CN116377089A - 一种金钱鱼胶检测试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种金钱鱼胶检测试剂及其应用。本申请金钱鱼胶检测试剂包括第一、第二引物探针组合；第一引物探针组合为黄唇鱼胶上下游引物和探针，上游引物为Seq ID No.1至3的任一序列，下游引物为Seq ID No.4至6的任一序列，探针为Seq ID No.7所示序列；第二引物探针组合为加利福尼亚湾石首鱼胶上下游引物和探针，上游引物为Seq ID No.8至10的任一序列，下游引物为Seq ID No.11至13的任一序列，探针为Seq ID No.14所示序列。本申请试剂能快速、准确的对黄唇鱼胶和加利福尼亚湾石首鱼胶进行现场检测，为执法检查提供有力科学依据，对两种鱼的生态保护具有重要意义。

Description

一种金钱鱼胶检测试剂及其应用

技术领域

本申请涉及金钱鱼胶检测技术领域，特别是涉及一种金钱鱼胶检测试剂及其应用。

背景技术

鱼胶是鱼鳔的干制品，富含胶质，也称为鱼肚、花胶。鱼胶的主要成分为蛋白质，含量可以高达80％以上，并富含多种维生素和微量元素，具有很高的营养价值。

鱼胶根据其来源鱼的种类进行分类，例如，包括金钱鱼胶、蜘蛛鱼胶、白花鱼胶、赤嘴鳘鱼胶、北海鱼胶、房胶、黄花胶、斗湖鱼胶、金龙鱼胶、双牙鱼胶、鳕鱼胶、鳗鱼胶等。

其中，金钱鱼胶，或称金钱鳘鱼胶，是由黄唇鱼(Bahaba taipingensis)或加利福尼亚湾石首鱼(Totoaba macdonaldi)的鱼鳔制备而成，是顶级的鳘鱼胶。国家一级保护野生动物黄唇鱼(Bahaba taipingensis)的鱼鳔干制品一直被视为最贵、最好的花胶，有花胶之王的美誉。在国家禁止黄唇鱼商业性捕捞后，加利福尼亚湾石首鱼(Totoabamacdonaldi)，即麦氏托头石首鱼，其鱼胶与黄唇鱼胶形状相似被走私贩作为后者的替代品，被称为大须金钱胶。

加利福尼亚湾石首鱼(Totoaba macdonaldi)是仅分布于墨西哥加利福尼亚湾的特有濒危物种，早在1976年列为《濒危野生动植物种国际贸易公约》CITES附录I物种，严禁开展商业性国际贸易。多年来，黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼一直面临着栖息地质量退化和非法捕捞的严重威胁，野生种群数量持续下降。然而因其鱼鳔制品——金钱鱼胶价值昂贵而遭受非法捕捞、走私等行为，无疑进一步加剧了其种群下降。

目前，对金钱鱼胶的鉴定基本上依靠形态学进行，依赖于鉴定人员在物种认知方面所累积的经验，受主观因素影响，在执法活动中存在巨大的局限。因此，如何快速、准确和方便的现场检测金钱鱼胶是执法检查和生产实践亟待解决的技术问题。

发明内容

本申请的目的是提供一种新的金钱鱼胶检测试剂及其应用。

本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公开了一种金钱鱼胶检测试剂，包括第一引物探针组合和第二引物探针组合；第一引物探针组合包括黄唇鱼胶上游引物、黄唇鱼胶下游引物和黄唇鱼胶探针，黄唇鱼胶上游引物为Seq ID No.1至Seq ID No.3所示序列中的任一序列，黄唇鱼胶下游引物为Seq ID No.4至Seq ID No.6所示序列中的任一序列，黄唇鱼胶探针为Seq IDNo.7所示序列；第二引物探针组合包括加利福尼亚湾石首鱼胶上游引物、加利福尼亚湾石首鱼胶下游引物和加利福尼亚湾石首鱼胶探针，加利福尼亚湾石首鱼胶上游引物为Seq IDNo.8至Seq ID No.10所示序列中的任一序列，加利福尼亚湾石首鱼胶下游引物为Seq IDNo.11至Seq ID No.13所示序列中的任一序列，加利福尼亚湾石首鱼胶探针为Seq IDNo.14所示序列。

需要说明的是，本申请的试剂，能够实现黄唇鱼胶和加利福尼亚湾石首鱼胶两种金钱鱼胶的双重检测，解决了依靠形态学进行金钱鱼胶鉴定的主观依赖性，能够快速、准确、有效的区分两种金钱鱼胶。在本申请的一种实现方式中，采用本申请的试剂借助荧光型核酸扩增试剂(RAA法)，能够在15min左右获得检测结果，实现快速、准确、方便的现场检测，为执法检查提供了有力的科学依据。

本申请的一种实现方式中，Seq ID No.7所示序列的黄唇鱼胶探针中，第三十三个碱基标记荧光基团，第三十六个碱基标记荧光淬灭基团，并在荧光基团和荧光淬灭基团之间的任一位置插入四氢呋喃残基。

本申请的一种实现方式中，在Seq ID No.7所示序列的黄唇鱼胶探针的第三十四个碱基后面插入四氢呋喃残基。

本申请的一种实现方式中，Seq ID No.7所示序列的黄唇鱼胶探针的3’末端具有阻断物。其中，阻断物优选为C3 spacer。

申请的一种实现方式中，Seq ID No.14所示序列的加利福尼亚湾石首鱼胶探针中，第三十一个碱基标记荧光基团，第三十四个碱基标记荧光淬灭基团，并在荧光基团和荧光淬灭基团之间的任一位置插入四氢呋喃残基。

本申请的一种实现方式中，在Seq ID No.14所示序列的加利福尼亚湾石首鱼胶探针的第三十二个碱基后面插入四氢呋喃残基。

本申请的一种实现方式中，Seq ID No.14所示序列的加利福尼亚湾石首鱼胶探针的3’末端具有阻断物。其中，阻断物优选为C3 spacer。

需要说明的是，本申请的关键在于研究设计了黄唇鱼胶和加利福尼亚湾石首鱼胶的双重检测引物和探针，至于具体的荧光基团、荧光淬灭基团、四氢呋喃残基等的位置可以根据需求进行调整，以上具体限定仅仅是本申请的一种实现方式中经过证实能够有效进行RAA法双重检测的方案，不排除还可以在本申请探针的基础上适当改变荧光基团、荧光淬灭基团、四氢呋喃残基等的位置，同样可以达到本申请双重检测黄唇鱼胶和加利福尼亚湾石首鱼胶的技术效果。

本申请的一种实现方式中，黄唇鱼胶探针和加利福尼亚湾石首鱼胶探针，两者标记不同的荧光基团。

本申请的一种实现方式中，黄唇鱼胶探针标记的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；加利福尼亚湾石首鱼胶探针标记的荧光基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1。

需要说明的是，FAM和HEX荧光标记只是本申请的一种实现方式中具体采用的荧光标记，根据不同的设备或者试验需求，还可以采用其他的荧光标记，只要能够满足黄唇鱼胶和加利福尼亚湾石首鱼胶的双重荧光检测即可。

本申请的一种实现方式中，黄唇鱼胶上游引物为Seq ID No.3所示序列，黄唇鱼胶下游引物为Seq ID No.5所示序列。

本申请的一种实现方式中，加利福尼亚湾石首鱼胶上游引物为Seq ID No.8所示序列，加利福尼亚湾石首鱼胶下游引物为Seq ID No.13所示序列。

需要说明的是，Seq ID No.3所示序列和Seq ID No.5所示序列的黄唇鱼胶上下游引物，Seq ID No.8所示序列和Seq ID No.13所示序列的加利福尼亚湾石首鱼胶上下游引物，只是本申请的一种实现方式中证实双重检测效果最好的引物组合。

本申请的另一面公开了本申请的金钱鱼胶检测试剂在制备黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼鉴定试剂盒中的应用。

可以理解，本申请的金钱鱼胶检测试剂能够有效的区分黄唇鱼胶和加利福尼亚湾石首鱼胶，当然能够有效的区分黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼，因此能够用于制备黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼的鉴定试剂盒。

本申请的再一面公开了用于黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼鉴定的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的金钱鱼胶检测试剂。

需要说明的是，本申请的试剂或试剂盒能够有效的区分和鉴定黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼，例如从鱼类制品或者含鱼类成分的材料中准确、有效的区分和鉴定黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼，从而有效的打击非法捕捞、走私等行为，对黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼的生态保护具有重要意义。

本申请的一种实现方式中，用于黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼鉴定的试剂盒中还含有荧光型核酸扩增试剂。

可以理解，本申请的一种实现方式中，具体是通过RAA法实现黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼的双重检测；因此，为了使用方便，也可以将RAA法相应的试剂组合到本申请的试剂盒。

本申请的有益效果在于：

本申请的金钱鱼胶检测试剂，能够快速、准确、有效的对黄唇鱼胶和加利福尼亚湾石首鱼胶进行现场检测，为金钱鱼胶的执法检查提供了有力的科学依据，对黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼的生态保护具有重要意义。

附图说明

图1是本申请实施例中黄唇鱼的引物初筛结果图；

图2是本申请实施例中加利福尼亚湾石首鱼的引物筛选结果图；

图3是本申请实施例中黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼的特异性检测结果；

图4是本申请实施例中黄唇鱼的敏感性检测结果；

图5是本申请实施例中加利福尼亚湾石首鱼的敏感性检测结果；

图6是本申请实施例中加利福尼亚湾石首鱼另一靶标引物探针的敏感性检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

荧光型核酸扩增试剂(RAA法)购自杭州众测公司；DNeasy Blood&Tissue kit购自QIAGEN公司；PCR kit、Real time PCR Kit、pMD18-T载体、DH5α感受态细胞均购自宝日医生物技术(北京)有限公司；恒温荧光信号收集装置T16-ISO购自于英国Twista公司。荧光定量PCR仪QuantStudio^TM3Real-Time PCR System购自Thermo公司；超微量核酸蛋白浓度分析仪(Nanodrop2000c)购自Thermo公司。

1.2鱼胶样品

黄唇鱼Bahaba flavolabiata组织由东莞市黄唇鱼自然保护区管理站赠送。加利福尼亚湾石首鱼Totoaba macdonaldi鱼胶组织由深圳海关动植物检验检疫技术中心提供。

尼罗尖吻鲈Lates niloticus、尖吻鲈Lates calcarifer、苏里南犬牙石首鱼Cynoscion acoupa、网纹犬牙石首鱼Cynoscion reticulatus、海神犬牙石首鱼Cynoscionpraedatorius、绿色犬牙石首鱼Cynoscion virescens、小鳞波曼石首鱼Boesemaniamicrolepis、小牙潘纳石首鱼Panna microdon、短须似牙

Pseudotolithusbrachygnathus、长吻拟牙/>

Otolithoides biauritus、褐毛鲿Megalonibea fusca、青锯盖鱼Centropomus viridis、浅色黄姑鱼Nibea coibor、双棘原黄姑鱼Protonibeadiacanthus、细鳞黄姑鱼Nibea squamosa、小黑体马鲅Leptomelanosoma indicum、大西洋鳕鱼Gadus morhua、大西洋鳕鱼Gadus macrocephalus、克氏须鼬鳚Brotula clarkae、须鼬鳚Brotula barbata、印度原鹤海鳗Congresox talabonoides等21种鱼胶样品均由深圳海关动植物检验检疫技术中心提供和保存。

所有样本由DNeasy Blood&Tissue kit提取DNA备用，DNA提取的具体步骤参考试剂盒说明书。

1.3引物设计与筛选

根据GenBank登录的黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼的基因序列进行比对分析，设计引物和探针，将设计的引物探针通过NCBI中进行BLAST进行特异性分析，分别筛选出3组引物以及1条探针，如表1所示，所有引物、探针都由上海生工合成。

表1 RAA的引物和探针

引物或探针名称	序列(5’→3’)	SEQ ID No.
			Bahaba Raa F1	atggcattcccccgaataaataacataagt	1
Bahaba Raa F2	ttccttccttctgctcctgacctcttcagg	2
			Bahaba Raa F3	ccgaataaataacataagtttctggcttct	3
Bahaba Raa R1	gagagaagatagccaagtcgacggaagccc	4
			Bahaba Raa R2	atagccaagtcgacggaagcccctgcgtgt	5
Bahaba Raa R3	cgacggaagcccctgcgtgtgcgagattcc	6
			Bahaba Raa P	ggttgaggcaggggccggaacaggatggacggtcatcctccacttgctg	7
TMcytB Raa F1	ctcagattcattgaactagggtgttgccgat	8
			TMcytB Raa F2	cattgaactagggtgttgccgatgtagggt	9
TMcytB Raa F3	agggtgttgccgatgtagggtacggcggac	10
			TMcytB Raa R1	ctcttccttttagtaatgataactgccttc	11
TMcytB Raa R2	ttagtaatgataactgccttcgttggctat	12
			TMcytB Raa R3	atcggagtcgtcctcttccttttagtaatg	13
TMcytB Raa P	gtttgtgatgacggtggcccctcagaatgatactggccccaggggagga	14

表1中，“F”表示上游引物，“R”表示下游引物，“P”表示探针，“Bahaba Raa”表示黄唇鱼对应的引物或探针，“TMcytB Raa”表示加利福尼亚湾石首鱼对应的引物或探针。

其中，Seq ID No.7所示序列的黄唇鱼胶探针中，第三十三个碱基标记荧光基团，第三十六个碱基标记荧光淬灭基团，并在第三十四个碱基后面插入四氢呋喃残基，3’末端具有阻断物。本例具体的，黄唇鱼胶探针标记的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1，阻断物为C3 spacer。

Seq ID No.14所示序列的加利福尼亚湾石首鱼胶探针中，第三十一个碱基标记荧光基团，第三十四个碱基标记荧光淬灭基团，并在第三十二个碱基后面插入四氢呋喃残基，3’末端设计阻断物C3 spacer。本例具体的，加利福尼亚湾石首鱼胶探针标记的荧光基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1。

将以上引物按照荧光RAA反应体系分别对对黄唇鱼、加利福尼亚湾石首鱼基因组核酸进行扩增，筛选反应速度快、荧光信号强的引物组，用于后续的双重荧光RAA试验。

反应体系和条件为：在含冻干酶球的PCR管中加入A buffer 25μL，F/R(10μM)各2μL，P(10μM)0.6μL，模板1μL，补充ddH₂O至47.5μL，在PCR管盖内加B buffer 2.5μL，盖上盖子，在上机时短暂离心，置于荧光PCR仪中39℃，30s反应30个循环，相当于15min。其中，F/R即黄唇鱼胶上下游引物或加利福尼亚湾石首鱼胶上下游引物，P即黄唇鱼胶探针或加利福尼亚湾石首鱼胶探针，模板即提取的DNA。

1.4质粒标准品的构建

分别选择黄唇鱼COI基因以及加利福尼亚湾石首鱼cytB基因，由安徽通用公司合成，并连接pUC57载体，构建重组质粒，重组质粒经测序鉴定正确后，测定浓度并计算拷贝数，作为荧光RAA阳性标准品。

1.5RAA反应体系及反应条件的优化

采用筛选的引物探针，将其浓度分别配置为5μM、10μM、20μM，按照RAA(荧光型)试剂盒说明书配制反应液，并立即置于荧光PCR仪中，设定反应条件30s，30个循环，收集FAM、HEX荧光信号。确定引物探针浓度后，在不同温度，本例具体分别为37℃、39℃，42℃，条件下反应15min，收集FAM、HEX荧光。比较分析最佳反应条件。

1.6特异性试验

应用建立的RAA方法分别对黄唇鱼Bahaba flavolabiata、加利福尼亚湾石首鱼Totoaba macdonaldi、尼罗尖吻鲈Lates niloticus、尖吻鲈Lates calcarifer、苏里南犬牙石首鱼Cynoscion acoupa、网纹犬牙石首鱼Cynoscion reticulatus、海神犬牙石首鱼Cynoscion praedatorius、绿色犬牙石首鱼Cynoscion virescens、小鳞波曼石首鱼Boesemania microlepis、小牙潘纳石首鱼Panna microdon、短须似牙

Pseudotolithusbrachygnathus、长吻拟牙/>

Otolithoides biauritus、褐毛鲿Megalonibea fusca、青锯盖鱼Centropomus viridis、浅色黄姑鱼Nibea coibor、双棘原黄姑鱼Protonibeadiacanthus、细鳞黄姑鱼Nibea squamosa、小黑体马鲅Leptomelanosoma indicum、大西洋鳕鱼Gadus morhua、大西洋鳕鱼Gadus macrocephalus、克氏须鼬鳚Brotula clarkae、须鼬鳚Brotula barbata、印度原鹤海鳗Congresox talabonoides等鱼胶样品进行检测，设ddH₂O为阴性对照，验证该方法的特异性。

1.7灵敏性试验

分别测定构建的黄唇鱼质粒标准品和加利福尼亚湾石首鱼质粒标准品的浓度，分别进行10倍梯度稀释，以各浓度梯度的质粒作为模板，以建立的荧光RAA方法进行检测，设ddH₂O为阴性对照，验证该方法的敏感性。

1.8重复性试验

分别选取两种鱼10⁶、10⁴、10²copies/μL三个浓度的质粒标准品分别进行组间和组内重复试验，每组设置3个平行，对方法的稳定性和重复性进行评估。

2结果

2.1引物的筛选

用设计的引物探针，分别对提取的黄唇鱼、加利福尼亚湾石首鱼基因组核酸进行扩增，结果如图1和图2所示，图1为黄唇鱼Bahaba flavolabiata的引物初筛结果图，图2为加利福尼亚湾石首鱼Totoaba macdonaldi的引物筛选结果图。图1和图2的结果显示，(1)黄唇鱼F3/R2引物组在2.5min(CT值5)始检测到荧光信号，并且荧光信号较强，扩增效果最好，如图1所示；(2)加利福尼亚湾石首鱼F1/R3引物组在3min(CT值6)时开始检测到荧光信号，并且荧光信号较强，扩增效果最好，如图2所示，因此选黄唇鱼F3/R2引物组和加利福尼亚湾石首鱼F1/R3引物组以及探针用以后续实验。

2.2反应体系的优化结果

通过荧光信号和扩增曲线起峰时间来选择引物探针浓度，结果显示，5μM、10μM、20μM三个浓度的起峰时间基本一致，当引物探针浓度为20μM时，荧光强度最高，但是对黄唇鱼的扩增在10min后荧光信号反而下降，曲线形状难看；当引物与探针浓度均为10μM时，荧光信号较好，扩增曲线呈典型“S”型。因此，选择引物探针浓度为10μM。

不同反应温度的实验结果显示，反应温度为37℃时，信号值较高，但是反应速度较慢，反应温度为42℃时，反应迅速，但是信号值较低。反应温度为39℃时，反应相对迅速，信号值强，因此选择了39℃作为后续实验的反应条件。

最终确定的反应体系与条件为：在含冻干酶球的PCR管中加入A buffer25μL，Bahaba Raa F3/R2(10μM)各2μL，Bahaba Raa P(10μM)0.6μL，TMcytB Raa F1/R3(10μM)各2μL，TMcytB Raa P(10μM)0.6μL，模板1μL，补充ddH₂O至47.5μL，在PCR管盖内加B buffer2.5μL，盖上盖子，在上机时短暂离心，置于荧光PCR仪中39℃，30s反应30个循环，相当于15min。

2.3特异性检测实验结果

采用“2.2反应体系的优化结果”最终确定的反应体系与条件，即双重荧光RAA，对黄唇鱼Bahaba flavolabiata、加利福尼亚湾石首鱼Totoaba macdonaldi等鱼胶的核酸样品进行检测，结果如图3所示。图3的结果显示，除黄唇鱼Bahaba flavolabiata和加利福尼亚湾石首鱼Totoaba macdonaldi外，其它鱼胶样品均无扩增信号，表明该方法特异性良好。

2.4敏感性试验结果

本例计算得到构建的质粒标准品浓度分别为：黄唇鱼质粒标准品浓度为3.4ⅹ10⁸copies/μL、加利福尼亚湾石首鱼质粒标准品浓度为3.7ⅹ10⁸copies/μL。将构建的两个质粒标准品分别按10倍梯度稀释作为模板进行敏感性试验，本例敏感性试验具体采用的稀释的黄唇鱼质粒标准品包括：3.4ⅹ10⁵copies/μL、3.4ⅹ10⁴copies/μL、3.4ⅹ10³copies/μL、3.4ⅹ10²copies/μL、3.4ⅹ10¹copies/μL、3.4ⅹ10⁰copies/μL，加利福尼亚湾石首鱼质粒标准品包括：3.7ⅹ10⁵copies/μL、3.7ⅹ10⁴copies/μL、3.7ⅹ10³copies/μL、3.7ⅹ10²copies/μL、3.7ⅹ10¹copies/μL、3.7ⅹ10⁰copies/μL。并设置水阴性对照。

敏感性试验结果显示，RAA方法对黄唇鱼的检测下限为3.4ⅹ10¹copies/μL，如图4所示；对加利福尼亚湾石首鱼的检测下限为3.7ⅹ10¹copies/μL，如图5所示。由此可见，本例“2.2反应体系的优化结果”最终确定的反应体系与条件，具有较高灵敏度，能够满足检测使用需求。

2.5重复性试验

黄唇鱼三个浓度的质粒标准品包括：3.4ⅹ10⁶copies/μL、3.4ⅹ10⁴copies/μL、3.4ⅹ10²copies/μL，加利福尼亚湾石首鱼三个浓度的质粒标准品包括：3.7ⅹ10⁶copies/μL、3.7ⅹ10⁴copies/μL、3.7ⅹ10²copies/μL。双重荧光RAA方法检测黄唇鱼重复性实验的结果如表2所示，双重荧光RAA方法检测加利福尼亚湾石首鱼重复性实验的结果如表3所示。

表2双重荧光RAA方法检测黄唇鱼重复性实验

表3双重荧光RAA方法检测加州湾石首鱼重复性实验

表2和表3的结果显示，通过对3种不同浓度的质粒标准品的组间、组内变异系数分析，CV值均在5％以下，表明建立的双重荧光RAA方法具有较高的重复性和稳定性。

3讨论

本次实验选择了线粒体COI基因与cytB基因作为目的位点，是因为线粒体基因在种间差异较大，相对容易找到特异性的位点，并且Genbank中收录的数据足够多，有利于前期序列比对分析，其中COI基因的种间变异率较高，是理想的目的基因。

本次实验中黄唇鱼的靶位点位于COI基因，而加利福尼亚湾石首鱼的靶位点是cytB基因。是因为，本实验研究发现，加利福尼亚湾石首鱼针对COI的靶位点的引物扩增效率较差，灵敏度仅为10³拷贝/μL，因此重新在位于cytB基因上设计了引物，实验结果显示具有较好的灵敏度和特异性。本实验针对加利福尼亚湾石首鱼COI的靶位点的引物如表4所示，同样设计了三对上下游引物和一条探针。

表4加利福尼亚湾石首鱼COI位点RAA引物

引物或探针名称	序列(5’→3’)	SEQ ID No.
			Totoaba RAA P	ccgctcgctgggaacctcgcacacgcaggtgct ccgtcgacttagccatc	15
Totoaba RAA F1	cgggagccgggacagggtgaacagtttacc	16
			Totoaba RAA F2	agtagaggcgggagccgggacagggtgaac	17
Totoaba RAA F3	aacctcttcaggagtagaggcgggagccgg	18
			Totoaba RAA R1	attgatgaaacacctgcgagatgcagagaa	19
Totoaba RAA R2	ctagaattgatgaaacacctgcgagatgca	20
			Totoaba RAA R3	acagctcatacgaataaaggcgtttgatat	21

表4中，“F”表示上游引物，“R”表示下游引物，“P”表示探针，“Totoaba RAA”表示加利福尼亚湾石首鱼对应的引物或探针。Seq ID No.15所示序列的加利福尼亚湾石首鱼胶探针中，第三十个碱基标记荧光基团，第三十三个碱基标记荧光淬灭基团，并在第三十一个碱基后面插入四氢呋喃残基，3’末端设计阻断物C3 spacer。本例具体的，加利福尼亚湾石首鱼胶探针标记的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1。

反应体系和条件为：在含冻干酶球的PCR管中加入A buffer 25μL，Totoaba RAAF/R(10μM)各2μL，Totoaba RAA P(10μM)0.6μL，模板1μL，补充ddH₂O至47.5μL，在PCR管盖内加B buffer 2.5μL，盖上盖子，在上机时短暂离心，置于荧光PCR仪中39℃，30s反应30个循环，相当于15min。

针对表4的引物和探针，本例敏感性试验具体采用的稀释的加利福尼亚湾石首鱼质粒标准品包括：3.7ⅹ10⁶copies/μL、3.7ⅹ10⁵copies/μL、3.7ⅹ10⁴copies/μL、3.7ⅹ10³copies/μL、3.7ⅹ10²copies/μL、3.7ⅹ10¹copies/μL，并设置水阴性对照。扩展敏感性结果如图6所示，灵敏度仅为10³拷贝/μL。

本实验采用“2.2反应体系的优化结果”最终确定的反应体系与条件，即双重荧光RAA，对黄唇鱼的检测限为3.4ⅹ10¹copies/μL，对加利福尼亚湾石首鱼的检测下限为3.7ⅹ10¹copies/μL，灵敏度高。将本实验的引物探针组合等试剂按照目前市面上常规使用的方式制成RAA试剂预混冻干粉末，这样使得试剂可以无需低温保存，并且还方便于现场检测。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.一种金钱鱼胶检测试剂，其特征在于：包括第一引物探针组合和第二引物探针组合；

所述第一引物探针组合包括黄唇鱼胶上游引物、黄唇鱼胶下游引物和黄唇鱼胶探针，所述黄唇鱼胶上游引物为Seq ID No.1至Seq ID No.3所示序列中的任一序列，所述黄唇鱼胶下游引物为Seq ID No.4至Seq ID No.6所示序列中的任一序列，所述黄唇鱼胶探针为Seq ID No.7所示序列；

所述第二引物探针组合包括加利福尼亚湾石首鱼胶上游引物、加利福尼亚湾石首鱼胶下游引物和加利福尼亚湾石首鱼胶探针，所述加利福尼亚湾石首鱼胶上游引物为Seq IDNo.8至Seq ID No.10所示序列中的任一序列，所述加利福尼亚湾石首鱼胶下游引物为SeqID No.11至Seq ID No.13所示序列中的任一序列，所述加利福尼亚湾石首鱼胶探针为SeqID No.14所示序列。

2.根据权利要求1所述的金钱鱼胶检测试剂，其特征在于：Seq ID No.7所示序列的黄唇鱼胶探针中，第三十三个碱基标记荧光基团，第三十六个碱基标记荧光淬灭基团，并在荧光基团和荧光淬灭基团之间的任一位置插入四氢呋喃残基；

优选的，在Seq ID No.7所示序列的黄唇鱼胶探针的第三十四个碱基后面插入四氢呋喃残基；

优选的，Seq ID No.7所示序列的黄唇鱼胶探针的3’末端具有阻断物；

优选的，所述阻断物为C3 spacer。

3.根据权利要求2所述的金钱鱼胶检测试剂，其特征在于：Seq ID No.14所示序列的加利福尼亚湾石首鱼胶探针中，第三十一个碱基标记荧光基团，第三十四个碱基标记荧光淬灭基团，并在荧光基团和荧光淬灭基团之间的任一位置插入四氢呋喃残基；

优选的，在Seq ID No.14所示序列的加利福尼亚湾石首鱼胶探针的第三十二个碱基后面插入四氢呋喃残基；

优选的，Seq ID No.14所示序列的加利福尼亚湾石首鱼胶探针的3’末端具有阻断物；

优选的，所述阻断物为C3 spacer。

4.根据权利要求3所述的金钱鱼胶检测试剂，其特征在于：所述黄唇鱼胶探针和加利福尼亚湾石首鱼胶探针，两者标记不同的荧光基团。

5.根据权利要求4所述的金钱鱼胶检测试剂，其特征在于：所述黄唇鱼胶探针标记的荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；所述加利福尼亚湾石首鱼胶探针标记的荧光基团为HEX，荧光淬灭基团为BHQ1。

6.根据权利要求1-5任一项所述的金钱鱼胶检测试剂，其特征在于：所述黄唇鱼胶上游引物为Seq ID No.3所示序列，所述黄唇鱼胶下游引物为Seq ID No.5所示序列。

7.根据权利要求1-5任一项所述的金钱鱼胶检测试剂，其特征在于：所述加利福尼亚湾石首鱼胶上游引物为Seq ID No.8所示序列，所述加利福尼亚湾石首鱼胶下游引物为SeqID No.13所示序列。

8.权利要求1-7任一项所述的金钱鱼胶检测试剂在制备黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼鉴定试剂盒中的应用。

9.一种用于黄唇鱼和加利福尼亚湾石首鱼鉴定的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1-7任一项所述的金钱鱼胶检测试剂。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还含有荧光型核酸扩增试剂。

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