CN116444694A - 一种透明质酸钙及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种透明质酸钙的制备方法，包括以下步骤：将透明质酸钠加入到含有钙盐的酸性置换液中，进行置换，得到透明质酸钙沉淀；用酸性洗涤液洗涤所述沉淀；将洗涤后的所述沉淀用中性脱水液进行脱水，真空干燥，得到透明质酸钙粉末；其中所述置换液中有机介质浓度为50％～90wt％，优选为60％～80wt％，钙盐浓度为0.5％～4wt％，优选为1％～3wt％，所述洗涤液中有机介质浓度为50％～90wt％，优选为60％～80wt％，所述脱水液中有机介质浓度大于等于90wt％。本发明通过高效率的置换，得到透明质酸钙成品，解决了目前透明质酸钙生产工艺中置换次数多、耗时长、钙盐消耗大、钙置换效率低、透明质酸钙溶液混浊的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种透明质酸钙及其制备方法和应用。
背景技术
透明质酸钙是透明质酸的钙盐，透明质酸是由N-乙酰氨基葡糖和D-葡糖醛酸双糖单位小红腹交替链接而成的高分子黏多糖，它广泛的存在与人体的各组织中，是皮肤、玻璃体、关节滑液和软组织的重要成分，具有独特的理化性质和生物学功能。其独特的黏弹性、保水性、渗透性。生物相容性及非免疫原性使其广泛的应用于眼科、骨科、化妆品和保健食品等多个领域。透明质酸钙在具有透明质酸保湿性，粘弹性外，还具有较好的水溶性，便于人体吸收，可作为保健产品或营养剂来为人体补充钙质，对关节炎起到一定预防作用，可增强人体免疫力及防止骨质疏松等功能，有具有修复组织损伤及保持关节润滑度可广泛应用于食品、保健品、医药、化妆品护肤等行业。
透明质酸钙现有制备工艺为两种：专利CN 1563108A一种制备低分子透明质酸钙的方法是将透明质酸钠酸降至合适的分子量，溶解后活性炭吸附后过滤，液体上柱后通过离子交换，与钙盐溶液水浴加热后浓缩，最后经沉淀，脱水，干燥后得到透明质酸钙粉末成品。本方法工艺较为复杂，收率低，周期长，使用设备多，不适合车间大规模生产。专利CN1326883C一种透明质酸钙的制备方法中是通过透明质酸钠与含有钙盐的有机介质，通过置换反应，将透明质酸钠中的钠离子置换为钙离子，制备出透明质酸钙成品，本方法制备过程中，置换次数较多，置换效率低，有机介质使用多，周期较长，且制备成品中可能残留较多的游离钙离子，透明质酸与钙离子结合不牢固，导致透明质酸钙产品质量不稳定，溶液浑浊。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本发明提供一种透明质酸钙及其制备方法和应用。
具体来说，本发明涉及如下方面：
1.一种透明质酸钙的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将透明质酸钠加入到含有钙盐的酸性置换液中，进行置换，得到透明质酸钙沉淀；
用酸性洗涤液洗涤所述沉淀；
将洗涤后的所述沉淀用中性脱水液进行脱水，真空干燥，得到透明质酸钙粉末；
其中所述置换液中有机介质浓度为50％～90wt％，优选为60％～80wt％，钙盐浓度为0.5％～4wt％，优选为1％～3wt％。
2.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述有机介质为与水相容性好、但透明质酸钠或透明质酸钙在其中不溶或微溶的有机介质，优选为醇类有机溶剂或酮类有机溶剂，更优选为乙醇、甲醇或丙酮。
3.根据项1所述的制备方法，其特征在于，透明质酸钠的分子量为3kDa～2200kDa。
4.根据项1所述的制备方法，其特征在于，透明质酸钠与钙盐的质量比为1:0.5～5，优选为1:1～3。
5.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述置换液和所述洗涤液的pH分别为5.0～7.0，所述洗涤液中有机介质浓度为50％～90wt％，优选为60％～80wt％，
所述脱水液中有机介质浓度大于等于90wt％。
6.根据项1所述的制备方法，其特征在于，置换的次数为1～4次，优选为1～2次，置换时间为1～24h，优选为5～16h；优选地，洗涤次数为1～5次，优选为2～3次；进一步优选地，脱水次数为1～5次，优选为2～3次。
7.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所述钙盐选自氯化钙、硝酸钙、乙酸钙、甲酸钙、亚硝酸钙中的一种或两种以上。
8.根据项1所述的制备方法，其特征在于，所得到的透明质酸钙粉末中透明质酸钙的含量大于等于90wt％，在1wt％水溶液中的透光率大于等于99％。
9.一种透明质酸钙，其通过项1-8中任一项所述的方法制备。
10.根据项9所述的透明质酸钙，其特征在于，所述透明质酸钙用于损伤修复、提高皮肤角质层含水量、减少皮肤细纹。
本发明通过高效率的置换，得到透明质酸钙，解决了目前透明质酸钙生产工艺中置换次数多、耗时长、钙盐消耗大、钙置换效率低、透明质酸钙溶液混浊的问题。具体地，本发明制备透明质酸钙的收率在93.75％以上，透光率在98.5％以上。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。
本发明提供一种透明质酸钙的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将透明质酸钠加入到含有钙盐的酸性置换液中，进行置换，得到透明质酸钙沉淀；
用酸性洗涤液洗涤所述沉淀；
将洗涤后的所述沉淀用中性脱水液进行脱水，真空干燥，得到透明质酸钙粉末。
其中含有钙盐的酸性置换液为经过有机滤膜过滤得到的，其中滤膜孔径要求0.2～3微米，优选0.22～1.2微米。
置换液为酸性，包括钙盐、有机介质和水。置换液的pH可以采用不影响置换的酸进行调节，例如冰醋酸等。其中所述置换液中有机介质浓度为50％～90wt％，例如可以为50wt％、55wt％、60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％，优选为60％～80wt％。钙盐浓度为0.5％～4wt％，例如可以为0.5wt％、1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％，优选为1％～3wt％。
其中的有机介质为与水相容性好、但透明质酸钠或透明质酸钙在其中不溶或微溶的有机介质，优选为醇类有机溶剂或酮类有机溶剂，更优选为乙醇、甲醇或丙酮。
所述钙盐选自氯化钙、硝酸钙、乙酸钙、甲酸钙、亚硝酸钙中的一种或两种以上。
置换步骤中透明质酸钠的分子量可以根据所需制备的透明质酸钙的分子量进行调整。在一个具体的实施方式中，所述透明质酸钠的分子量为3kDa～2200kDa，例如可以为3kDa、10kDa、50kDa、100kDa、200kDa、300kDa、400kDa、500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、1100kDa、1200kDa、1300kDa、1400kDa、1500kDa、1600kDa、1700kDa、1800kDa、1900kDa、2000kDa、2100kDa、2200kD等。
在一个具体的实施方式中，所述有机介质为乙醇。
在一个具体的实施方式中，所述置换液的pH为5.0～7.0，例如可以为5.0、5.5、6.0、6.5、6.8、6.9等。
进行置换时通常在搅拌下进行置换。置换的次数和时间可以根据情况进行调整。在一个具体的实施方式中，置换的次数为1～4次，例如可以为1次、2次、3次、4次，优选为1～2次。置换时间为1～24h，例如可以为1h、2h、5h、8h、10h、12h、15h、18h、20h、24h，优选为5～16h。
洗涤液为酸性，包括有机介质和水。洗涤液的pH可以采用不影响洗涤的酸进行调节，例如冰醋酸等。所述洗涤液中有机介质浓度为50％～90wt％，例如可以为50wt％、55wt％、60wt％、65wt％、70wt％、75wt％、80wt％、85wt％、90wt％，优选为60％～80wt％。
有机介质如上所述，在一个具体的实施方式中，所述有机介质为乙醇。
在一个具体的实施方式中，所述洗涤液的pH为5.0～7.0例如可以为5.0、5.5、6.0、6.5、6.8、6.9等。
洗涤液与透明质酸钙沉淀的体积比为1～3:1，例如可以为1:1、2:1、3:1，优选1～2:1。
洗涤的次数可以根据情况进行调整。在一个具体的实施方式中，洗涤的次数为1～5次，例如可以为1次、2次、3次、4次、5次，优选为2～3次。
脱水液为中性，包括有机介质和水。所述脱水液中有机介质浓度大于等于90wt％，例如可以为90wt％、91wt％、92wt％、93wt％、94wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％、99wt％。
脱水的次数可以根据情况进行调整。在一个具体的实施方式中，脱水的次数为1～5次，例如可以为1次、2次、3次、4次、5次，优选为2～3次。
在一个具体的实施方式中，采用上述方法所得到的透明质酸钙的分子量为2kDa～2000kDa。
在一个具体的实施方式中，所得到的透明质酸钙粉末中钙离子含量为3.0～10.0wt％，例如可以为3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％。
在一个具体的实施方式中，所得到的透明质酸钙粉末在1wt％水溶液中的透光率大于等于99％，例如为99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％，99.6％，99.7％，99.8，99.9％等。
在一个具体的实施方式中，所得到的透明质酸钙粉末中透明质酸钙的含量大于等于90wt％，例如为90wt％、91wt％、92wt％、93wt％、94wt％、95wt％、96wt％、97wt％、98wt％、99wt％等。
在一个具体的实施方式中，所得到的透明质酸钙粉末中钠离子的含量下小于等于3％，例如为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.8％、2.0％、2.8％、3.0％等。
在本发明中，所得到的透明质酸钙分子量的测定方法为特性黏数法。具体测定方法如下。
供试液制备：精密称供试品约100mg(W1)(注：该称样量不确定，当特性黏数低于3.0dL/g或分子量低于10万时应增加称样量)至100ml容量瓶中，加0.2mol/L氯化纳溶液定容，摇匀；再称取该溶液一定量(W2)(注:该称样量不确定，根据测定的供试液的流出时间调整)至100ml容量瓶中，加0.2mo1/L氯化钠溶液定容，摇匀，作为供试液。
溶剂流出时间(t0)的测定：取滤过的0.2mol/L氯化钠溶液适量，弃去初滤液，取续滤液(不得少于7ml)注入洁净、干燥的乌氏黏度计，将黏度计垂直固定于恒温水浴(温度25℃土0.1℃)中，放置15分钟，准确记录流出时间，重复测定至少两次，取平均值为空白液的流出时间(t0)。
供试液流出时间(t1)的测定：取供试液适量，按照溶剂流出时间的测定方法进行测定，重复测定至少两次，两次测定值相差不得超过0.2秒，取平均值为供试液的流出时间(t1)。
t1/t0应在1.3～1.5之间，否则应调整供试液浓度后再测。
采用下式计算供试液浓度C(g/dL)：
ρ25＝1.000g/ml(供试液在25℃的密度)
采用下式计算特性黏数：
计算透明质酸钙平均分子量：
特性粘度[η](dL/g)＝3.6×10-4M0.78(M：平均分子量)
在本发明中，所得到的透明质酸钙的透光率的测定方法为光吸收法。具体测定方法如下。
取样品0.1g至盛有100ml水的锥形瓶中，在冰箱中放置过夜，溶解后，将样品溶液倒入1ml比色皿中，以水作空白，在550nm波长处测定溶液的透光率。
在本发明中，所得到的透明质酸钙的钙含量的测定方法为火焰原子吸收法。具体测定方法如下。
标准曲线制备：
精密称取钙单元素溶液标准物质(1000μg/ml)1ml至100ml容量瓶中，用1％硝酸定容，得标准贮备液(10μg/m1)。分别量取标准贮备液0、0.2、0.4、0.8、1.6ml于5个洁净的10ml容量瓶中，用1％硝酸定容。得钙浓度分别为0、0.2、0.4、0.8、1.6μg/m1的钙标准溶液。
供试品溶液：精密称取供试品50mg至100ml容量瓶中，加入硝酸1ml，水浴加热至完全浴解，用水定容，取上述溶液1ml至50ml容量瓶中，用1％硝酸定容，即得。
测定：用空白溶液调零后，取各溶液适量，以火焰原子吸收法测定，检测波长为213.9nm，测定吸光度。以测试溶液吸光度(Y)对钙的浓度(X，μg/m1)进行线性回归，绘制标准曲线，采用下式计算供试液中钙浓度。
式中，Ci—供试液中钙浓度，μg/m1；
W—供试品称样量，mg；
h％—供试品干燥失重。
在本发明中，糖醛酸含量采用硫酸-咔唑比色法进行检测。
本发明中，收率为出料量与投料量之比，计算公式为：
收率＝透明质酸钙出料量/透明质酸钠投料量×100％
本发明还提供上述方法制备得到的透明质酸钙。
所述透明质酸钙具有透明质酸的各种功能，例如可以用于损伤修复、提高皮肤角质层含水量、减少皮肤细纹。
实施例1
配制4.0wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液2.5T，氯化钙100kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为5.6，置换液浓度为80wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量1480kDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为24h。一次置换完成后，停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约24h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入与沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为78％、pH为5.6，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入与沉淀体积等倍体积的浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为20h，出料得到透明质酸钙19.4kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为7.2％，钠含量为0.23％，收率为97％，分子量为127万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.5％，糖醛酸含量48.16％。
实施例2
配制4.0wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液1.5T，氯化钙60kg使用冰乙酸调节乙醇pH为6.2，置换液浓度为80wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量1480kDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为24h。一次置换完成后，停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约24h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入与沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为75％、pH为5.8，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为22h，出料得到透明质酸钙19.2kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为6.8％，钠含量为0.35％，收率为96％，分子量为130万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.3％，糖醛酸含量47.93％。
实施例3
配制4.0wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液0.5T，氯化钙20kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为6.0，置换液浓度为80wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量1480kDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为24h。一次置换完成后，停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约24h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入与沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为78％、pH为6.20，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为22h，出料得到透明质酸钙19.27kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为5.0％，钠含量为0.54％，收率为96.35％，分子量为132万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.4％，糖醛酸含量48.54％。
实施例4
配制4.0wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液0.25T，氯化钙20Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为5.8，置换液浓度为75wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量1360KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为24h。一次置换完成后，停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约24h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为72％、pH为6.2，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为23h，出料得到透明质酸钙19.30kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为4.8％，钠含量为0.62％，收率为96.51％，分子量为115万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.2％，糖醛酸含量48.32％。
实施例5
配制3.0wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液1.8T，氯化钙60Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为6.5，置换液浓度为80wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量320KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为24h。一次置换完成后，停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约24h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为75％、pH为6.32，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为20h，出料得到透明质酸钙19.34kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为5.6％，钠含量为0.32％，收率为96.7％，分子量为29万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.7％，糖醛酸含量48.33％。
实施例6
配制3.0wt％乙酸钙-乙醇(酸性)置换液1.8T，乙酸钙60Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为6.5，置换液浓度为80wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量320KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为16h。一次置换完成后，停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约16h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为78％、pH为5.82，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为22h，出料得到透明质酸钙19.28kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为5.5％，钠含量为0.35％，收率为96.4％，分子量为27万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.5％，糖醛酸含量48.41％。
实施例7
配制4.0wt％硝酸钙-乙醇(酸性)置换液2.0T，硝酸钙60Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为6.8，置换液浓度为70wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量320KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为24h。一次置换完成后，停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约24h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为78％、pH为5.82，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为22h，出料得到透明质酸钙19.28kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为6.2％，钠含量为0.34％，收率为96.4％，分子量为25万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.5％，糖醛酸含量48.76％。
实施例8
配制2.0wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液5T，氯化钙100Kg，使用盐酸调节乙醇pH为5.5，置换液浓度为76wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量108KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为5h。停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，加入剩余置换液继续进行二次置换，共计置换2次，每次约5h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为77％、pH为5.93，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为21h，出料得到透明质酸钙18.84kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为6.7％，钠含量为0.39％，收率为94.18％，分子量为99万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.4％，糖醛酸含量48.16％。
实施例9
配制1.0wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液2T，氯化钙20Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为6.5，置换液浓度为75wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量110KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为5h。停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，加入剩余置换液继续进行二次置换，共计置换2次，每次约5h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为72％、pH为5.99，洗涤次数为2次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为22h，出料得到透明质酸钙18.35kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为5.3％，钠含量为0.65％，收率为93.75％，分子量为102万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.5％，糖醛酸含量48.18％。
实施例10
配制1wt％乙酸钙-乙醇(酸性)置换液10T，乙酸钙10Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为5.2，置换液浓度为80wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量30KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为1h。停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换2次，每次约3h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为79％、pH为6.07，洗涤次数为2次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为21h，出料得到透明质酸钙19.78kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为3.6％，钠含量为1.8％，收率为96.1％，分子量为4.7万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.4％，糖醛酸含量48.79％。
实施例11
配制1wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液10T，氯化钙10Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为5.8，置换液浓度为78wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量450KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为1h。停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约1h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为78％、pH为6.21，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为21h，出料得到透明质酸钙19.67kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为3.5％，钠含量为1.4％，收率为98.35％，分子量为3.9万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.4％，糖醛酸含量48.34％。
实施例12
配制4wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液1.5T，氯化钙60Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为6.3，置换液浓度为90wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量8.6KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为20h。停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约20h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为78％、pH为6.21，洗涤次数为2次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为21h，出料得到透明质酸钙19.47kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为6.5％，钠含量为0.19％，收率为97.36％，分子量为0.98万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为98.5％，糖醛酸含量48.14％。
对比例1
配制6wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液1T，氯化钙60Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为5.9，置换液浓度为55wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量1570KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为0.5h。停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约0.5h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为50％、pH为4.3，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为20h，出料得到透明质酸钙19.02kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为3.2％，钠含量为2.8％，收率为95.1％，分子量为138万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为85.7％，糖醛酸含量46.56％。
对比例2
配制4wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液1.5T，氯化钙6Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为5.6，置换液浓度为70wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量1650KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为24h。停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换2次，每次约24h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为75％、pH为6.45，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为23h，出料得到透明质酸钙19.13kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为2.72％，钠含量为3.2％，收率为95.64％，分子量为115万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.1％，糖醛酸含量47.17％。
对比例3
配制3wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液1.8T，氯化钙60Kg，使用冰乙酸调节乙醇pH为7.5，置换液浓度为76wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量380KDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为5h。停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换2次，每次约5h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为75％、pH为6.45，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为23h，出料得到透明质酸钙19.46kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为6.9％，钠含量为0.62％，收率为97.3％，分子量为22万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为88.1％，糖醛酸含量48.67％。
对比例4
配制4.0wt％氯化钙-乙醇(酸性)置换液1.5T，氯化钙60kg使用冰乙酸调节乙醇pH为6.2，置换液浓度为45wt％。使用0.45微米聚丙烯滤膜过滤后备用。
准确称取20kg透明质酸钠原料(分子量1480kDa)投入到置换液中，开启搅拌进行置换，置换时间为24h。一次置换完成后，停止搅拌静置约1-2h，抽掉多余上清，共计置换1次，每次约24h。
置换完成后，静置后将上清抽出，加入与沉淀体积等倍体积的洗涤液进行洗涤，洗涤液乙醇浓度为75％、pH为5.8，洗涤次数为1次，每次洗涤时间为3h。
洗涤完成后将多余上清抽出，加入沉淀体积等倍体积的浓度为90％的乙醇脱水液进行脱水，脱水时间为0.5～1h，脱水3次。保证上清酒精度在90％以上，然后转入三合一干燥机进行真空干燥，干燥温度为45℃，真空度为0.10MPa，干燥时间为22h，出料得到透明质酸钙16.7kg。
检测样品指标得出透明质酸钙的钙离子含量为6.5％，钠含量为0.81％，收率为83.5％，分子量为130万，0.1％透明质酸钙溶液的透光率为99.2％，糖醛酸含量47.75％。
上述各实施例和对比例的反应条件如表1所示，各实施例和对比例所得到的透明质酸钙的检测结果如表2所示。
表1实施例和对比例制备方法中的条件
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表2实施例和对比例得到的透明质酸钙的测试结果
由上述结果可以看出，如实施例2、5与对比例1，4中可以看出，若钙盐浓度太高，为了提高钙盐溶解度，则需降低乙醇的浓度，乙醇浓度过低，则会导致透明质酸钙的收率较低；实施例4与对比例2中可以看出，尽管钙盐浓度不变，置换液酒精度相近的条件下，透明质酸钠和钙盐的投料比中钙盐浓度太低，即使增加置换次数，但同样会导致产品中钙含量偏低，钠含量偏高；实施例6与对比例3中可以看出置换液pH过高会导致钙盐的溶解度降低，产品最终溶液浑浊。
试验例
试验例1透明质酸钙的损伤修复功效
(1)溶液配制。将实施例12中制备的透明质酸钙溶于无血清1640培养液中，0.22μm滤膜过滤除菌，调节浓度至0.025％。
(2)模拟划痕。将ibidi小室粘贴在24孔板的孔靠近中心位置，使各孔小室方向保持一致。小室的侧壁底部与培养板紧密接触，细胞无法在此处生长，形成模拟划痕。
(3)细胞接种。L929细胞调节密度至1×105/mL，向ibidi小室的两个小孔各接种70μL，小室外加入200μL含血清1640培养液，37℃、5％CO2条件下培养24h。
(4)给药。移除ibidi小室，弃培养液，加入透明质酸钙的无血清培养液。
(5)数据处理。继续培养24h，用Image J软件计算修复面积。
细胞迁移率(％)＝(1-加药后划痕区域面积/初始划痕区域面积)×100
结果和分析：
结果表3所示，与模型组对比，透明质酸钙在0.025％浓度下，表现出促进细胞迁移和创伤愈合的作用。其中，愈合率等于细胞迁移率。
表3透明质酸钙的损伤修复的影响
其中，T0划痕面积表示初始划痕面积，T24h划痕面积表示使用透明质酸钙24h后的数值。
试验例2透明质酸钙人体皮肤功效评价
招募健康受试者10名，用半脸对照的方法进行测试，
左脸使用含实施例12制备的，浓度0.5％透明质酸钙的乳液，右脸使用空白乳液。
于使用透明质酸钙产品前后分别检测受试者面部苹果肌区域的角质层含水量、经皮水分散失量、纹理面积。
受试者洁面后30分钟，检测左、右半脸苹果肌区域的角质层含水量、经皮水分散失量、纹理面积的初始值，然后分别使用等量的透明质酸钙乳液和空白乳液，早晚各使用一次，并于使用后1W、2W、4W再次检测所有指标。
其中，角质层含水量使用皮肤水分测试仪Corneometer CM 825(Courage+Khazaka，德国)进行检测。
经皮水分散失量使用皮肤水分散失测定仪TM Hex(Courage+Khazaka，德国)进行检测。
纹理面积使用VISIACR面部图像分析系统(Canfield，美国)进行检测。
结果如表4-表6所示。
表4透明质酸钙对角质层含水量的影响
| T0(％) | T1W(％) | T2W(％) | T4W(％) | |
| 透明质酸钙 | 100.00 | 132.55 | 145.47 | 133.83 |
| 空白 | 100.00 | 131.41 | 135.62 | 128.60 |
其中，T0表示初始含水量，以100％表示，T1W表示使用透明质酸钙1周后角质层含水量与初始含水量的比值，T2W表示使用透明质酸钙2周后角质层含水量与初始含水量的比值，T4W表示使用透明质酸钙4周后角质层含水量与初始含水量的比值。
结果显示，与空白组相比，透明质酸钙在使用后1周-4周，角质层含水量较高(提高5％-10％)，说明透明质酸钙可提高皮肤角质层含水量。
表5透明质酸钙对经皮水分散失量的影响
| T0(％) | T1W(％) | T2W(％) | T4W(％) | |
| 透明质酸钙 | 100.00 | 81.05 | 93.27 | 98.13 |
| 空白 | 100.00 | 92.37 | 98.45 | 98.98 |
其中，T0表示初始含水量，以100％表示，T1W表示使用透明质酸钙1周后角质层含水量与初始含水量的比值，T2W表示使用透明质酸钙2周后角质层含水量与初始含水量的比值，T4W表示使用透明质酸钙4周后角质层含水量与初始含水量的比值。
结果显示，与空白组相比，透明质酸钙在使用后2周内经皮水分散失量明显降低，特别是第1周时降低11％.说明透明质酸钙可减少经皮水分散失量。
表6透明质酸钙对皮肤细纹的影响
| T0(％) | T1W(％) | T2W(％) | T4W(％) | |
| 透明质酸钙 | 100.00 | 111.52 | 112.89 | 112.15 |
| 空白 | 100.00 | 111.56 | 114.31 | 118.66 |
其中，T0表示初始纹理面积，以100％表示，T1W表示使用透明质酸钙1周后纹理面积与初始纹理面积的比值，T2W表示使用透明质酸钙2周后纹理面积与初始纹理面积的比值，T4W表示使用透明质酸钙4周后纹理面积与初始纹理面积的比值。
结果显示，透明质酸钙在使用2周后开始发挥减少皮肤细纹的功效，至使用4周时与空白组间差异显著(p<0.05)，比空白组纹理面积减少6％。说明透明质酸钙有减少皮肤细纹的功效。
Claims (10)
1.一种透明质酸钙的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将透明质酸钠加入到含有钙盐的酸性置换液中，进行置换，得到透明质酸钙沉淀；
用酸性洗涤液洗涤所述沉淀；
将洗涤后的所述沉淀用中性脱水液进行脱水，真空干燥，得到透明质酸钙粉末；
其中所述置换液中有机介质浓度为50％～90wt％，优选为60％～80wt％，钙盐浓度为0.5％～4wt％，优选为1％～3wt％。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述有机介质为与水相容性好、但透明质酸钠或透明质酸钙在其中不溶或微溶的有机介质，优选为醇类有机溶剂或酮类有机溶剂，更优选为乙醇、甲醇或丙酮。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，透明质酸钠的分子量为3kDa～2200kDa。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，透明质酸钠与钙盐的质量比为1:0.5～5，优选为1:1～3。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述置换液和所述洗涤液的pH分别为5.0～7.0，所述洗涤液中有机介质浓度为50％～90wt％，优选为60％～80wt％，所述脱水液中有机介质浓度大于等于90wt％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，置换的次数为1～4次，优选为1～2次，置换时间为1～24h，优选为5～16h；优选地，洗涤次数为1～5次，优选为2～3次；进一步优选地，脱水次数为1～5次，优选为2～3次。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述钙盐选自氯化钙、硝酸钙、乙酸钙、甲酸钙、亚硝酸钙中的一种或两种以上。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所得到的透明质酸钙粉末中透明质酸钙的含量大于等于90wt％，在1wt％水溶液中的透光率大于等于99％。
9.一种透明质酸钙，其通过权利要求1-8中任一项所述的方法制备。
10.根据权利要求9所述的透明质酸钙，其特征在于，所述透明质酸钙用于损伤修复、提高皮肤角质层含水量、减少皮肤细纹。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111678380.0A CN116444694A (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种透明质酸钙及其制备方法和应用 |
| PCT/CN2022/143332 WO2023125789A1 (zh) | 2021-12-31 | 2022-12-29 | 一种透明质酸钙及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111678380.0A CN116444694A (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种透明质酸钙及其制备方法和应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116444694A true CN116444694A (zh) | 2023-07-18 |
Family
ID=87122431
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111678380.0A Pending CN116444694A (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种透明质酸钙及其制备方法和应用 |
Country Status (1)
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|---|---|
| CN (1) | CN116444694A (zh) |
-
2021
- 2021-12-31 CN CN202111678380.0A patent/CN116444694A/zh active Pending
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