CN117417847B (zh) 一种大理梭菌及其在制备抗氧化功能性物质中的应用
CN113699082B (zh) 一株降解亚硝酸盐且来源于糄粑的乳酸肠球菌

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination