CN116410976A - 一种水稻gat转化事件gatv2-88-4的侧翼序列及其检测引物与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水稻GAT转化事件GATV2‑88‑4的侧翼序列及其检测引物与应用。本发明提供的侧翼序列包括如SEQ ID NO.1所示的左侧翼序列和如SEQ ID NO.2所示的右侧翼序列。本发明提供检测所述侧翼序列的特异性引物SEQ ID NO.9‑10和SEQ ID NO.11‑12。采用本发明提供的特异性引物对待测水稻的DNA样品进行PCR扩增，能够特异性地指示水稻第12号染色体非编码区第27241465‑27241510碱基处是否插入pC0308‑MMMaauCK5400的T‑DNA片段。本发明成功实现了对转基因水稻及其衍生系实施检测和安全管理。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及转基因水稻的安全评估和检测，具体地说，涉及一种水稻遗传智能化育种技术(GAT)转化事件外源插入片段的侧翼序列及其特异性性引物与应用。
背景技术
近年来，大豆、玉米、棉花和油菜等转基因作物已在很多国家获准种植和生产，转基因作物可加工成食品、饲料或食品添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全目前仍备受争议，需对转基因产品进行严格的监管。进行转基因作物的生物安全评价是转基因产品监管中的重要环节，包括鉴定转化事件在宿主基因组中的具体插入位点、根据插入位点判断宿主基因组插入失活或缺失的情况，进一步推测该转化事件对宿主的影响和可能导致的安全性问题。
由于外源插入片段在宿主植物基因组中的整合位置是随机的，每个外源插入片段左右端序列与宿主基因组序列拼接而成的插入位点侧翼序列是唯一的。因此，插入位点侧翼序列是区别不同转化事件的唯一性标识，是建立转基因植物品系特异性检测方法的重要技术资料。转化事件的特异性检测具有高度特异性，可准确识别不同的转基因作物品系。目前分离外源插入片段的侧翼序列主要以PCR技术为基础，建立的特异性检测方法包括反向PCR、外源接头介导PCR、半随机引物PCR、全基因组重测序技术等，其中半随机引物PCR中的热不对称交错PCR(Tail-PCR)、高效热不对称PCR(hiTail-PCR)或染色体步移法(GenomeWalking)是当前常见的使用方法。
遗传智能化育种技术(Genetic Automation Technology，GAT)是一种新型的杂交种子育制种技术，该技术可成功利用隐性核雄性不育系。GAT的核心思路是利用现代生物技术，将农作物花粉育性恢复基因、花粉败育基因、除草剂敏感基因、筛选标记基因等按特定顺序和方向紧密连锁地构建在GAT载体上，通过高通量基因转化技术导入到隐性核雄性不育系中，获得大量转化事件。
本发明基于已获得的具遗传稳定性且农艺性状优良的水稻GAT转化事件GATV2-88-4。明确了水稻GAT转化事件GATV2-88-4的分子特征、推进了GATV2-88-4的生物安全性评价工作。本发明以GATV2-88-4的T0代植株的DNA为模板，利用Tail-PCR分离其T-DNA侧翼序列，并根据T-DNA左右端序列和左右侧翼序列设计检测引物，建立了特异性检测水稻GAT转化事件GATV2-88-4的方法，同时检验该方法的特异性与灵敏度，为水稻GAT转化事件GATV2-88-4及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。
发明内容
本发明的目的是提供水稻GAT转化事件GATV2-88-4的插入位点及其侧翼序列，同时提供相应的检测引物。
水稻GAT转化事件GATV2-88-4已在会议摘要中公开(The 8th InternationalConference on Botany,Dec.4-6,2021,Progress of genetic automation technologybreeding system based on recessive genic male Sterility,Xiongxia Jin)，该会议论文的摘要中述及的“88-4”即为本转化事件GATV2-88-4。
具体地，本发明的目的是提供一种水稻遗传智能化育种技术(GAT)转化事件GATV2-88-4的外源载体插入片段的侧翼序列，并针对该侧翼序列提供对其进行特异性检测的DNA序列，例如PCR扩增引物序列。
第一方面，本发明提供水稻GAT转化事件GATV2-88-4外源插入载体的侧翼序列，所述侧翼序列的左侧翼序列如SEQ ID NO.1所示；所述侧翼序列的右侧翼序列如SEQ ID NO.2所示；本发明提供的侧翼序列，可以分别使用如SEQ ID NO.9-10所示和如SEQ ID NO.11-12所示的引物对扩增得到。
具体地，左侧翼序列由来源于水稻基因组第12号染色体的第1至121个碱基和来源于GATV2载体序列的第122至495个碱基共同组成，左侧翼序列是水稻GAT转化事件GATV2-88-4的外源插入载体5’端边界侧翼序列；
右侧翼序列由来源于水稻基因组第12号染色体的第1至553个碱基，和来源于GATV2载体序列的第554至1645个碱基组成，右侧翼序列是水稻GAT转化事件GATV2-88-4的外源插入载体3’端边界侧翼序列。
上述左翼及右翼序列是水稻GAT转化事件GATV2-88-4的特征序列，可用于区分水稻GAT转化事件GATV2-88-4与其他转基因/非转基因水稻，以及水稻GAT转化事件GATV2-88-4的定性检测和定量分析。
第二方面，本发明提供检测上述的侧翼序列的引物，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO.9-10所示和如SEQ ID NO.11-12所示。
根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护上述的侧翼序列或上述引物在检测或识别转基因水稻及其衍生产品中的应用。具体地，所述转基因水稻的第12号染色体非编码区27241465-27241510碱基处插入T-DNA片段。
第三方面，本发明提供一种PCR检测试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括如SEQID NO.9-10所示和如SEQ ID NO.11-12所示的检测引物。
在本发明提供的试剂或试剂盒中，还包括水、Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。
第四方面，本发明提供一种检测转基因水稻GATV2-88-4的方法，该方法检测水稻样品DNA中是否同时存在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。
使用上述的引物(SEQ ID NO.9-10所示和如SEQ ID NO.11-12所示的引物)或含有上述引物的试剂或试剂盒，以待测样品的DNA为模板，进行PCR扩增。
在本发明提供的方法中，根据PCR扩增产物，判断待测样品的12号染色体上的第27241465-27241510位核苷酸处是否插入pC0308-MMMaauCK5400的T-DNA片段；pC0308-MMMaauCK5400已在申请号为202010379287.9的中国专利中公开。
若如SEQ ID NO.9-10所示的引物对扩增出495bp的目的片段，和如SEQ ID NO.11-12所示的引物对扩增出1645bp目的片段，则说明样品中含有水稻GAT转化事件GATV2-88-4来源的成分。
在本发明提供的方法中，PCR扩增程序为：93-95℃1-2.5min；93-95℃20-40s；50-60℃20-40s；70-73℃1-1.5min；70-73℃5-6min；23-27℃1.5-2.5min，30-35个循环；优选地：94℃2min；94℃30s；55℃30s；72℃1min；72℃5min；25℃2min，30-35个循环。
本发明的有益效果是：
(1)本发明首次公布水稻遗传智能化育种技术(GAT)转化事件GATV2-88-4外源基因在水稻基因组中插入位点的侧翼序列；
(2)本发明首次确认水稻遗传智能化育种技术(GAT)转化事件GATV2-88-4外源基因在水稻基因组中插入位点的侧翼序列中不同碱基的来源，并确定外源载体插入水稻基因组序列的接合位点序列；
(3)利用本发明发现的侧翼序列，首次建立水稻遗传智能化育种技术(GAT)转化事件GATV2-88-4的特异性定性检测方法；
(4)本发明适用于对水稻遗传智能化育种技术(GAT)转化事件GATV2-88-4世代及其衍生系实施检测、监测和安全管理。
附图说明
图1是本发明实施例1中，水稻GAT转化事件GATV2-88-4喷施5x咪唑乙烟酸表型图；其中0d为未喷药之前，14d为喷药14d，WT为野生型，CK+为阳性对照(咪唑乙烟酸抗性植株)，88-4为GATV2-88-4。
图2是本发明实施例1中，水稻GAT转化事件GATV2-88-4喷施3g/L苯达松表型图；其中0d为未喷药之前，7d为喷药7d，14d为喷药14d，WT为野生型，CK+为阳性对照(苯达松敏感突变体)，88-4为GATV2-88-4。
图3是发明实施例1中，水稻GAT转化事件GATV2-88-4花粉育性与种子荧光图；其中ZH11为中花11，88-4(T0)为GATV2-88-4的T0代，88-4(T4)为GATV2-88-4的T4代。
图4是本发明实施例2中，水稻GAT转化事件GATV2-88-4转化事件左边界侧翼序列的Tail-PCRIII电泳图；其中，M为Marker；ddH2O为双蒸水；ZH11为非转基因粳稻中花11；9311为非转基因籼稻9311；P为GATV2载体质粒；88-4为水稻GAT转化事件GATV2-88-4。
图5是本发明实施例3中，水稻GAT转化事件GATV2-88-4在水稻基因组中的整合位点示意图；其中，水稻GAT转化事件GATV2-88-4的T-DNA插入水稻基因组12号染色体非编码区27241465-27241510碱基处。
图6是本发明实施例5中，水稻GAT转化事件GATV2-88-4特异性定性PCR扩增图；其中：WT为非转基因水稻基因DNA模板；88-4为水稻GAT转化事件GATV2-88-4基因组DNA模板。
具体实施方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
若未特别指明，本发明实例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得；若未具体指明，本发明实例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1获得水稻GAT转化事件GATV2-88-4
本实施例中，基于遗传智能化育种技术GAT，使用花粉育性恢复基因、花粉败育基因、除草剂敏感基因、筛选标记基因等按特定顺序和方向紧密连锁地构建在载体pC0308-MMMaauCK5400(GAT)上(本发明中称为GATV2载体)。载体pC0308-MMMaauCK5400的具体序列及载体构建方式，参照申请号为202010379287.9的中国专利《一种用于农作物杂交育种制种的遗传智能化育制种系统及其应用》，成功导入水稻植株中花11(ZH11，携带纯合隐性雄性不育基因Oscyp704b2-3)中。GATV2-88-4是其中一个转化事件，已在会议摘要中公开(The8th International Conference on Botany,Dec.4-6,2021,Progress of geneticautomation technology breeding system based on recessive genic maleSterility,Xiongxia Jin)，其中88-4为本转化事件。
根据GAT载体的各个元件，对转化事件GATV2-88-4进行除草剂表型、花粉育性、种子荧光检测，结果为：(1)根据正向/负向除草剂筛选显示，转化事件GATV2-88-4在喷施5x咪唑乙烟酸溶液时，表型为高抗，说明了保持系筛选元件表达盒高效工作，可用于GAT保持系除杂提纯，见图1；喷施3g/L苯达松溶液时，表型为高敏，说明了除草剂敏感元件表达盒高效灵敏，可用于GAT不育系除杂提纯，见图2。(2)利用碘化钾染色法，对转化事件GATV2-88-4花粉进行育性检测，败育花粉：可育花粉＝1:1，说明了恢复基因元件和花粉败育基因元件的工作效率高，使得保持系保持杂合状态，见图3。(3)按花粉育性鉴定结果，在560-595nm激发光显微镜下观察，其自交结实的种子也将呈现1:1分离，即其中50％为包含GAT载体的种子，则呈现深红色荧光；50％为不包含GAT载体的种子则无荧光，说明了荧光蛋白表达能正常工作，可用于种子机械分选，见图3。同时在T1、T2、T3、T4具备上述功能，证明能在世代中稳定遗传。
综上所述，单拷贝的转化事件GATV2-88-4各元件均发挥正常功能的优良初始保持系，具有遗传稳定性。其中保持系自交实现不育系和保持系的繁殖，可广泛应用于杂交稻，提高了杂交稻育种效率。
实施例2水稻GAT转化事件GATV2-88-4左边界侧翼序列的扩增
1、DNA的提取
(1)样品采集:于10月中旬取转基因温室种植的转基因水稻保持系GATV2-88-4的叶片，在-80℃下保存。
(2)DNA的提取:采用传统CTAB方法提取所述水稻叶片的基因组DNA。
(3)DNA浓度和纯度的检测:使用NanoDrop2000检测步骤(2)所述DNA样品的浓度和纯度。
2、利用Tail-PCR分离T-DNA左侧翼序列
参照Liu等(2007)的热不对称PCR(Tail-PCR)方法，根据GATV2(pC0308-MMMaauCK5400)质粒图谱的左边界(Left border，LB)序列设计3条特异性引物(SP1/2/3)，与简并引物AD2/8/10，进行T-DNA左侧翼序列的分离，具体引物序列见表1。
表1 Tail-PCR引物表
其中，N代表A或T或G或C，W代表A或T。
Tail-PCR反应体系为：1μL 10×反应缓冲液，0.25μL dNTPs，0.25μL正向引物和0.25μL反向引物，0.5U Taq DNA聚合酶，1μL 10ng/μL模板DNA，加超纯水将总体积补至10μL。
PCR反应分三步进行：
(1)PCRI：以转基因水稻GATV2-88-4基因组DNA为模板，使用特异引物对SP1与随机引物AD2/8/10分别组合，进行PCRI。其反应程序为：93℃预热2min，95℃变性1min，然后执行以下循环：94℃变性30s，60℃复性1min，72℃延伸3min，10个循环；接着94℃变性30s，20℃复性2min，72℃延伸3min，再执行以下循环：94℃变性20s，58℃复性1min，72℃延伸3min，25个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。
(2)PCRII：以PCRI产物稀释100倍为模板，使用特异引物对SP2与随机引物AD2/8/10分别组合，进行PCRII。其反应程序为：执行以下循环94℃变性20s，65℃复性1min，72℃延伸3min，1个循环，然后再执行以下循环：94℃变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s，50℃复性1min，72℃延伸3min，13个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。
(3)PCRIII：以PCRII产物稀释20倍为模板，使用特异引物对SP2与随机引物AD2/8/10分别组合，进行PCRII。其反应程序为：94℃变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s，68℃复性1min，72℃延伸3min，94℃变性20s，50℃复性1min，72℃延伸3min，6-7个循环；循环结束后72℃补充延伸5min，结束反应。配置1.5％琼脂糖凝胶，在5V/cm电场下电泳30min；其中选择SP3与AD10扩出的特异性条带209bp进行测序(如图4)。
实施例3水稻GAT转化事件GATV2-88-4的T-DNA在水稻基因组中整合位点
将Tail-PCR扩增的特异性条带PCR产物测序，得出209bp的左边界融合序列，序列如SEQ ID NO.13所示。经NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)与水稻基因组比对，及与GATV2载体序列比对，分析该序列的特征为：第1至53位与载体右边界序列完全匹配，第54至第209位于水稻基因组序列，与已公布的水稻chr12号染色体上序列(AP014968.1(27241310to 27241465)完全匹配。即水稻GAT转化事件GATV2-88-4的T-DNA的3’端插入水稻基因组12号染色体非编码区27241465碱基处(如图5)。
实施例4水稻GAT转化事件GATV2-88-4右边界侧翼序列的扩增
根据实施例3获得插入位点信息，在载体GATV2部分序列设计正向引物RB-F2，序列如SEQ ID NO.11所示(5'-GAAGGCAATGTCATACCACTTGTC-3')，以及已公布的水稻第12号染色体上的序列设计反向引物G12R1(88-4)，序列如SEQ ID NO.12所示(5'-GCCGGATTGAACTGAACGTG-3')，以及用该对引物对扩增获得水稻GAT转化事件GATV2-88-4的左侧翼序列，将该扩增产物送样测序，获得序列如SEQ ID NO.2所示，长度为1645bp。通过分析SEQ ID NO.2发现，获得的序列第1至第553位于水稻基因组序列，与已公布的水稻chr12号染色体上序列(AP014968.1(27241510to 27242062)完全匹配；第554位至1645位与载体GATV2的部分序列完全相同。即水稻GAT转化事件GATV2的T-DNA的5’端插入水稻基因组12号染色体非编码区27241510碱基处(如图5)。水稻GAT转化事件GATV2-88-4的T-DNA在插入水稻基因组12号染色体非编码区27241465-27241510碱基处，导致12号染色体非编码区(27241466to 27241509)44bp序列(SEQ ID NO.14)的缺失。
实施例5水稻GAT转化事件GATV2-88-4特异性PCR检测方法
根据实施例3和4获得水稻GAT转化事件GATV2-88-4的左侧翼序列和右侧翼序列，分别在水稻chr12号染色体上和外源载体部分设计特异性引物，具体引物序列见表2。以水稻GAT转化事件GATV2-88-4后代基因组DNA为模板，野生型(WT)为对照，进行PCR扩增，具体PCR反应体系见表3。扩增程序为：94℃2min；94℃30s；55℃[G12F1(88-4)/G12R1(88-4)组合60℃]30s；72℃1min；72℃5min；25℃2min，30-35个循环。利用1.0％琼脂糖凝胶进行PCR产物检测(见图6)。
表2水稻GAT转化事件GATV2-88-4特异性检测引物
表3反应体系
结果表明：
(1)G12F1(88-4)/G12R1(88-4)组合：水稻GAT转化事件GATV2-88-4模板和野生型(WT)均能扩出718bp目的条带(如图6)符合预期，并说明水稻GAT转化事件GATV2-88-4为杂合株系；
(2)G12F1(88-4)/LB-R2组合：水稻GAT转化事件GATV2-88-4模板能扩出左边界的插入载体和水稻基因组的融合序列495bp目的条带，获得序列如SEQ ID NO.1所示，而野生型(WT)未能扩出目的条带(如图6)，符合预期结果，表明水稻GAT转化事件GATV2-88-4中含有GAT载体插入片段；
(3)RB-F2/G12R1(88-4)组合：水稻GAT转化事件GATV2-88-4模板能扩出右边界的插入载体和水稻基因组的融合序列1645bp目的条带，获得序列如SEQ ID NO.2所示，而野生型(WT)未能扩出目的条带(如图6)，符合预期结果，表明水稻GAT转化事件GATV2-88-4中含有GAT载体插入片段。
以上结果表明，G12F1(88-4)/LB-R2和RB-F2/G12R1(88-4)引物组合能扩增获得水稻GAT转化事件GATV2-88-4及其转育株系(衍生系)左右边界序列，而在非转基因或其他转基因水稻品种均未能扩出特异性融合条带，上述引物可用于鉴定水稻GAT转化事件GATV2-88-4世代及其衍生序列。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 海南波莲水稻基因科技有限公司
<120> 一种水稻GAT转化事件GATV2-88-4的侧翼序列及其检测引物与应用
<130> KHP211124575.8
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 495
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtcaacgat ggcacacgca cagctatgga cattccattt ctctctgtac gtctcgttat 60
cattctgaaa cgaaggaatt tcatatgaga tttgcagggc ctttaatttg ataattaatt 120
gtggtgtaaa cactgcagga tctagtaaca tagatgacac cgcgcgcgat aatttatcct 180
agtttgcgcg ctatattttg ttttctatcg cgtattaaat gtataattgc gggactctaa 240
tcataaaaac ccatctcata aataacgtca tgcattacat gttaattatt acatgcttaa 300
cgtaattcaa cagaaattat atgataatca tcgcaagacc ggcaacagga ttcaatctta 360
agaaacttta ttgccaaatg tttgaacgat ctcagctgtg ccccagtttg ctaggcaggt 420
cgcagtacct ggccacagcc atctcgtgct gctccacgta ggtctctttg tcggcctcct 480
tgattctttc cagtc 495
<210> 2
<211> 1645
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccggattga actgaacgtg ttgagttata ctccctccgt ttcgaaatgt ttgacaccgt 60
tgacctttta gcacatgttt aaccgttcgt cttattaaaa acttttgtga aatatataaa 120
attatatgcc tacataaaaa tatatttaac aatgaatcaa atgatagaaa aagaattaat 180
aattacttaa attttttgaa taagacgaac ggtcaaacat gtgctagaaa gtcaacggcg 240
tcaaacattt cgaaacggag ggagtactaa cttgtactcc ctccatactc gtaaaggaag 300
tcgtttagga caatgtttaa gtcaaacctt gggaatataa atcatgaata actcttaagt 360
tgttgagatt gaaaatataa aaattatttg aatagatttg tcttgaaaaa tactttcata 420
aaagtataca tatatcactt ttcaatgaat atttttatag aaaaaagaag ttaaagttgt 480
attttggaga ccgtatcgat gttctaaatg actttctttg tgagtatgga gggagtatta 540
ctattaactg taccagccag ccaacagctc cccgaccggc agctcggcac aaaatcacca 600
ctcgatacag gcagcccatc agtccgggac ggcgtcagcg ggagagccgt tgtaaggcgg 660
cagactttgc tcatgttacc gatgctattc ggaagaacgg caactaagct gccgggtttg 720
aaacacggat gatctcgcgg agggtagcat gttgattgta acgatgacag agcgttgctg 780
cctgtgatca ccgcggtttc aaaatcggct ccgtcgatac tatgttatac gccaactttg 840
aaaacaactt tgaaaaagct gttttctggt atttaaggtt ttagaatgca aggaacagtg 900
aattggagtt cgtcttgtta taattagctt cttggggtat ctttaaatac tgtagaaaag 960
aggaaggaaa taataaatgg ctaaaatgag aatatcaccg gaattgaaaa aactgatcga 1020
aaaataccgc tgcgtaaaag atacggaagg aatgtctcct gctaaggtat ataagctggt 1080
gggagaaaat gaaaacctat atttaaaaat gacggacagc cggtataaag ggaccaccta 1140
tgatgtggaa cgggaaaagg acatgatgct atggctggaa ggaaagctgc ctgttccaaa 1200
ggtcctgcac tttgaacggc atgatggctg gagcaatctg ctcatgagtg aggccgatgg 1260
cgtcctttgc tcggaagagt atgaagatga acaaagccct gaaaagatta tcgagctgta 1320
tgcggagtgc atcaggctct ttcactccat cgacatatcg gattgtccct atacgaatag 1380
cttagacagc cgcttagccg aattggatta cttactgaat aacgatctgg ccgatgtgga 1440
ttgcgaaaac tgggaagaag acactccatt taaagatccg cgcgagctgt atgatttttt 1500
aaagacggaa aagcccgaag aggaacttgt cttttcccac ggcgacctgg gagacagcaa 1560
catctttgtg aaagatggca aagtaagtgg ctttattgat cttgggagaa gcggcagggc 1620
ggacaagtgg tatgacattg ccttc 1645
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attgaatcct gttgccggtc tt 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcatgacgtt atttatgaga tggg 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccgcaatta tacatttaat acgc 24
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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agwgnagwan cawagg 16
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
wgtgnagwan canaga 16
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agtcaacgat ggcacacgc 19
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gactggaaag aatcaaggag gc 22
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gaaggcaatg tcataccact tgtc 24
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gccggattga actgaacgtg 20
<210> 13
<211> 209
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagatcctgc agtgtttaca ccacaattaa 60
ttatcaaatt aaaggccctg caaatctcat atgaaattcc ttcgtttcag aatgataacg 120
agacgtacag agagaaatgg aatgtccata gctgtgcgtg tgccatcgtt gactgggccg 180
gccgctcgtg cgtgctcaag tactcaacc 209
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
accggttgac tatatttcag ttgattggcg aattaaccac ggac 44
Claims (10)
1.转基因水稻转化事件外源插入载体的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列的左侧翼序列如SEQ ID NO.1所示；所述侧翼序列的右侧翼序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的的侧翼序列，其特征在于，所述侧翼序列分别使用如SEQ IDNO.9-10所示和如SEQ ID NO.11-12所示的引物对扩增得到。
3.检测权利要求1或2所述的侧翼序列的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-10所示和如SEQ ID NO.11-12所示。
4.权利要求1或2所述的侧翼序列或权利要求3所述的引物在检测或识别转基因水稻及其衍生产品中的应用；所述转基因水稻为水稻GAT转化事件GATV2-88-4。
5.一种PCR检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求3所述的引物。
6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒中还包括水、Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR缓冲液、阳性对照品和阴性对照品。
7.一种检测转基因水稻GATV2-88-4的方法，其特征在于，检测水稻样品DNA中是否同时存在SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用权利要求3所述的引物或权利要求5-6任一项所述的试剂或试剂盒，以待测样品的DNA为模板，进行PCR扩增。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，根据PCR扩增产物，判断待测样品的12号染色体上的第27241465-27241510位核苷酸处是否插入pC0308-MMMaauCK5400的T-DNA片段；
若如SEQ ID NO.9-10所示的引物对扩增出495bp的目的片段，和如SEQ ID NO.11-12所示的引物对扩增出1645bp目的片段，则说明样品中含有GATV2-88-4来源的成分。
10.根据权利要求8-9任一所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：93-95℃1-2.5min；93-95℃20-40s；50-60℃20-40s；70-73℃1-1.5min；70-73℃5-6min；23-27℃1.5-2.5min，30-35个循环。
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