CN116410280A - 蛋白OsPIN5C及其相关生物材料在控制水稻叶片结构中的应用 - Google Patents
蛋白OsPIN5C及其相关生物材料在控制水稻叶片结构中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蛋白OsPIN5C及其相关生物材料在控制水稻叶片结构中的应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白OsPIN5C及其相关生物材料在控制水稻叶片结构中的应用。本发明通过组成型启动子和基因自身启动子表达了OsPIN5c基因验证了其基因功能。OsPIN5C具有控制水稻叶片结构的功能，提高OsPIN5c基因表达可以增加大脉之间小脉的数量，减少叶脉间叶肉细胞的数量，进而实质上增加叶片的叶脉密度和减少叶肉细胞的密度。本发明在创制C4水稻的应用中具备重要意义，为C4水稻的C4光合途径的引入提供了结构上的重要控制基因。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白OsPIN5C及其相关生物材料在控制水稻叶片结构中的应用。
背景技术
水稻作为最重要的三大粮食作物之一为全球超过20亿人口提供了主粮，随着全球人口的快速增长和耕地的不可逆减少以及人民对营养改善的需要，水稻生产迫切需要增加产量，而目前的常规方法显示水稻的单产增产能力达到了天花板，进一步增加水稻的单产需要更加颠覆性的技术。
水稻叶脉为单子叶植物类典型平行脉，由叶片中央一条中脉(主脉)和中脉两侧多条大脉以及大脉之间很多的小脉沿叶片纵向(轴)平行构成，这些平行脉之间通过连接脉横相联通，大脉也称作大维管束，小脉也称作小维管束(邹良平，彭明：水稻叶脉发育的研究进展,中国农业科技导报,2013(1),p.43-47)。水稻叶脉由维管束鞘细胞包围，叶脉-维管束鞘细胞之间是叶肉细胞，叶肉细胞执行主要的光合作用。
光合作用为水稻的生长发育提供了物质来源和能量来源，也是的水稻结实后籽粒中积累淀粉和其它营养物质的代谢基础，提高光合作用的效率是水稻增产的关键基础。水稻是典型的C3植物，其光合效率受到暗反应(开尔文循环)过程中关键酶核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCo)催化效率的严重制约。Rubisco在叶肉细胞的叶绿体基质中催化CO2与1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)生成2分子3-磷酸甘油酸(3-PGA)，进而再经过一系列反应(开尔文循环)，利用光反应产出的ATP中的化学能和NADPH的还原力转化产生葡萄糖中。葡萄糖经过进一步的转换和运输，最后在水稻籽粒中形成淀粉，同时光合作用生产的C骨架也是水稻其它重要的有机物形成的基础。水稻的RuBisCo与其它C3植物的RuBisCo存在相同的制约光合效率的三个因素：首先RuBisCo是一种催化效率极低的酶，绝大多数种类的酶分子1秒钟可催化1000个以上的底物分子，但RuBisCo每秒钟仅固定大约3分子CO2，由于其极低酶促效率，为满足光合作用的需要，C3植物叶片中的总蛋白中大约一半的蛋白是RuBisCo，这极大增加了植物对氮素的需求；其次，RuBisCo同时有固定CO2的羧化酶和分解光合作用初始产物PGA的加氧酶的活性，大田中午时刻由于高温或水分亏缺会导致C3植物气孔关闭，而气孔关闭使叶片内CO2浓度大大降低，此时RuBisCo主要行使加氧酶的活性而消耗掉大量光合作用的有效产物PGA，从而大大降低了叶片总的光合效率。第三，PGA被RuBisCo氧化后生成的磷酸甘油醛有生物学毒性，需要通过光呼吸途径被代谢掉，而光呼吸会消耗的大量的光反应产生能量(ATP)和还原力(NADPH)，理论计算和试验测定C3植物的光呼吸最终会导致损失至少30％光合产物。
自然界中演化出了高光效的C4植物，其固定CO2由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)在叶肉细胞中完成，PEPC具有更高催化效率，大约每秒催化3000-5000个CO2分子发生羧化反应。PEPC只有CO2羧化酶活性而没有加氧酶的活性且催化效率远高于RuBisCo，且C4植物叶肉细胞中不在积累RuBisCo，这大大降低了C4植物进行羧化反应需要的羧化酶的需要，从而大大降低C4植物对N素的需求。C4植物CO2固定和还原(开尔文循环)在两类型的细胞中完成，PEPC羧化反应在叶肉细胞中进行，产生的4碳化合物被主动转运到邻近的包裹叶脉(维管束)的维管束鞘细胞中，在维管束鞘细胞中4碳化合物脱羧释放CO2，随后在维管束鞘细胞中完成开尔文循环。这样CO2的就会在叶鞘细胞中得到浓缩，使得RuBisCo周围的CO2浓度提高而抑制了其加氧酶的活性，进而抑制了光呼吸途径，从而使C4植物具有更高的光合效率，理论上可以提高30％的产量。C4植物由于仅需要少量的PEPC即可满足CO2羧化作用从而获得比C3植物更高的氮素利用率。C4植物中CO2的浓缩机制使其在气孔关闭下仍然能维持正常的光合作用，这样C4植物也有更高水分利用效率。
将C4途径引入C3作物水稻是一种具有极大提高光合效率的技术途径，同时还带来了水稻的水分利用率和氮素利用率的提升。C4光合作用需要在两类细胞中(图1)完成，其中叶肉细胞仅具备固定CO2的功能(由PEPC完成)，维管束鞘细胞则进行CO2同化的开尔文循环，最终在维管束鞘细胞中形成淀粉，淀粉再经过复杂的转化和运输最终在籽粒中积累形成淀粉和其它营养物质。C4植物进化出C4光合途径的同时进化出了相适应高叶脉密度的特殊解剖学结构。禾本科植物为典型的平行脉，C3光合类作叶片中相邻的叶脉(维管束)之间，维管束鞘细胞与叶肉细胞的比例约为4：1(图1中上图)，而C4光合类作叶片中相邻的叶脉(维管束)之间，维管束鞘细胞与叶肉细胞的比例为1：1，这也是几乎所有的C4禾本科植物包括玉米，谷子和高粱等作物都备的特异性解剖学结构(图1中下图)。
目前科学家已经成功地把C4光合途径所需的各种酶导入到水稻中，但是没有能建立起有效的C4同化过程，造成这一结果的原因是没有在水稻叶片中同步构建C4类似的解剖学结构。这进一步的提示了C4水稻的成功不仅仅需要C4的代谢相关酶类，更需要与之配合的C4叶片解剖学结构。目前仅有很少报道控制叶片中叶脉密度基因，且水稻中还没有相关基因控制叶片形成类C4解剖学结构的基因的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何在水稻叶片中同步构建与C4植物类似的解剖学结构。
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物叶片结构中的应用。
本发明所提供的应用为蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在下述任一种中的应用：
1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物叶片结构中的应用；
2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物叶片结构的产品中的应用；
3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育叶片结构改变的植物中的应用；
4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育叶片结构改变的植物的产品中的应用；
5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
(a1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质，
(a2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物叶片结构的蛋白质，
(a3)在(a1)-(a2)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。
上述(a1)所述蛋白质的名称为OsPIN5C。
为了使(a1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述调控叶片结构可为调控叶脉数目/密度和/或叶脉之间叶肉细胞数量/密度。
上述应用中所述的蛋白质来源于水稻(Oryza sativa)。
本文中，调控所述蛋白质活性和/或含量的物质可为调控基因表达的物质，所述基因编码所述蛋白质OsPIN5C。
上文中，所述调控基因表达的物质可为进行如下6种调控中至少一种调控的物质：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
上述应用中，所述调控基因表达的物质和调控所述蛋白质活性或含量的物质可为与所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
上述生物材料中，B1)所述核酸分子可为如下任一所示的DNA分子：
C1)核苷酸序列是SEQ ID NO.2的DNA分子；
C2)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
C3)与C1)或C2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于水稻且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
C4)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。
本文所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质OsPIN5C的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质OsPIN5C的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质OsPIN5C且具有蛋白质OsPIN5C功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
本文所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为载体pCAMBIA1391Z(下文中简写为pC1391Z)载体。
可用现有的植物表达载体构建含有OsPIN5c基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括但不限于如双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如包括但不限于农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮藏蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用OsPIN5c基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，包括但不限于如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(ubiquitin)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入包括但不限于可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
本发明还提供了一种调控植物叶片结构的方法。
本发明提供的调控植物叶片结构的方法，包括通过调控上述蛋白质的编码基因的表达或调控所述蛋白质的活性或含量，或调控所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，来调控植物叶片结构。
本发明中，所述调控可为上调或增强或提高，也可为下调或抑制或降低。
本发明还提供了培育叶片结构改变的植物的方法。
本发明提供的培育叶片结构改变的植物的方法，包括提高和/或增加目的植物中所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高和/或增加所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到叶片结构改变的植物。
上述培育方法中，所述增强或提高或上调目的植物中所述蛋白的活性和/或含量，或/和，所述蛋白的编码基因的表达量可通过向受体植物中导入OsPIN5c基因，得到植物叶片结构改变的目的植物。所述OsPIN5c基因编码所述OsPIN5C蛋白。
在本发明的一个实施方案中，所述培育叶片结构改变的植物的方法包括如下步骤：
(1)构建包含SEQ ID NO.2所示DNA分子的重组表达载体；
(2)将步骤(1)构建的重组表达载体转入受体植物(如作物或水稻)中；
(3)经筛选和鉴定获得叶片结构改变的转基因植物。
所述导入指通过重组手段，包括但不限于农杆菌(Agrobacterium)介导的转化，生物射弹(biolistic)方法，电穿孔，in planta技术，等等导入。
利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的OsPIN5c基因或基因的片段导入植物细胞或受体植物，可获得植物叶片结构改变的转基因细胞系及转基因植株。携带OsPIN5c基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽孢杆菌属(Bacillus)等。具体可为根癌农杆菌EHA105。
本发明中，所述调控可为上调或增强或提高。所述调控也可为下调或减弱或降低。
本发明中，所述植物育种的目的可包括培育叶片结构改变的植物。
本发明中，所述叶片结构改变可为产生类C4植物解剖学结构。
本发明中，所述叶片结构改变具体可为叶脉数量/密度增加和/或叶脉之间叶肉细胞数量/密度减少。
所述产生类C4植物解剖学结构可体现在如下中任一种：
1)所述转基因植物的叶片大脉数量增加；
2)所述转基因植物的叶片小脉数量增加；
3)所述转基因植物的大脉之间的小脉数量增加；
4)所述转基因植物的大脉和小脉之间的叶肉数量减少；
5)所述转基因植物的小脉之间的叶肉数量减少；
6)所述转基因植物的叶片大脉数量比所述受体植物高；
7)所述转基因植物的叶片小脉数量比所述受体植物高；
8)所述转基因植物的大脉之间的小脉数比所述受体植物高。
9)所述转基因植物的大脉和小脉之间的叶肉数量比所述受体植物少。
10)所述转基因植物的小脉之间的叶肉数量比所述受体植物少。
所述大脉在单子叶植物可为次于中(主)脉的次级脉。
所述小脉可为次于次级脉的细脉。
所述大脉和小脉与中(主)脉一起构成单子叶植物比如水稻的平行脉系统。
本发明中，所述植物可为如下中的任一种：
E1)单子叶植物或双子叶植物，
E2)禾本目植物，
E3)禾本科植物，
E4)稻属植物，
E5)水稻。
本文中所述的蛋白质或所述的生物材料也属于本发明要求保护的范围。
本发明发现OsPIN5C蛋白(生长素类物质转运蛋白)具有控制水稻中改变叶片解剖学结构和产生类C4叶片解剖学结构的功能。通过组成型启动子和基因自身启动子(Nativepromoter)过表达OsPIN5c基因并验证了其基因功能，提高OsPIN5c基因表达可以增加大脉之间小脉的数量，同时可以减少叶脉间叶肉细胞的数量以及减少叶肉细胞的密度，进而可以增加叶片的叶脉密度。本发明在创制C4水稻的应用中具有重要意义，为C4水稻的C4光合途径的引入提供了结构上的重要控制基因。本发明为C4水稻育种提供了重要的候选基因，为推动高光效水稻的创制提供了底盘材料。
附图说明
图1为经典的C3植物和C4植物叶片的解剖学结构图示，主要展示和说明C3植物和C4植物小脉以及小脉之间叶肉细胞数目/密度的差异。
图2为徒手切片效果示意图，用于筛选转基因材料和叶脉以及叶肉细胞数目统计。
图3为过表达OsPIN5c植株中基因的表达水平。
图4为过表达OsPIN5c植株形态。
图5为过表达OsPIN5c叶片形态。
图6为过表达OsPIN5c植株旗叶叶片的徒手切片。
图7为过表达OsPIN5c植株旗叶叶片的石蜡切片。
图8为过表达OsPIN5c植株旗叶叶片中大脉和小脉数目统计。
图9为过表达OsPIN5c植株旗叶叶片中小脉之间叶肉细胞平均数目统计。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验，如无特别说明，均设置三次重复实验。
下述实施例中的粳稻品种“日本晴”已记载于：Goff,S.A.,et al.(2002).A draftsequence of the rice genome(Oryza sativa L.ssp.japonica).Science(New York,N.Y.),296(5565),92–100，公众可以从中国农业科学院生物技术研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的载体pCAMBIA1391Z来源于：CAMBIA,Clunies Ross St,BlackMountain/GPO Box 3200,Canberra,ACT 2601,Australia，序列公开于gene bank(GenBank:AF234312.1)，及硕士学位论文《控制水稻花期OsEF1基因功能的研究》，作者：徐明，授予年份：2011。公众可以从中国农业科学院生物技术研究所获得该载体，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中根癌农杆菌EHA105来源于：淼灵生物，货号：CCell32003。也可从市场方便从其它生物产品公司通过商业手段获得。
下述实施例中统计方法：采用统计学软件SSPS内置的student’s T-test方法。样品数量为日本晴野生型对照，转基因系1和转基因系2各11个单株。
实施例1、OsPIN5c基因的获得
1、OsPIN5c基因的获得
OsPIN5c基因通过PCR方法扩增，高保真酶(Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase)购自诺唯赞(Vazyme)公司。以日本晴萌发后7天叶片来源的总RNA反转录的cDNA为模板，采用引物为：OsPIN5c-F：5’-ATGATAGGATGGGGAGATGTG-3’，OsPIN5c-R：5’-TTAGACAAAGCCCAGAACCG-3’进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示，反应条件如表2所示，得到扩增产物(即OsPIN5c基因的编码区)。OsPIN5c基因在水稻品种日本晴的编码序列如SEQID NO.2所示的核苷酸序列，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
表1.OsPIN5c基因的PCR反应体系
| 样品 | 加入体积(μL) |
| cDNA模板 | 2 |
| OsPIN5c-F(10mM) | 2 |
| OsPIN5c-R(10mM) | 2 |
| DMSO | 2.5 |
| dNTP(各2.5mM) | 2.5 |
| Reaction Buffer(10X) | 5 |
| Phanta(5U/μL) | 1 |
| ddH2O | 33 |
| 总体积 | 50 |
表2.OsPIN5c基因的PCR反应条件
实施例2、过表达植株的获得及表型鉴定
1、过表达植株的获得
1)OsPIN5c过表达载体pCAMBIA1391Z-OsPIN5c的构建
按水稻OsPIN5c启动子(ATG上游2597bp)的序列设计引物(具体引物序列见表3)，通过PCR方法获得水稻OsPIN5c启动子片段，再将启动子片段和OsPIN5c片段通过重叠PCR方法拼接，然后插入到pCAMBIA1391Z载体的HindIII和PmlI酶切位点间，获得过表达载体pCAMBIA1391Z-OsPIN5c。过表达载体pCAMBIA1391Z-OsPIN5c构建后进行Sanger测序，以验证载体序列正确无误。
测序结果表明：重组表达载体pCAMBIA1391Z-OsPIN5c的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。pCAMBIA1391Z-OsPIN5c为将pCAMBIA1391Z的HindIII和PmlI识别位点间的片段替换为序列2所示的DNA分子，且保持pCAMBIA1391Z载体的其他序列不变得到的重组表达载体。
表3.引物序列
2)重组农杆菌的获得
将步骤1获得的过表达载体pCAMBIA1391Z-OsPIN5c通过电击的方法转入根癌农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为EHA105/pCAMBIA1391Z-OsPIN5c，用于转化水稻愈伤组织。
3)水稻的遗传转化
将日本晴成熟种子经过诱导培养基培养3周后(培养条件：32℃光照强度13230Lx)，挑选生长旺盛的愈伤做为转化的受体。用步骤2获得的重组菌EHA105/pCAMBIA1391Z-OsPIN5c侵染愈伤，25℃暗培养3天，然后在含有50mg/L潮霉素和400mg/L羧苄青霉素的筛选培养基上培养2周(培养条件：32℃，光照强度13230Lx)，将无农杆菌污染并有新鲜愈伤长出的个体用于分化培养(培养条件：32℃，光照强度13230Lx)，待分化出小苗，将其转至生根壮苗培养基上培养2周左右后(培养条件：32℃，光照强度13230Lx)转田间种植，得到T0代过表达OsPIN5c的转基因水稻植株，PCR鉴定转基因阳性植株株系，收获阳性植株获得T1代种子。
2、过表达OsPIN5c的转基因植株的表型初步鉴定
对步骤一获得的T1代种子种植于大田，生长60天后获得T1代植株，取T1代转基因植株叶片进行徒手切片初步筛选，标记叶片结构明显变化的株型系，观察植株生长状况，收获季节收获正常结实株系。
3、过表达OsPIN5c的转基因植株的表型鉴定
将上一步收获的T2代种子继续种植于大田中，生长60天后获得T2代植株，取T2代植株叶片进行徒手切片筛选，获得表型明确的两个转基因系，分别命名为转基因系1和转基因系2。定量PCR检测结果表明OsPIN5c表达量显著比野生型日本晴高(如图3所示)。形态观察结果如图4所示：与同时期的WT植株相比，T2代转基因水稻植株转基因系1和转基因系2的株型和叶色与WT植株相比，无显著性差异；旗叶叶片比WT植株相比更加宽大(如图5所示)。
4、过表达OsPIN5c的转基因植株的叶片解剖结构鉴定
1)过表达OsPIN5c的转基因植株的叶片徒手切片
水合氯醛，乳酸，甲苯胺蓝，牙签，双面刀片，载玻片均购自市场。
a、样品
取大田生长60天的T1及其后代T2代过表达OsPIN5c的水稻植株转基因系和野生型水稻(日本晴)的叶片，将叶片中部切下1厘米长的叶段。初步筛选的材料实验重复2次，每次每个株系测定20株以上。统计用材料实验重复3次，每次每个株系测定11株以上。
b、固定
将切好的叶段样品块放入2ml离心管中，加入1.5ml新配制的卡诺固定液(无水乙醇:冰醋酸＝3:1)进行固定。在室内通风橱中用真空仪器中抽真空直到叶片完全下沉，24小时后更换固定液一次。室温放置1周后徒手切片观察。
c、切片和染色
使用两个紧密贴合的双面刀片横切材料，将材料转移到脱色液中(饱和水合氯醛的乳酸溶液)，50℃脱色液中4小时。将脱色的材料用牙签转移到清水中，然后将清水中的材料用小镊子夹起，在1％的甲苯胺蓝染料中染色10-20秒，再用清水中漂洗去除浮色。然后用牙签转移到载玻片上。
d、显微镜观察以及拍照
使用自带拍照系统的显微镜进行材料的显微观察和拍照。
结果(图6)表明：转基因系1和转基因系2叶片结构明显变化，且能稳定遗传。
2)过表达OsPIN5c的转基因植株的叶片石蜡切片
冰醋酸，乙醇，二甲苯，粘片剂，番红，固绿，中性树胶，载玻片，盖玻片购自市场。
a、样品
取田间栽培的过表达OsPIN5c的转基因系1和转基因系2植株开花后10天的旗叶。实验重复2次，每次每个株系测定至少10株水稻。
b、材料固定
取旗叶叶片中断1-2厘米，用新配置的卡诺固定液(无水乙醇:冰醋酸＝3:1)进行固定，室温真空泵抽气使样品完全沉没于固定液中。室温放置24小时，更换一次固定液，材料在固定液中长久保存。
c、材料脱水
固定一周后的材料用70％乙醇冲洗3次。70％乙醇脱水2小时，重复三次。75％，80％，85％，90％，100％，100％浓度乙醇梯次脱水，每次1小时。
d、材料透明
保存在100％乙醇中的材料使用不同梯度的乙醇/二甲苯透明液中透明，依次为100％乙醇，乙醇/二甲苯＝3：1，乙醇/二甲苯＝1：1，乙醇/二甲苯＝1：3，100％二甲苯，100％二甲苯各1小时。
e、材料浸蜡
38℃左右将碎石蜡逐渐加入二甲苯中，最后到达体积比1：1为止，静止待石蜡完全溶解。将上述石蜡转移到58℃温箱中，让二甲苯完全挥发，然后分装到有材料的小烧杯中，然后58℃保温，4小时更换新石蜡，重复三次。
f、材料包埋
将浸蜡过的材料放置到小纸盒中，然后融化好的石蜡倒入，随后将小纸盒放入冷水中使石蜡尽快凝固。
g、材料切片和展片
根据需要将上述包埋有材料的蜡块用刀片修成梯形。保留蜡块完整和材料周边尽可能少保留石蜡。将修整好的蜡块粘在硬木块上(自制小木块，大约1厘米×2厘米×2厘米)，随后将蜡块固定到切片机的载蜡器上。调整切片的角度，调整机器使切片厚度8微米。在干净的载玻片上各滴加一滴水和样品粘片剂后涂匀，将蜡带漂浮于该载玻片上，然后将玻片铺在42℃展片机上。
h、溶蜡及复水
切片置二甲苯中溶蜡至石蜡溶解干净，进入二甲苯:无水乙醇(1:1)5分钟，100％，95％，90％，85％，80％，70％，50％，35％乙醇，蒸馏水中复水各5分钟。
i、染色及脱水
1％番红水溶液染色约12小时，取出流水冲洗以去除多余的染料，随后经过35％，50％，70％乙醇脱水各5分钟。继续在0.1％固绿中染色约10秒，立即进入100％乙醇30秒，100％乙醇，无水乙醇:二甲苯(1:1)，二甲苯各5分钟。
j、封片
上述载片室温吹干，镜检确定染色成功后，将一滴左右的封固剂滴到材料上，然后小心地盖上盖玻片，以后自然风干。
k、显微镜观察以及拍照
使用自带拍照系统的显微镜进行材料的显微观察和拍照。
结果表明：相对于野生型日本晴，转基因系1和转基因系2的叶脉之间叶肉细胞数量明显减少(如图7所示)。
3)过表达OsPIN5c的转基因植株的叶片叶脉以及叶脉之间叶肉细胞数目统计
对转基因系1和转基因系2各11单株旗叶石蜡切片的材料大脉数目，小脉数目，小脉之间叶肉细胞数目统计，采用Student’s t-test，P<0.01为差异及其显著，P<0.1为差异显著，结果见图8和图9。转基因系1和转基因系2的叶片大脉之间小脉的数量高于野生型，且叶脉间叶肉细胞的数量明显比野生型少。
综上所述，OsPIN5C蛋白具有控制水稻叶片解剖学结构和产生类C4叶片解剖学结构的功能，通过组成型启动子和基因自身启动子过表达OsPIN5c基因，可以增加水稻叶片大脉之间小脉的数量，同时可以减少叶脉间叶肉细胞的数量以及减少叶肉细胞的密度，进而可以增加叶片的叶脉密度。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.应用，其特征在于：所述应用为下述任一种：
1)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在调控植物叶片结构的应用；
2)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备调控植物叶片结构的产品中的应用；
3)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在培育叶片结构改变的植物中的应用；
4)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在制备培育叶片结构改变的植物的产品中的应用；
5)蛋白质或调控基因的表达物质或调控所述蛋白质活性或含量的物质在植物育种中的应用；
所述蛋白质为如下任一所示蛋白质：
(a1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质，
(a2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与a1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物叶片结构的蛋白质，
(a3)在(a1)-(a2)中任一所限定的蛋白质的末端连接标签后得到的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述蛋白质来源于水稻。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控基因表达的物质为提高或增加或上调所述基因表达的物质。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述调控基因表达的物质和调控所述蛋白质活性或含量的物质为与权利要求1或2中所述蛋白质相关的生物材料，所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下任一所示的DNA分子：
C1)核苷酸序列是SEQ ID NO.3的DNA分子；
C2)编码链的编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；
C3)与C1)或C2)限定的核苷酸序列具有90％或90％以上同一性，来源于水稻且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子；
C4)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的DNA分子。
6.一种调控植物叶片结构的方法，其特征在于，所述方法包括通过调控权利要求1或2所述蛋白质的编码基因的表达或调控所述权利要求1或2所述蛋白质的活性或含量，来调控植物叶片结构。
7.培育叶片结构改变的植物的方法，包括提高和/或增加目的植物中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量，或/和提高和/或增加权利要求1中所述蛋白质的编码基因的活性和/或含量，得到叶片结构改变的植物。
8.根据权利要求1-5中任一所述的应用，或权利要求6-7中任一所述的方法，其特征在于：所述叶片结构改变为叶脉数量/密度增加和/或叶肉细胞数目/密度减少。
9.根据权利要求1-5中任一所述的应用，或权利要求6-7中任一所述的方法，其特征在于：所述植物为下述任一种植物：
E1)单子叶植物或双子叶植物，
E2)禾本目植物，
E3)禾本科植物，
E4)稻属植物，
E5)水稻。
10.权利要求1或2中所述的蛋白质，或权利要求4或5中所述的生物材料。
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