CN113854470B - 鞘氨醇杆菌sc015及其在制备诺如病毒吸附剂中的应用 - Google Patents

鞘氨醇杆菌sc015及其在制备诺如病毒吸附剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鞘氨醇杆菌SC015及其在制备诺如病毒吸附剂中的应用，本发明的菌株SC015吸附诺如病毒的效率能够达到60％，而且对GII.4亚型的诺如病毒具有特异性。该菌对诺如病毒的吸附特异性，过滤吸附饮用水或生菜、草莓等鲜切果蔬中特定亚型诺如病毒，该技术能有效的预警并清除果蔬表面诺如病毒GII.4的污染，与现有技术(滤膜法)相比，提高了30％吸附效率，且具有吸附特异性(传统滤膜法无特异性)。

Description

鞘氨醇杆菌SC015及其在制备诺如病毒吸附剂中的应用
技术领域
本发明涉及一种诺如病毒吸附清除技术，特别涉及一株鞘氨醇杆菌SC015(Sphingobacterium sp.SC015)及其在吸附诺如病毒中的应用。
背景技术
诺如病毒(Norovirus，NoV)可感染人导致急性肠胃炎，因于1968年在美国俄亥俄州诺瓦克镇的腹泻暴发中被分离发现而得名，并于1972年由Kapikian首次检出。无论在发展中国家或是发达国家，NoV已公认是儿童和成人流行性或散发性胃肠炎最常见的病因。NoV是无包膜单股正链RNA病毒，属杯状病毒科，可分为GI～GV五个基因群(Genogroup)，其中引起人类感染的主要是GI和GII群。通过突变和重组，诺如病毒的基因组进行着快速的变异，表现出基因的多样化，从而导致新突变株的产生以及急性胃肠炎疾病的大暴发。NoV的感染性强，有报道表明，即使少于102拷贝数/mL的NoV颗粒都可能导致感染。并且，NoV对环境具有较强的耐受性，在酸性 (pH 2.7)条件下、加热(60℃)条件及自来水中游离氯(3.75～6.25mg/L)浓度条件下仍具感染性，预防手段十分有限。
诺如病毒所引发的胃肠炎在世界各地广泛流行和暴发。如，美国每年有2300万例非细菌性急性胃肠炎由诺如病毒引起，占各种肠道传染病的60％，并常引起医院感染暴发。欧洲多国也有相关报道：1995～2000年期间85％以上的暴发性病毒性胃肠炎系诺如病毒所致。亚洲地区也存在诺如病毒胃肠炎暴发流行的情况。Hamano等报道日本Okay ama地区77％急性暴发性非细菌性胃肠炎与诺如病毒有关。我国对诺如病毒的研究起步较晚，自1995年报告首例诺如病毒感染病例后，国内许多地区多次暴发诺如病毒感染性急性胃肠炎。2000-2013年，我国涉及诺如病毒暴发疫情72起，累计报道病例11778例，平均164例/起，疫情暴发地主要集中于广东和浙江。诺如病毒可在所有年龄段、不同场所(幼儿园、学校、餐馆、夏令营、医院、护婴室、养老院、航海舰队和部队单位等)引起暴发，对社会造成的危害极大。如果没有及时有效的防治手段，将严重影响经济的发展和社会的稳定。
近年来的研究还发现，一些微生物细菌可以特异性的吸附或结合病毒。如，人肠道微生物菌群内细菌介导诺如病毒的感染作用。在人诺如病毒的感染中，组织血型抗原(HBGAs)起了重要的作用。以往的研究表明人诺如病毒的P2结构域存在一个特定的链接结构，通过这个结构病毒可以和红细胞、呼吸系统的黏膜上皮细胞、消化细胞和泌尿生殖道细胞表面的糖类结构结合，这些细胞表面的受体都被认为是HBGAs (主要包括H型、ABO血型和Lewis抗原)。最近的研究发现大量的革兰氏阴性菌同样可以表达HBGAs。诺如病毒能够依附于这些表达HBGAs的细菌。投射电子显微镜演示NoV病毒样颗粒(VLPs)主要附着于肠溶性菌株的胞外聚合物，而这些胞外聚合物也是类似于HBGAs样的分子。同样，在研究诺如病毒对果蔬等农产品的污染吸附过程中，Gao等人研究发现NoV GII.4型VLPs可以与生菜的细胞壁多糖结合，进一步分析表明该细胞壁多糖同样具有类似于HBGAs样的分子结构。Esseili等人还发现在不同的非生物逆境下(强光，紫外线，机械损伤，高温或低温，冷冻，水淹等条件)，采收前的生菜和菠菜叶鞘细菌的密度与诺如病毒的吸附有一定的相关性，这也暗示了植物共生微生物影响病毒污染吸附的可能。
本发明成功筛选到一株诺如病毒结合细菌(Sphingobacterium sp.)SC015(保藏号： CCTCC M 20191079)，并对其影响诺如病毒的污染、吸附、耐受性等特征开展了深入研究，同时对诺如病毒结合细菌表面HBGAs类似物的分离、解析工作，为未来食源性病毒预防和控制提供支持。
发明内容
本发明目的是提供一株诺如病毒吸附细菌—鞘氨醇杆菌SC015(Sphingobacterium sp.SC015)，并利用该菌吸附特异性，过滤吸附特定亚型诺如病毒，从而开发更加有效的预警和清除食品中诺如病毒的方法。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新型诺如病毒吸附细菌--鞘氨醇杆菌SC015(Sphingobacteriumsp.SC015)，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO: M20191079，保藏日期为2019年12月20日，地址中国武汉武汉大学，430072。
本发明Sphingobacterium sp.SC015菌株是从生菜中分离得到的诺如病毒吸附细菌，菌落不透明呈圆形，灰白色中等大小，边缘整齐光滑，菌落隆起、湿润有粘稠状，显微镜下革兰氏染色为阴性杆菌，在不同条件(高温、阳光照射)的生长逆境下，对特定亚型诺如病毒的感染力具有显著的影响。
本发明还提供一种鞘氨醇杆菌SC015在制备诺如病毒吸附剂中的应用，所述应用为：将鞘氨醇杆菌SC015发酵液离心后的沉淀用PBS重悬制成鞘氨醇杆菌SC015菌液；鞘氨醇杆菌SC015菌液利用滤膜真空抽滤后，获得覆盖鞘氨醇杆菌SC015的滤膜；采用覆盖鞘氨醇杆菌SC015的滤膜真空抽滤待测样品，实现对诺如病毒的特异性吸附，获得去除诺如病毒的样品。
进一步，所述待测样品包括水体、生菜、草莓等鲜切果蔬。所述诺如病毒主要包括诺如病毒GII.4。所述待测样品中诺如病毒含量小于103PFU/mL。
进一步，所述鞘氨醇杆菌SC015发酵液按如下步骤制备：鞘氨醇杆菌SC015接种至TSA固体培养基，放置于25℃恒温培养箱，静置培养4-5天；挑取菌体接种至 TSB液体培养基，25℃、220rpm摇床转速下培养4-5天，获得种子液；将种子液以体积浓度5％的接种量接种至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、220rpm摇床转速下培养4-5天，获得发酵液。TSB液体培养基组成：胰酪胨17.0g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖(一水合/无水)2.5g/L，溶剂为纯化水，pH7.3±0.2(25℃)；TSA固体培养基组成：胰酪胨15.0g/L；大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g/L；氯化钠5.0g/L；磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖(一水合/无水)2.5g/L，琼脂15.0g/L，溶剂为纯化水，pH7.3±0.2(25℃)；发酵培养基组成：胰酪胨1.7g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物0.3g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸氢二钾0.25g/L，葡萄糖(一水合/ 无水)0.25g/L，溶剂为纯化水，pH7.3±0.2(25℃)；所述纯化水是指二次蒸馏水。
进一步，所述鞘氨醇杆菌SC015菌液按如下步骤制备：将发酵液600rpm离心 30min后，去上清，加入PBS缓冲液，用移液器小心吹打混匀，再次600rpm离心，重复加入PBS和离心三次后，取沉淀加入PBS缓冲液吹打混匀，再用PBS缓冲液稀释菌液至OD600在0.4-0.5之间，获得鞘氨醇杆菌SC015菌液。
进一步，所述滤膜为正电荷滤膜(优选滤膜孔径0.22μm，直径47mm， Sigma-Aldrich，Germany)。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明的Sphingobacteriumsp.SC015菌株吸附诺如病毒的效率能够达到60％，而且对GII.4亚型的诺如病毒具有特异性。该菌对诺如病毒的吸附特异性，过滤吸附饮用水或生菜、草莓等鲜切果蔬中特定亚型诺如病毒，该技术能有效的预警并清除果蔬表面诺如病毒GII.4的污染，一片正电荷滤膜(0.22μm，47mm)铺满细菌SC015后，可吸附103PFU/mL的诺如病毒GII.4。与现有技术(滤膜法)相比，提高了30％吸附效率，且具有吸附特异性(传统滤膜法无特异性)。
附图说明
图1为单一细菌占菌群百分比的菌落群体形态特征图。
图2为菌株SC015对诺如病毒吸附率柱形图及透射电镜图，A为吸附率(％)，B 为透射电镜TEM图。
图3为菌株SC015表面HBGAs受体类型图。注：SC015为菌株SC015；PGM为猪胃黏膜来源胃蛋白酶；NCL为空白对照；YGLC为阴性肠杆菌(Enterobacter cloacae)，阴性对照；OD450>0.3认为HBGAs表达阳性。
图4为菌株SC015平板培养图。
图5为菌株SC015的系统发育树。
图6为水样中诺如病毒GII.4拷贝数Copies/mL与Ct值标准曲线。
图7为鞘氨醇杆菌SC015对水体中诺如病毒GII.4的吸附清除率(％)。
图8为生菜样品中诺如病毒GII.4拷贝数Copies/mL与Ct值标准曲线。
图9为鞘氨醇杆菌SC015处理正电荷膜对果蔬中诺如病毒GII.4的吸附率(％)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述室温为25-30℃。
TSB液体培养基组成：胰酪胨17.0g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖(一水合/无水)2.5g/L，溶剂为纯化水，pH7.3±0.2 (25℃)；所述纯化水是指二次蒸馏水。
TSA固体培养基组成：胰酪胨15.0g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物(购自山东拓普生物工程有限公司)5.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖(一水合/无水)2.5g/L，琼脂15.0g/L，溶剂为纯化水，pH7.3±0.2(25℃)。
发酵培养基组成：胰酪胨1.7g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物0.3g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸氢二钾0.25g/L，葡萄糖(一水合/无水)0.25g/L，溶剂为纯化水，pH7.3±0.2(25℃)。
本发明实施例所用PBS均为0.1M、pH 7.2的磷酸盐缓冲液。
本发明所述TBST是指蛋白洗脱缓冲液，组成为：pH 7.5、10mM Tris，500mM NaCl，体积浓度0.05％Tween20。TMB是指四甲基联苯胺。
1％BSA-PBS是指含体积浓度1％胎牛血清(BSA)的PBS。
本发明诺如病毒NoV GII.4(记为NoV GII.4)PBS悬液由浙江省疾病预防控制中心提供，浓度8log 10Copies/mL。
实施例1：生菜表面诺如病毒吸附细菌的筛选
在分离筛选生菜样品中诺如病毒结合细菌之前，先对细菌筛选容器等进行消毒处理(高温高压灭菌处理)。
1、生菜样品前处理
使用蒸馏水冲洗生菜(var.ramosa Hort.)叶片表面及叶鞘处，利用消毒过的剪刀随机取生菜叶片及叶鞘共5g装入三角瓶，再加入50mL的PBS缓冲液，使用玻璃棒搅拌5min，双层纱布过滤得菌悬液，5000rpm离心5min，弃上清，沉淀用2ml PBS 重悬，再1000rpm离心1min，收集上清液。
2、HBGAs表达细菌筛选
分别将50μL用PBS以体积比1:1000制备的3种抗人类组织血清抗原A、B、(O) H鼠单克隆抗体稀释液(上海翊圣生物科技有限公司，上海，中国)加到96孔酶标板的反应孔中，每种抗体各30孔，室温下放置1h，使抗体包埋在反应孔中。用PBS 洗涤2次，以200μL/孔的量将步骤1上清液加入到各反应孔中。室温下孵育1h，用 PBS洗涤3～4次，在各反应孔中加入TSB培养基200μL，于26℃培养2-5d，直至培养孔浑浊。1000rpm离心30min后，弃上清，将富集的细菌用200μL PBS重悬后按倍比(1:10)梯度稀释后涂布于TSA平板，37℃培养2d，挑取单菌落，重复上述单菌落分离步骤直至菌落形态一致为止。挑取单个菌落在TSB液体培养基中37℃培养2d后，1000rpm离心10min，收集菌体沉淀，采用16SrDNA测序方法测序后，根据序列采用MEGA软件分析菌群结构，结果见图1所示，大多数生菜中HBGAs表达细菌为生菜主要共生菌。
3、生菜表面分离细菌对诺如病毒吸附作用分析
选取步骤2的菌体沉淀各1份，分别接种于TSB液体培养基，在26℃下培养6-8 h至对数生长期。取1mL菌液，8000rpm离心1min，弃上清，沉淀用PBS重悬，重复以上离心、弃上清步骤两次，以清除培养基中的杂质；重悬菌液用PBS调至OD600为0.44±0.02。取100μLOD600为0.44±0.02菌液与100μL诺如病毒NoV GII.4PBS悬液混合，用PBS调体积至500μL，37℃下，150rpm振荡孵育1h，12000rpm离心5min，取上清，采用病毒RNA提取试剂盒(QIAGEN；No.52904)提取病毒RNA进行RT-qPCR 检测(同实施例4方法)，分别测定上清中病毒总量以及初始加入的病毒量；再根据公式(1)计算细菌对诺如病毒吸附率。
根据吸附率，分离筛选到一株诺如病毒结合能力较强的细菌，记为菌株SC015。
4、菌株SC015对诺如病毒吸附率
将菌株SC015按照步骤2方法检测对于诺如病毒NoV GII.4的吸附率，同样条件下以阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ATCC 13047作为对照菌，结果见图2所示。
菌株SC015对诺如病毒吸附率(％)显著高于对照菌(图2中A)，SC015吸附率最高可以达到43％。透射电镜TEM图表明诺如病毒主要吸附于该菌的表面及胞外分泌物中(图2中B)。
5、细菌SC015表面HBGA受体类型分析
实验组(SC015)：将菌株SC015接种于TSB培养基，在37℃下培养18h，获得种子液。取10μl种子液，接种于5ml TSB培养基中，37℃，150rpm摇菌过夜，用PBS缓冲液调整菌液OD600＝1.0。吸取1ml OD600＝1.0菌液于2ml离心管中，5000×g 离心3min，弃去上清，加入150μl 0.1mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液(pH 9.0)重悬，使用天根第三代变速组织研磨器套装(OSE-Y50，购自天根生化科技(北京) 有限公司)以1000rpm转速进行细胞研磨破碎2min。每管破碎后的菌液用0.1mol/L 的pH 9.0的Na2CO3-NaHCO3缓冲液补足至1mL，获得菌株SC015菌液。
对照组1(PGM)：来源于猪胃黏膜的胃蛋白(Typ III PGM,Sigma-Aldrich,10 mg/ml)。
对照组2(YGLC)：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ATCC 13047，记为阴性对照菌YGLC。
对照组3(NCL)：等量体积的PBS溶液，记为空白对照组。
实验组、对照组1、对照组2和对照组3，分别按100μL/孔加入高吸附力酶标板(F605034-0001，上海生工)的96孔中，每组设8个平行孔，37℃2h或4℃过夜。弃液后PBS洗涤三次，按120μL/孔加入BSA封闭液(1％BSA-PBS)，37℃孵育1 h进行封闭。弃液后PBS洗涤三次，分别按100μL/孔加入用1％BSA-TBST以体积比1:1000稀释的不同类型(Precursor、A、B、H、LewisA、LewisB、LewisX和LewisY) HBGAs单克隆抗体稀释液(记为BG1～BG8，Covance，CA，United States)，经37℃孵育60min。弃液后TBST洗涤五次，分别按100μL/孔加入用1％BSA-TBST以体积比1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IGG二抗稀释液(HRP-conjugatedgoat anti-mouse IgG，翊圣生物，上海，中国)，经37℃孵育60min。弃液后TBST洗涤五次，按100μL/孔加入TMB混匀后避光37℃反应10min。每孔加入50μL终止液(2mol/LH2SO4水溶液)，15min内于450nm处测定光密度(OD)值，OD450大于 0.3为阳性。
目前已知的HBGA受体类型主要包括Precursor、A、B、H、LewisA、LewisB、 LewisX和LewisY。菌株SC015表面HBGA受体类型分析见图3，根据OD值(OD450 大于0.3为阳性)判断，该菌株表面HBGAs受体类型包含了A、B、H、LewisA和 LewisB，该结果也近一步验证了该菌对诺如病毒的吸附能力。
实施例2：菌株SC015的生物学鉴定
1.菌株形态特征
(1)菌落群体形态特征：将菌株SC015单克隆菌落划线接种至TSA固体培养基，平板倒置于恒温培养箱，27℃培养4-5天，其菌落圆形，乳黄色不透明，表面光滑湿润，中央微凸，边缘规则，无晕环，直径3-5mm，见图4。
(2)菌体个体形态特征：对菌株SC015进行革兰氏染色，利用光学显微镜观测，显示该菌株为杆状，革兰氏阴性菌。
2.菌株16Sr RNA分析
采用细菌基因组DNA提取试剂盒(QIAGEN)，抽提菌株SC015基因组DNA，以该DNA为模板，采用细菌16S rRNA通用引物(27F，1492R)扩增菌株16S rRNA 片段，经过上海生工公司测序，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列与NCBI 中的核酸数据库进行Blast同源比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，与数据库中已知细菌菌株鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)JCM7461(LC379098.1)的16S rRNA的部分序列的相似性达到99％，保守区相似序列达到100％。使用软件MEGA7.0 中的邻近结合法(neighbor-joiningmethod)制作菌株SC015的系统发育树，见图5。
16S rRNA：
TTTACCCTGACACGCTCCTCGCGGTAACATGCTTTAGGTACCCCCAACTTTC ATGGCTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGTCATTG CTGATACGCGATTACTAGCGAATCCAACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCA ATCCGAACTGTGAATGGCTTTTAGAGATTAGCATCATATTGCTATGTAGCTGCCCGCTGTACCATCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCCGGACGTAAGGGCCATGATGACT TGACGTCGTCCCCACCTTCCTCACTGTTTGCACAGGCAGTCTGTTTAGAGTCCC CACCTTAAATGCTGGCAACTAAACATAGGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAAC CCAACACCTCACGGCACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTAGTTTCGTGTC CCGAAGGACGGGTGCGTCTCTGCACCCTTCACTAACTTTCAAGCCCGGGTAAGG TTCCTCGCGTATCATCGAATTAAACCACATGCTCCTCCGCTTGTGCGGGCCCCCG TCAATTCCTTTGAGTTTCACCCTTGCGGGCGTACTCCCCAGGTGGATAACTTAAC GCTTTCGCTGGGACGCTGGCTGTCTATCGCCAACATCGAGTTATCATCGTTTAGG GCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGATCCCCACGCTTTCGTGCATCAG CGTCAATACCAGCTTAGTGAGCTGCCTTCGCAATCGGAGTTCTAAGACATATCTA TGCATTTCACCGCTACTTGTCTTATTCCGCCCACTTCAAATGGATTCAAGCCCATC AGTATCAAAGGCACTGCGATGGTTGAGCCACCGTATTTCACCCCTGACTTAATAG GCCGCCTACGCACCCTTTAAACCCAATAAATCCGGATAACGCTCGGATCCTCCGT ATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGATCCTTATTCTTCCAGTACATTCA GCTAAATACTCGTATT。
3.菌株SC015相关生理生化试验
分别对菌株SC015纯培养物进行甲基红实验、淀粉水解实验、吲哚实验、柠檬酸盐、V-P实验等一系列生理生化实验，得出该菌株为氧化酶阳性；甲基红、V-P阴性，接触酶阳性，不能使明胶液化；不产生吲哚，不产硫化氢，不能淀粉水解；不需要生长因子；可以将硝酸盐还原成亚硝酸盐；能够利用葡萄糖、乳酸盐、琥珀酸盐等碳源等生理生化指标见表1。
表1菌株SC015生化指标鉴定结果
注：APPA为丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳胺酶；H2S为H2S产生；BGLU为β-半乳糖苷酶；ProA为L脯氨酸芳胺酶；SAC为蔗糖；1LATK为乳酸盐产碱；GlyA为氨基乙酸芳胺酶；O129R为O/129耐受；ADO为侧金盏花醇； BNAG为β-N-乙酰葡萄糖苷酶；dMAL为D-麦芽糖；LIP为脂酶；dTAG为D-塔格糖；AGLU为α-葡萄糖；ODC为鸟氨酸脱羧酶；GGA为谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶；PyrA为吡咯烷基芳胺酶；AGLTp为谷氨酰芳胺酶；dMAN为D- 甘露醇；PLE古老糖；dTRED-海藻糖；SUCT为琥珀酸盐产碱；LDC赖氨酸脱羧酶；IMLTa L-苹果酸盐同化；IARLL-阿拉伯醇；dGLU为D-葡萄糖；dMNE D-甘露糖；TyrA酪氨酸芳胺酶；CIT柠檬酸盐(钠)；NAGAN-乙酰-β-半乳糖氨酶；IHISa为组氨酸同化；ELLM为ELLMAN；dCELD-纤维二糖；GGT为γ-谷氨酰转移酶；BXYLβ-木糖苷酶；URE 尿素酶；MNT丙二酸盐；AGAL为α-半乳糖苷酶；CMT为COURMARATE；ILATa为L-乳酸盐同化；BGAL为β-半乳糖苷酶；OFF葡萄糖发酵；BALap为β-丙氨酸芳胺酶；dSOR为D-山梨醇；5KG5-酮-葡萄糖苷；PHOS磷酸酶； BGUR为β-葡萄糖苷酸酶；CIT为柠檬酸利用。
最终，将该菌株SC015鉴定为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)属，命名为鞘氨醇杆菌SC015(Sphingobacterium sp.SC015)，保藏于中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M20191079，保藏日期为2019年12月20日。
实施例3:鞘氨醇杆菌SC015菌液
1.鞘氨醇杆菌SC015培养：鞘氨醇杆菌SC015接种至TSA固体培养基，放置于 25℃恒温培养箱，静置培养4-5天。挑取菌体接种至TSB液体培养基，25℃、220rpm 摇床转速下培养4-5天，获得种子液。
2.鞘氨醇杆菌SC015菌种保藏：将40％的甘油1mL装入甘油管内高压蒸汽灭菌待用，取1mL种子液用移液枪装入甘油管充分混匀，使甘油浓度达到20％，做上标记后置于4℃预冷30min，再放置于-80℃冰箱保藏。
3.鞘氨醇杆菌SC015发酵培养：将鞘氨醇杆菌SC015种子液以体积浓度5％的接种量接种至装有发酵培养基的三角瓶中，25℃、220rpm摇床转速下培养4-5天，获得发酵液。
实施例4：鞘氨醇杆菌SC015对诺如病毒GII.4的特异性吸附清除
1.提取诺如病毒RNA，制作标准曲线：
采用病毒提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit,52904,QIAGEN)提取诺如病毒GII.4的RNA，以一步法RT-PCR技术为基础，选用NoV GII(JJV2F/JJV2R,JJV2P) 为标准引物和探针(表2)，扩增NoV GII.4特异性PCR产物。
表2诺如病毒GII.4引物与探针
标准曲线构建过程如下：
反转录-荧光定量PCR检测：采用One Step PrimescriptTMRT-PCR Kit进行RT-PCR扩增。扩增体系(25μL)：2×buffer 12.5μL，逆转录酶和Taq酶各0.5μL，上、下游引物(20μmol/L)各0.6μL，探针(20μmol/L)0.3μL，RNA模板5μL，ddH2O 5μL。扩增条件：42℃逆转录反应30min；95℃预变性2min；95℃变性5s，55℃退火、延伸35s，39个循环。
绘制标准曲线：取上述NoV GII.4特异性PCR产物，采用PCR产物纯化试剂盒(BeaverBeads Code NO.9760)将目标DNA纯化后与pEASY-T1质粒相连，构建含有NoV GII.4特异性片段的重组质粒。将构建的重组质粒用蒸馏水或TE缓冲液按体积比1:10进行梯度稀释后，分别以各个稀释浓度作为反转录-荧光定量PCR检测模板，通过重组质粒的分子量和待测核酸总量判断病毒的拷贝数，以最低检测稀释度作为病毒的拷贝数Copies(即Ct值)，并根据病毒原液各个稀释浓度与其对应的拷贝数之间的关系建立标准曲线(图6)。
2.利用鞘氨醇杆菌SC015处理正电荷膜吸附清除水体中的诺如病毒GII.4：
(1)鞘氨醇杆菌SC015处理正电荷膜：取实施案例3制备的发酵液1000rpm离心30min后，去上清，加入PBS缓冲液，用移液器小心吹打混匀，再次1000rpm离心，重复加入PBS并离心三次，然后去上清，取沉淀加入PBS缓冲液吹打混匀，获得鞘氨醇杆菌SC015的PBS混合液；用PBS缓冲液稀释菌液至OD600＝0.5，获得鞘氨醇杆菌SC015菌液。将正电荷滤膜(孔径0.22μm，直径47mm，Sigma-Aldrich， Germany)固定在过滤漏斗(MILLIPORE微生物检测三联过滤器，MIAC03P01)上 (滤膜下方可垫上同样大小的滤纸片)，光面向上；取5mL鞘氨醇杆菌SC015菌液，小心从滤膜上方过滤漏斗周边加入，静置15min后，打开真空泵(MilliflexPLUS) 滤除液体，使SC015细菌均匀覆盖在滤膜表面。
(2)以诺如病毒GII.4PBS悬液为原料，用水配制不同浓度诺如病毒GII.4水溶液(7.8×101Copies/mL、7.8×102Copies/mL、7.8×103Copies/mL、7.8×104Copies/mL、 7.8×105Copies/mL、7.8×106Copies/mL、7.8×107Copies/mL、7.8×108Copies/mL)，并用1M的HCl调整pH值至3.5，加入装有步骤(1)滤膜的漏斗中，采用Milliflex PLUS真空泵负压抽滤至无液体流出；取出滤膜，剪碎后放入1.5mL离心管，直接加入560μL的AVL裂解液(QIAampViral RNA Mini Kit，52904，Qiagen,Germany)浸泡滤膜5min后(该步骤省去了常规膜浓缩病毒后的二次洗脱和浓缩过程)，涡旋振荡器(SI-0246，妙生科技，苏州，中国)50Hz频率剧烈振荡5min后裂解病毒，再采用病毒提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit，52904，QIAGEN)，进一步纯化核酸。收集含有纯化后病毒核酸的滤液，采用步骤1反转录-荧光定量PCR检测，通过步骤1中所绘制的标准曲线(图6)，根据被检测病毒的Ct值，根据公式(2)计算病毒含量(Copies/mL)。以未经鞘氨醇杆菌SC015处理的正电荷膜为对照组(即普通滤膜)。根据公式(3)计算诺如病毒清除率。
Y＝-0.4608x+14.949,R2＝0.9961 (2)
公式(2)中Y表示病毒的数量(拷贝/μL)；X表示荧光定量PCR检测中的Ct 值。
水样中诺如病毒的清除率的计算结果如图7所示，使用该方法清除水样中不同浓度诺如病毒NoV GII.4的清除率为100％、100％、100％、100％、100％、74.75％、69.54％和45.65％；清除上限在7.8×105Copies/mL到7.8×106Copies/mL之间。与对照相比，当低浓度病毒(7.8×10Copies/mL到7.8×103Copies/mL之间)时，试验组和对照组对病毒的清除率相当，都可以达到100％；当中浓度病毒(7.8×103Copies/mL到 7.8×105Copies/mL之间)时，对照组清除率降低，而试验组显著高于对照组，仍然可以达到100％；当高浓度病毒(7.8×105Copies/mL到7.8×108Copies/mL之间)时，尽管已经到达了滤膜对病毒的吸附上限，但添加了SC015细菌的试验组对病毒的清除率仍然显著高于对照组。
实施例5：利用鞘氨醇杆菌SC015处理正电荷膜吸附果蔬中诺如病毒GII.4
1.提取病毒RNA，制作标准曲线：
提取诺如病毒GII.4的RNA，以一步法RT-PCR技术为基础，选用NoV GII (JJV2F/JJV2R,JJV2P)为标准引物和探针(表2)，将待检样本的RNA进行10×梯度稀释后作为检测模板，通过判断以最低检测稀释度作为病毒的拷贝数(Copies)。同实施例4方法，根据病毒原液不同稀释度与其对应的Ct值之间的关系建立标准曲线 (图8)。
2.利用BE洗脱液洗脱生菜样品中的诺如病毒
新鲜蔬菜(生菜)每份15g分装，共8份。每份蔬菜中加入140μL诺如病毒GII.4PBS悬液(加入浓度分别为7.8×101Copies/mL、7.8×102Copies/mL、7.8×103Copies/mL、 7.8×104Copies/mL、7.8×105Copies/mL、7.8×106Copies/mL、7.8×107Copies/mL、 7.8×108Copies/mL)，点状涂布于菜叶上(5μl每点)，置于二级生物安全柜中30min。待风干后，剪碎菜叶，装入50ml离心管中，加入30ml洗脱液BE(三羟甲基氨基甲烷12.11克，甘氨酸3.75克，牛肉浸膏10克，蒸馏水1升，pH9.5)，室温下漩涡振荡 30min，10000rpm离心15min，上清转移至另一个50ml离心管中，调节pH值至3-3.5，即为病毒洗脱液。
3.利用鞘氨醇杆菌SC015处理正电荷膜吸附清除洗脱液中诺如病毒GII.4：
Milliflex PLUS真空泵、无菌过滤漏斗和滤膜组成浓缩装置，其中正电荷膜放置于Milliflex PLUS真空泵的过滤支架处(滤膜下方可垫上同样大小的滤纸片)，固定好过滤支架与漏斗后，启动开关即可进行过滤。
鞘氨醇杆菌SC015处理正电荷膜：首先将正电荷膜(孔径0.22μm，直径47mm，Sigma-Aldrich，Germany)固定在过滤漏斗上，光面向上；再取实施案例3中培养的发酵液1000rpm离心30min后，去上清，加入PBS缓冲液，用移液器小心吹打混匀，再次1000rpm离心，重复(离心和加缓冲液)三次后获得鞘氨醇杆菌SC015的PBS 混合液；用PBS缓冲液稀释菌液OD600＝0.5，取5mL该浓度菌液，小心从滤膜上方过滤漏斗周边加入，静置15min后，打开真空泵滤除液体，使SC015细菌均匀覆盖在滤膜表面。然后加入步骤2病毒洗脱液，抽滤，取出滤膜，剪碎后放入1.5mL离心管，直接加入AVL裂解液(Qiagen，Germany)浸泡滤膜5min后(该步骤省去了常规膜浓缩病毒后的二次洗脱和浓缩过程)，涡旋振荡器(SI-0246,妙生科技，苏州，中国)50Hz频率上剧烈振荡5-8min后，再采用病毒提取试剂盒(QIAamp Viral RNAMini Kit,52904,QIAGEN)提取核酸。收集含有纯化后病毒核酸的滤液，同实施例4 方法检测病毒含量。以未经鞘氨醇杆菌SC015处理的正电荷膜为对照组(即普通滤膜)。
根据公式(4)计算诺如病毒清除率，结果见图9所示。
根据荧光定量PCR的结果，加入生菜样品中诺如病毒NoV GII.4的浓度是7.8×101Copies/mL、7.8×102Copies/mL、7.8×103Copies/mL、7.8×104Copies/mL、7.8×105Copies/mL、7.8×106Copies/mL、7.8×107Copies/mL、7.8×108Copies/mL，生菜样品中诺如病毒的清除率的计算结果如图9所示，使用该方法清除缩生菜样品中不同浓度诺如病毒NoV GII.4的清除率为100％、100％、100％、100％、87.60％、62.13％、 53.26％和28.94％；清除饱和值在7.8×104Copies/mL到7.8×105Copies/mL之间。
序列表
<110> 江西农业大学
<120> 鞘氨醇杆菌SC015及其在制备诺如病毒吸附剂中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)
<400> 1
tttaccctga cacgctcctc gcggtaacat gctttaggta cccccaactt tcatggcttg 60
acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg tcattgctga tacgcgatta 120
ctagcgaatc caacttcatg gggtcgagtt gcagacccca atccgaactg tgaatggctt 180
ttagagatta gcatcatatt gctatgtagc tgcccgctgt accatccatt gtagcacgtg 240
tgtagccccg gacgtaaggg ccatgatgac ttgacgtcgt ccccaccttc ctcactgttt 300
gcacaggcag tctgtttaga gtccccacct taaatgctgg caactaaaca taggggttgc 360
gctcgttgcg ggacttaacc caacacctca cggcacgagc tgacgacagc catgcagcac 420
ctagtttcgt gtcccgaagg acgggtgcgt ctctgcaccc ttcactaact ttcaagcccg 480
ggtaaggttc ctcgcgtatc atcgaattaa accacatgct cctccgcttg tgcgggcccc 540
cgtcaattcc tttgagtttc acccttgcgg gcgtactccc caggtggata acttaacgct 600
ttcgctggga cgctggctgt ctatcgccaa catcgagtta tcatcgttta gggcgtggac 660
taccagggta tctaatcctg ttcgatcccc acgctttcgt gcatcagcgt caataccagc 720
ttagtgagct gccttcgcaa tcggagttct aagacatatc tatgcatttc accgctactt 780
gtcttattcc gcccacttca aatggattca agcccatcag tatcaaaggc actgcgatgg 840
ttgagccacc gtatttcacc cctgacttaa taggccgcct acgcaccctt taaacccaat 900
aaatccggat aacgctcgga tcctccgtat taccgcggct gctggcacgg agttagccga 960
tccttattct tccagtacat tcagctaaat actcgtatt 999

Claims (8)

1.鞘氨醇杆菌SC015(Sphingobacterium sp.SC015)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20191079，保藏日期为2019年12月20日，地址中国武汉武汉大学，430072。
2.一种权利要求1所述鞘氨醇杆菌SC015在制备诺如病毒吸附剂中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将鞘氨醇杆菌SC015发酵液离心后的沉淀用PBS重悬制成鞘氨醇杆菌SC015菌液；鞘氨醇杆菌SC015菌液利用滤膜真空抽滤后，获得覆盖鞘氨醇杆菌SC015的滤膜；采用覆盖鞘氨醇杆菌SC015的滤膜真空抽滤待测样品，实现对诺如病毒的特异性吸附，获得去除诺如病毒的样品。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述待测样品包括水体、生菜、草莓。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述诺如病毒包括诺如病毒GII.4。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述鞘氨醇杆菌SC015发酵液按如下步骤制备：鞘氨醇杆菌SC015接种至TSA固体培养基，放置于25℃恒温培养箱，静置培养4-5天；挑取菌体接种至TSB液体培养基，25℃、220rpm摇床转速下培养4-5天，获得种子液；将种子液以体积浓度5％的接种量接种至发酵培养基中，25℃、220rpm摇床转速下培养4-5天，获得发酵液；TSB液体培养基组成：胰酪胨17.0g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，溶剂为纯化水，pH7.3±0.2；TSA固体培养基组成：胰酪胨15.0g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g/L，氯化钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，琼脂15.0g/L，溶剂为纯化水，pH7.3±0.2；发酵培养基组成：胰酪胨1.7g/L，大豆木瓜蛋白酶水解物0.3g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸氢二钾0.25g/L，葡萄糖0.25g/L，溶剂为纯化水，pH7.3±0.2。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述鞘氨醇杆菌SC015菌液按如下步骤制备：将发酵液600rpm离心30min后，去上清，加入PBS缓冲液，吹打混匀，再次600rpm离心，重复加入PBS缓冲液和离心三次后，取沉淀加入PBS缓冲液吹打混匀，获得鞘氨醇杆菌SC015的PBS混合液；用PBS缓冲液稀释菌液至OD600在0.4-0.5之间，获得鞘氨醇杆菌SC015菌液。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述滤膜为正电荷滤膜。
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