CN108004165A - 一株细菌及其发酵产物在防止烟用料液腐败变质中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株细菌及其发酵产物在防止烟用料液腐败变质中的应用，属于香精香料防腐保质技术领域。本发明所用的细菌Sphingobacterium nematocida M103菌株，M103菌株已于2017年11月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.14922；用M103菌株制备的M103菌株发酵产物冻干粉按烟用料液的体积比1%‑5%添加能有效抑制料液中细菌和真菌的总数，延长料液保质期，为烟用料液的防腐保质提供了安全、高效的技术方法。

Description

一株细菌及其发酵产物在防止烟用料液腐败变质中的应用
技术领域：
本发明涉及一株细菌的发酵产物在防止烟用料液腐败变质中的应用，属于香精香料防腐保质技术领域。
背景技术：
烟用香精香料是指添加于烟草及烟草制品，起增强或修饰烟草制品风格或改善烟草制品品质的添加剂[1]，具有赋予卷烟产品独特风格、改善烟气质量、增进产品可接受性等作用，是构成卷烟品牌风格的重要因素[2]。烟用香精香料在储存过程中存在变质问题，引起变质的因素包括物理因素、化学因素和生物因素，其中微生物污染引起的腐败变质较为严重[4]。
菌落总数和大肠菌群是反映食品及其原材料在生产和使用过程中是否符合卫生要求的重要指标[5]。GB 30616-2014《食品安全国家标准 食品用香精》明确规定菌落总数（CFU/g或CFU/mL）：乳化香精≤5000，浆（膏）状香精、粉末香精≤30000。烟草行业标准YC292-2009《烟用添加剂 枣子提取物》规定细菌落总数限量要求为≤1000 CFU/g，霉菌≤200CFU/g［6］。研究表明，微生物（细菌和霉菌）总数可用作烟用香料保质期判定的单项指标[4]。
目前，香精香料主要通过添加化学防腐剂以杀灭污染微生物或抑制其繁殖[7]。微生物源防腐剂是理想的天然食品防腐剂，与化学防腐剂相比，具有安全、无毒、高效等特点，被广泛用于食品的防腐保质[8]。Sphingobacterium nematocida是2012年作为新种报道的一种杀线虫细菌[9]；该微生物拮抗真菌和细菌的特性，其在香精香料中的应用至今未见公开报道。
参考文献：
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[8] 邢宇, 郭丽娜, 孙伟. 微生物源天然防腐剂在食品上的应用研究[J]. 生物技术, 2012, 22(6):93-96。
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发明内容
本发明的目的在于提供一株细菌及其发酵产物在防止烟用料液的腐败变质中的应用。
本发明从烟草内生菌中筛选到一株细菌，其发酵产物能拮抗多种真菌和细菌，为烟用料液的防腐保质提供一种安全、有效的技术方法。
本发明具体是这样实现的：
本发明从云南烤烟品种K326新鲜叶片中分离了一批内生细菌，以黄曲霉（Aspergillus flavus）和大肠杆菌（Escherichia coli）为靶标，筛选到具有拮抗多种真菌和细菌的微生物Sphingobacterium nematocida M103菌株。M103菌株已于2017年11月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号：CGMCC No.14922。
Sphingobacterium nematocida M103菌株在LB培养基（胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，氯化钠 10 g，琼脂18g，补水至1000 ml，pH 6.8）上菌落黄色，边缘圆形，中间稍凸起，细胞圆柱状，长1.0-1.5 µm，直径0.4-0.8 µm，为革兰氏阴性菌；该细菌生长的最适温度为28℃、最适pH值为7。
M103菌株发酵产物冻干粉经如下步骤得到：
(1)、M103菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到LB培养基斜面上，28℃下培养2天获得试管斜面种子；
(2)、M103菌株液体种子的培养：将斜面种子接种到三角瓶中的LB液体培养基中，28℃，200 rpm条件下培养2天获得液体种子；
(3)、M103菌株发酵罐大量培养：将液体种子按1-5％（V/V）的比例接入发酵罐中的LB液体培养基中，在20-1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵时间2-4天，得菌株发酵液；
(4)、M103菌株发酵产物的制备：取5升M103菌株的发酵液，在10000 rpm下离心30分钟，收集上清液，取4.5 L上清液用旋转蒸发仪浓缩至100 mL，加入10 g脱脂奶粉作细胞抗冻保护剂，充分混匀，经冷冻干燥后获得M103菌株发酵产物冻干粉。
所述的M103菌株发酵产物冻干粉作为控制烟用料液中微生物数量和延长烟用料液保质期应用时，其添加量为烟用料液体积的1%-5%。
将本发明的M103菌株的发酵产物加到烟用料液中，能有效降低料液中真菌和细菌的数量，延长保质期；对防止烟用料液的变质具有成本低、效果好的特点。为烟用料液的防腐保质提供了安全、高效的技术方法。
Sphingobacterium nematocida M103菌株已于2017年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No. 14922，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式：
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
从云南烤烟品种K326新鲜叶片中分离了一批内生细菌，以黄曲霉（Aspergillus flavus）和大肠杆菌（Escherichia coli）为靶标，筛选到具有拮抗多种真菌和细菌的微生物Sphingobacterium nematocida M103菌株。
Sphingobacterium nematocida M103菌株在LB培养基（胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，氯化钠 10 g，琼脂18g，补水至1000 ml，pH 6.8）上菌落黄色，边缘圆形，中间稍凸起，细胞圆柱状，长1.0-1.5 µm，直径0.4-0.8 µm，为革兰氏阴性菌；该细菌生长的最适温度为28℃、最适pH值为7。
菌株的培养
1）M103菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到LB培养基斜面上，25-37℃下培养1-5天后获得斜面种子，适宜的培养条件是28℃下培养2天。
2）M103菌株液体种子的培养：将斜面种子接种到三角瓶中的液体培养基（固体培养基不添加琼脂）中，25-37℃，50-350 rpm条件下摇床培养2-7天。最适培养条件为28℃，200 rpm条件下培养2天。
3）M103菌株发酵罐大量培养：将液体种子按1-5％（V/V）的比例接入发酵罐中的LB液体培养基中，在20-1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵时间2-4天，得菌株发酵液。
菌株发酵产物的制备
取5升M103菌株的发酵液，在10000 rpm下离心30分钟，收集上清液。取4.5 L上清液用旋转蒸发仪浓缩至100 mL，加入10 g脱脂奶粉作细胞抗冻保护剂，充分混匀，经冷冻干燥后获得M103菌株发酵产物冻干粉；以10%脱脂奶粉水溶液冻干粉为对照样品。
菌株发酵产物的应用
将M103菌株发酵产物冻干粉作为控制烟用料液中微生物数量和延长烟用料液保质期应用时，其添加量为烟用料液体积的1%-5%。
、M103菌株发酵产物抑制烟用料液中细菌数量的效果试验
烟用料液产品：Y1002、Y1015和Y1043料液各1瓶（100 毫升/瓶，密封包装），由某香精香料企业提供。
试验设置：从每种料液取1 mL样品若干份于离心管中, 按体积比分别加入0.01g、0.03 g、0.05 g M103菌株发酵产物冻干粉或10%脱脂奶粉冻干粉，使添加物的浓度分别为1%、3%和5%，每个浓度3个重复，用漩涡振荡器振荡离心管1分钟。用以下方法立即测定料液原液样品中的细菌总数；然后将所有样品置于28℃恒温箱中放置30天，然后采用传统的梯度稀释涂布平板法分别测定各处理样品中的细菌总数。
细菌总数的检测方法：取样品1 mL，用无菌水梯度稀释至10-5，分别取10-3，10-4，10-5浓度的稀释液0.1 mL 涂布一个LB平板，每个浓度设10个重复。平板置于37℃培养箱中培养3天后察看各稀释度的平板菌落数，选取菌落数50-100个/皿的稀释度平板用于计数统计。
细菌总数（个/mL）=每皿平均菌落数×稀释倍数×10
试验结果：表1显示，Y1002、Y1015、Y10433种料液原液拆开原厂包装时的细菌总数分别为345.2、268.7和446.7个/毫升，均低于烟草行业烟用添加剂标准YC 292-2009规定的细菌上限1000个/毫升。料液原液于28℃下放置30天时，细菌总数分别为3364.2、2674.1和4685.3个/毫升，均超过了烟草行业标准烟用添加剂标准YC 292-2009规定的细菌上限1000个/毫升，说明料液中污染细菌在储存过程中容易生长繁殖。添加1%、3%、5%的脱脂奶粉冻干粉时，28℃下放置30天时3种料液中细菌总数与刚拆开包装的原液相比均显著增加，且细菌总数随脱脂奶粉冻干粉浓度的增加而增加，说明脱脂奶粉对抑制料液中细菌的繁殖无作用。添加1%的M103菌株发酵产物冻干粉，28℃下放置30天时Y1002、Y1015、Y10433种料液中的细菌总数略高于刚拆开包装的原液，但仍低于1000个/毫升的行业标准上限；添加3%、5%的M103菌株发酵产物冻干粉，28℃下放置30天时3种料液中的细菌总数均低于刚拆开包装的原液，说明添加M103菌株发酵产物冻干粉能有效抑制料液中细菌的繁殖。
表1 烟用料液中添加M103菌株发酵产物或10%脱脂奶粉的细菌数量（个/毫升）
5. M103菌株发酵产物抑制烟用料液中真菌数量的效果试验
烟用料液产品：Y1002、Y1015和Y1043料液各1瓶（100 毫升/瓶，密封包装），由某香精香料企业提供。
试验设置：从每种料液取1 mL样品若干份于离心管中,按体积比分别加入0.01 g、0.03 g、0.05 g M103菌株发酵产物冻干粉或10%脱脂奶粉冻干粉，使添加物的浓度分别为1%、3%和5%，每个浓度3个重复，用漩涡振荡器振荡离心管1分钟。用以下方法立即测定料液原液样品中的真菌总数；然后将所有样品置于28℃恒温箱中放置30天，然后采用传统的梯度稀释涂布平板法分别测定各处理样品中的真菌总数。
真菌总数的检测方法：取样品1 mL，用无菌水梯度稀释至10-3，分别取10-1，10-2，10-3浓度的稀释液0.1 mL 涂布一个PDA培养基平板，每个浓度设10个重复。平板置于28℃培养箱中培养7天后察看各稀释度的平板菌落数，选取菌落数10-30个/皿的稀释度平板用于计数统计。
真菌总数（个/mL）=每皿平均菌落数×稀释倍数×10
试验结果：表2显示，Y1002、Y1015、Y10433种料液原液拆开原厂包装时的真菌总数分别为54.3、23.5和87.2个/毫升，均低于烟草行业烟用添加剂标准YC 292-2009规定的真菌上限200个/毫升。料液原液于28℃下放置30天时，真菌总数分别为343.6、272.4和414.7个/毫升，均超过了烟草行业标准烟用添加剂标准YC 292-2009规定的真菌上限200个/毫升，说明料液中污染真菌在储存过程中容易生长繁殖。添加1%、3%、5%的脱脂奶粉冻干粉时，28℃下放置30天时3种料液中真菌总数与刚拆开包装的原液相比均显著增加，且真菌总数随脱脂奶粉冻干粉浓度的增加而增加，说明脱脂奶粉对抑制料液中真菌的繁殖无作用。添加1%的M103菌株发酵产物冻干粉，28℃下放置30天时Y1002、Y1015、Y10433种料液中的真菌总数略高于刚拆开包装的原液，但仍低于200个/毫升的行业标准上限；添加3%、5%的M103菌株发酵产物冻干粉，28℃下放置30天时3种料液中的真菌总数均低于刚拆开包装的原液，说明添加M103菌株发酵产物冻干粉能有效抑制料液中真菌的繁殖。
表2 烟用料液中添加M103菌株发酵产物或10%脱脂奶粉的真菌数量（个/毫升）
6. M103菌株发酵产物延长烟用料液保质期的效果试验
烟用料液样品：在Y1015料液中按体积比分别添加1%、3%、5%的M103菌株发酵产物冻干粉，100 毫升/瓶，密封包装，由某香精香料企业提供。
试验设置：将料液样品分别置于30℃的恒温箱中放置不同时间（10天、20天、30天）后取样按上述方法测定样品中的细菌总数和真菌总数，以细菌、真菌数量的总和代表样品的微生物数量，每处理3个重复。以未添加M103菌株发酵产物冻干粉的相应料液样品为对照；
试验结果：表3显示，未添加M103菌株发酵产物的Y1015料液对照样品在30℃下存放10天时，微生物数量为768.4个/毫升，低于烟草行业烟用添加剂标准YC 292-2009规定的微生物上限1200个/毫升；存放20天、30天后微生物数量分别1341.2、3641.5个/毫升，超出了烟草行业烟用添加剂标准YC 292-2009规定的微生物上限标准。添加1%、3%、5%的M103菌株发酵产物冻干粉的料液样品在30℃下存放10、20、30天时，样品中微生物数量在148.2-813.5个/毫升之间，均符合烟草行业烟用添加剂标准YC 292-2009的规定；其中添加5%的M103菌株发酵产物冻干粉的效果最好，第30天时微生物总数仅为514.6个/毫升。以上结果表明M103菌株发酵产物冻干粉对烟用料液中微生物繁殖的抑制效果显著，将料液的保质期从10天延长至30天。
表3 M103菌株发酵产物对烟用料液（软）微生物数量（个/毫升）的影响
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (3)

1.一株细菌，其特征在于：所述的细菌为Sphingobacterium nematocida M103菌株，该菌株2017年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.14922。
2.权利要求1所述的细菌的发酵产物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)、M103菌株试管斜面种子培养：将该菌株的菌体接种到LB培养基斜面上，28℃下培养2天获得试管斜面种子；
(2)、M103菌株液体种子的培养：将斜面种子接种到三角瓶中的LB液体培养基中，28℃，200 rpm条件下培养2天获得液体种子；
(3)、M103菌株发酵罐大量培养：将液体种子按1-5％（V/V）的比例接入发酵罐中的LB液体培养基中，在20-1000升发酵罐中的培养条件控制在：温度26-32℃，搅拌速度150-250rpm，发酵时间2-4天，得到M103菌株的发酵液；
（4）发酵产物的制备：取5升M103菌株发酵液，在10000 rpm下离心30分钟，收集上清液，取4.5 L上清液用旋转蒸发仪浓缩至100 mL，加入10 g脱脂奶粉作细胞抗冻保护剂，充分混匀，经冷冻干燥后获得M103菌株发酵产物冻干粉。
3.权利要求2所述的发酵产物的制备方法制备的M103菌株发酵产物冻干粉在防止烟用料液腐败变质中的应用，作为控制烟用料液中微生物数量和延长烟用料液保质期应用时，其M103菌株发酵产物冻干粉添加量为烟用料液体积的1%-5%。
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