CN116376854A - 一种突变的hppd多肽及其应用 - Google Patents

一种突变的hppd多肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了抗除草剂基因、多肽及其在植物育种中的应用，具体地，本发明提供了一种突变的HPPD多肽及其应用，并且所述突变的HPPD多肽与亲本HPPD多肽相比，在对应于SEQ ID No.1第207位、第75位、第228位、第333位、第27位、第45位、第148位氨基酸的任意一位或任意几位发生突变。突变后的HPPD多肽对除草剂具有很强的耐受性，在提高和培育抗HPPD抑制性除草剂耐受性植物领域中具有非常广阔的应用前景。

Description

一种突变的HPPD多肽及其应用
技术领域
本发明属于农业基因工程领域，具体涉及向植物赋予HPPD抑制性除草剂抗性或耐受性的新型突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)、其编码核酸以及应用。
背景技术
对羟基苯丙酮酸双加氧酶(4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase，HPPD，EC1.13.11.27)是生物体内酪氨酸代谢过程中重要的酶，几乎存在于所有需氧的生物体中，生物体内酪氨酸(Tyrosine)在酪氨酸氨基转移酶(Tyrosine aminotransferase,TAT)的作用下生成对羟基苯丙酮酸(p-hydroxyphenylpyruvic acid,HPPA)，在氧气的参与下HPPD能够将HPPA催化转化成尿黑酸(homogentisate，HGA)。在动物体内，HPPD的主要作用是促进酪氨酸、芳氨酸、苯丙氨酸的分解代谢。但在植物体内的作用与动物体内显著不同，尿黑酸进一步形成质体醌(plastoquinones)和生育酚(tocopherols，维生素E)(Ahrens et al.,2013)。生育酚起膜相关抗氧化剂的作用，是植物生长必须的抗氧化剂，能有效地增强植物的抗逆性。质体醌是植物进行光合作用过程中的关键辅助因子，促进植物体内类胡萝卜素等的合成。植物体中60％以上的叶绿素都结合于捕光天线复合物上，该复合物吸收太阳光能并将激发能传递给光合作用反应中心，而类胡萝卜素是反应中心的叶绿素结合蛋白和天线系统的重要组成部分，在植物光合作用中担负着光吸收辅助色素的重要功能，具有吸收和传递电子的能力，并在清除自由基方面起着重要作用。
HPPD受到抑制会导致植物细胞内的光合作用解偶联、辅助捕光色素缺乏，同时由于缺乏通常由类胡萝卜素提供的光保护作用，活性氧中间体和光氧化导致叶绿素破坏，结果造成植物光合作用组织产生白化症状，生长受到抑制，直至死亡(Beaudegnies et al.,2009)。
自20世纪90年代起被确定为除草剂靶标，HPPD是继乙酰乳酸合成酶(ALS)、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)后又一重要的除草剂作用靶标，其独特的作用机制可以有效防治多种抗性杂草。HPPD类除草剂是近年来兴起的一类热销产品，具有高效、低毒、环境相容性好以及对后茬作物安全性高等一系列优点。研究发现植物与哺乳动物HPPD氨基酸序列的同源性存在显著差异，而同为植物界或者动物界的同源性比较高(Yang et al.,2004)。这为后续开发具有更高选择性和安全性的HPPD类除草剂提供了理论指导基础。目前，按结构分类已经开发了5种以HPPD为靶标的除草剂，主要包括三酮类、吡唑酮类、异噁唑类、二酮腈类和二苯酮类。
然而，这些HPPD抑制除草剂在杀死杂草的同时也会给作物带来一定的伤害，不同农作物对不同的HPPD除草剂的耐受程度不同，也限制了HPPD除草剂的使用范围，因此获得耐受除草剂的作物尤为重要。目前的策略除了试图绕过HPPD介导的尿黑酸产生外，还包括过表达该酶从而在植物中产生大量的除草剂靶标酶，减轻除草剂的抑制作用。虽然HPPD的过表达使得植物对除草剂(如异噁氟草的二酮腈衍生物)有更好的萌发前耐受性，但该耐受性不足以抵抗萌发后的除草剂处理。
CRISPR/Cas基因编辑技术是近几年新兴的基因工程技术，其是由guideRNA介导的DNA切割技术，针对Cas的不同已经开发出多种编辑系统，包括Cas9、Cpf1、Cms1、C2c1、C2c2等。CRISPR/Cas编辑技术可以实现三种定点编辑：第一种是基因的定点敲除，Cas蛋白在靶向RNA(gRNA)的指导下识别和切割靶点，产生双链DNA断裂；断裂的DNA通常以非同源末端连接(NHEJ)来修复；在修复时容易产生移码突变以破坏这个基因。定点敲除的效率都较高。第二种是对靶标进行同源置换来更换靶标序列或者定点插入。在产生双链DNA断裂时，如果在附近存在同源修复模板，这时可能发生同源置换或定点插入。同源置换的效率较低，并随着要置换的序列的长度增长而变得更低。第三种是单碱基编辑。单碱基编辑是利用CRISPR/Cas系统将脱氨酶靶向基因组中特定的位点从而对特定碱基进行修饰的基因编辑方法。此种方法已经在水稻中成功运用。
HPPD类除草剂大规模使用的时间较短，目前关于HPPD基因自身突变产生抗性的报道极少。但结合CRISPR技术，我们可以加快抗性HPPD多肽的筛选，改进作物对HPPD抑制剂的耐受性。对于扩大除草剂使用范围、延长使用寿命具有重要意义。
发明内容
本发明目的是提供一种可提高植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性或耐受性的突变型HPPD多肽；本发明还涉及突变型HPPD的生物学活性片段，编码所述蛋白或片段的多核苷酸及其应用。
一方面，本发明提供了一种对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的突变多肽，所述突变多肽与亲本对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第27位、第45位、第75位、第148位、第207位、第228位、第333位。
在另一优选例中，所述的突变为氨基酸的插入、缺失或替换。
在一个实施方式中，所述的突变为氨基酸的替换。
在另一优选例中，所述的突变多肽为除草剂抗性/耐受性多肽，尤其是针对HPPD抑制剂类除草剂的抗性/耐受性。
在一个实施方式中，所述第27位、第45位、第75位、第148位、第207位、第228位和第333位氨基酸位点分别为R、Q、A、A、G、V和A。
在一个实施方式中，所述第27位氨基酸突变为非R的氨基酸，例如，A，V，G，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，L，I；优选，H。
在一个实施方式中，所述第45位氨基酸突变为非Q的氨基酸，例如，A，V，G，K，F，W，Y，D，N，E，L，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，R。
在一个实施方式中，所述第75位氨基酸突变为非A的氨基酸，例如，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，V。
在一个实施方式中，所述第148位氨基酸突变为非A的氨基酸，例如，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，T。
在一个实施方式中，所述第207位氨基酸突变为非G的氨基酸，例如，V，A，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，S，W，T，Q，P，N。
在一个实施方式中，所述第228位氨基酸突变为非V的氨基酸，例如，A，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，M。
在一个实施方式中，所述第333位氨基酸突变为非A的氨基酸，例如，V，G，L，Q，F，W，Y，D，N，E，K，M，S，T，C，P，H，R，I；优选，E。
在一个实施方式中，所述第27位R突变为H；所述第45位Q突变为R；所述第75位A突变为V；所述第148位A突变为T；所述第207位G突变为S；所述第228位V突变为M；所述第333位A突变为E。
另一方面，本发明提供了一种突变型的HPPD多肽，所述突变型的HPPD多肽选自以下I-III任意一组：
I、所述突变多肽与亲本对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第207位、第75位、第228位、第333位、第27位、第45位、第148位；
II、与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的突变型的HPPD多肽，并且保留了除草剂抗性的活性；
III、与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，并且保留了除草剂抗性的活性；所述一个或多个氨基酸包括1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加。
在另一优选例中，所述的突变型HPPD多肽进一步包括其他突变位点，所述的其他突变位点为对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第54、401、133、20、93、103、141、152、165、170、191、211、220、226、276、277、336、337、338、339、340、342、346、347、353、370、377、386、390、392、403、410、418、419、420、430和431位点中的一种或多种，所述的其他突变位点能够保持或增强突变多肽对HPPD抑制性除草剂的耐受性或抗性或增加突变型HPPD多肽对除草剂的适用范围。
在另一优选例中，所述的对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的其他突变位点的突变方式包括：L54F、K401E、A133T、A20E、D152N、D170N、E353K、P211L、P336L、Y339H、Y340H、R93S、A103S、H141R/K/T、A165V、V191I、R220K、G226H、L276W、P277N、P336D/L、P337A、N338D/SY、G342D、R346C/D/H/S/Y、A347V、D370N、I377C、P386T、L390I、M392L、E403G、K410I、K418P、G419F/L/V、N420S、N420T、E430G和Y431L中的一种或多种。
在另一优选例中，所述亲本HPPD多肽来源于单子叶植物和/或双子叶植物。
在另一优选例中，所述亲本HPPD多肽来源于选自下组的一种或多种植物：禾本科、豆科、藜科、十字花科植物。
在另一优选例中，所述亲本HPPD多肽来源于选自下组的一种或多种植物：拟南芥、水稻、烟草、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。
在另一优选例中，所述亲本HPPD多肽来源于水稻；其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；
在另一优选例中，所述亲本HPPD多肽的氨基酸序列与SEQ ID No.1所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、或至少99.9％的序列同一性。
在另一优选例中，所述突变多肽(除草剂抗性多肽)为SEQ ID No.1所示的多肽经突变形成的。
在另一优选例中，所述的突变多肽除所述上述突变外，其余的氨基酸序列与SEQID No.1所示的序列相同或基本相同。
在另一优选例中，所述的基本相同是至多有50个(较佳地为1-20个，更佳地为1-10个、更佳地1-5个)氨基酸不相同，其中，所述的不相同包括氨基酸的取代、缺失或添加，且所述的突变蛋白具有除草剂耐受活性(HPPD抑制剂类除草剂)。
本领域技术人员清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维结构产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不导致蛋白质生物活性的失活，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的蛋白可以在氨基酸序列中包含一个或多个保守性取代,这些保守性取代最好根据表1进行替换而产生。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。保守氨基酸置换可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基处进行。“非必需”氨基酸残基是可以发生改变(缺失、取代或置换)而不改变生物活性的氨基酸残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性所需的。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替代的置换。氨基酸置换可以在HPPD的非保守区域中进行。一般而言，此类置换不对保守的氨基酸残基，或者不对位于保守基序内的氨基酸残基进行，其中此类残基是蛋白质活性所需的。然而，本领域技术人员应当理解，功能变体可以具有较少的在保守区域中的保守或非保守改变。
本领域熟知，可以从蛋白质的N和/或C末端改变(置换、删除、截短或插入)一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，从HPPD蛋白的N和/或C末端改变了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的蛋白，也在本发明的范围内。这些改变可以包括通过现代分子方法例如PCR而引入的改变，所述方法包括借助于在PCR扩增中使用的寡核苷酸之中包含氨基酸编码序列而改变或延长蛋白质编码序列的PCR扩增。
应认识到，蛋白质可以以各种方式进行改变，包括氨基酸置换、删除、截短和插入，用于此类操作的方法是本领域通常已知的。例如，可以通过对DNA的突变来制备ACC蛋白的氨基酸序列变体。还可以通过其他诱变形式和/或通过定向进化来完成，例如，使用已知的诱变、重组和/或改组(shuffling)方法，结合相关的筛选方法，来进行单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入。
本领域技术人员能够理解，本发明HPPD蛋白中的这些微小氨基酸变化可以出现(例如天然存在的突变)或者产生(例如使用r-DNA技术)而不损失蛋白质功能或活性。如果这些突变出现在蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则多肽的性质可改变，但多肽可保持其活性。如果存在的突变不接近催化结构域、活性位点或其它功能结构域中，则可预期较小影响。
本领域技术人员可以根据本领域已知的方法，例如定位诱变或蛋白进化或生物信息系的分析，来鉴定HPPD蛋白的必需氨基酸。蛋白的催化结构域、活性位点或其它功能结构域也能够通过结构的物理分析而确定，如通过以下这些技术：如核磁共振、晶体学、电子衍射或光亲和标记，结合推定的关键位点氨基酸的突变来确定。
表1
最初的残基 代表性的取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
在一个实施方式中，所述的HPPD抑制剂类除草剂(或者，称之为HPPD抑制性除草剂)包括三酮类、二酮腈类、异噁唑类、吡唑类、二苯酮类、喹唑啉二酮类或其组合。三酮类除草剂优选双环磺草酮、硝磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、特呋三酮或氟吡草酮中的一种或任意几种；所述异噁唑类除草剂优选异噁唑草酮、异噁氯草酮、异恶草酮中的一种或任意几种；所述吡唑类除草剂优选苄草唑、吡草酮、吡唑特、磺酰草吡唑或苯唑草酮中的一种或任意几种；所述的喹唑啉二酮除草剂优选喹草酮、甲基喹草酮。
所述三酮类除草剂还包括CN104557739A、CN114774377A、CN110669016A、CN110669016B、或CN110963993B中所记载的化合物。
例如，CN104557739A和CN114774377A中记载的如下式的化合物(Y13287)：
Figure BDA0004212541320000051
又如，CN110669016B中记载的如下式的化合物：
Figure BDA0004212541320000061
其中，R为正丙基或环戊基。
又如，CN110963993B记载的如下式的化合物：
Figure BDA0004212541320000062
其中，Y为甲基或乙基，R为含C基团，R中的C原子与母核结构直接连接以构成C-N键，且R选自：萘基；杂芳基，该基团为不饱和环，具有选自O、S及N中的1至5个杂原子，且成环碳数为2至6，其中该基团任选由1或2个以上相同或相异的R5取代；杂环并苯基，除与苯基共有的键以外，该基团的杂环部分的成环键均为饱和键，且该基团中具有选自O、S及N中的1至5个杂原子，该基团中的成环碳数为7至11，且该基团任选由1或2个以上相同或相异的R7取代；苯并芳杂环基，除与苯基共有的键以外，该基团的芳杂环部分的成环键中含有不饱和键，且该基团中具有选自O、S及N中的1至5个杂原子，该基团的成环碳数为7至11，以及该基团中的苯基任选由1或2个以上相同或相异的R6取代；芳杂环并苯基，除与苯基共有的键以外，该基团的芳杂环部分的成环键中含有不饱和键，且该基团中具有选自O、S及N中的1至5个杂原子，该基团的成环碳数为7至11，以及该基团中的苯基任选由1或2个以上相同或相异的R6取代；环烷并苯基，除与苯基共有的键以外，该基团的环烷基部分的成环键均为饱和键，该基团中的成环碳数为7至10，且该基团任选由1或2个以上相同或相异的R6取代；苯并环烷基，除与苯基共有的键以外，该基团的环烷基部分的成环键均为饱和键，该基团中的成环碳数为7至12，且该基团任选由1或2个以上相同或相异的R6取代；其中，苯并芳杂环基表示其中的芳杂环直接与母核结构上的N原子连接，且所述芳杂环与苯环共同形成二环；芳杂环并苯基表示其中的苯环直接与母核结构上的N原子连接，且所述苯环与芳杂环共同形成二环；苯并环烷基表示其中的环烷基环直接与母核结构上的N原子连接，且所述环烷基环与苯环共同形成二环；环烷并苯基表示其中的苯环直接与母核结构上的N原子连接，且所述苯环与环烷基环共同形成二环；其中，R5选自C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素、C1-6卤烷基、苯氧基和苯硫基中的一种或多种；R6选自C1-6烷基中的一种或多种；R7选自C1-6烷基、C2-6烯基和卤素中的一种或多种，或者R7与成环的碳原子构成酮基。
在另一优选例中，所述的HPPD抑制性除草剂为三酮类HPPD抑制性除草剂。
在另一优选例中，所述的HPPD抑制性除草剂为Y13287。
在另一优选例中，所述的突变多肽与亲本HPPD多肽相比，其对最大HPPD抑制性除草剂的耐受浓度，提高至少1.5倍，优选提高至少2倍，优选提高至少3倍，优选提高至少4倍，优选提高至少5倍，优选提高至少6倍，优选提高至少10倍。
在另一优选例中，含有突变多肽的植物相比亲本型植物对HPPD抑制性除草剂的最大耐受浓度至少提高了2倍，优选提高了3倍，优选提高了4倍，优选提高了5倍，优选提高了6倍，优选提高了7倍，优选提高了8倍，优选提高了10倍，优选提高了12倍，优选提高了14倍，优选提高了16倍。
在另一优选例中，所述突变型HPPD多肽赋予植物至少0.01mg/L，优选至少0.02mg/L，优选至少0.03mg/L，优选至少0.05mg/L，优选至少0.08mg/L，优选至少0.1mg/L，优选至少0.2mg/L，优选至0.5mg/L，优选至少0.8mg/L，优选至少1mg/L，优选至少2mg/L，优选至少5mg/L，优选至少10mg/L-50mg/L浓度的HPPD抑制性除草剂的耐受性。
本发明另一方面，提供了一种融合蛋白，包含所述的突变多肽或其生物活性片段；进一步的，所述融合蛋白还包括与所述的突变多肽融合的蛋白，例如，标签肽、质体引导肽或调控元件。其中，标签肽如，组氨酸标签，6×His；质体引导肽，例如引导到叶绿体内的肽；调控元件，例如启动子序列、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、标记基因等。
本发明另一方面，提供了一种多核苷酸，编码所述突变多肽或其活性片段的多核苷酸，或者编码所述融合蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：基因组序列、cDNA序列、RNA序列、或其组合。
在另一优选例中，所述的多核苷酸优选是单链的或双链的。
在另一优选例中，所述的多核苷酸在所述突变多肽的ORF的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6His)、核定位信号或其组合。
在另一优选例中，该多核苷酸还包含与所述突变多肽的ORF序列操作性连接的启动子。
在另一优选例中，所述的启动子选自下组：组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子、或者强启动子。
本发明另一方面，提供一种核酸构建体，含有所述的多核苷酸以及与之可操作连接的调控元件。
在另一优选例中所述的调控元件选自下组中的一种或多种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多腺苷酸序列、标记基因。
另一方面，本发明还提供了一种载体，所述载体包含有编码本发明的突变型HPPD多肽或者融合蛋白的核酸序列，优选的，所述载体还包括与上述核酸序列可操作连接的表达调控元件。
在另一优选例中，所述的载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体或整合载体。
在一个实施方式中，载体可以是对宿主细胞内源性的HPPD基因进行基因编辑的载体。
在一个实施方式中，所述表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。
在一个实施方式中，所述载体可以是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。
载体可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。
优选地，本发明中的载体是质粒。
另一方面，本发明提供了一种编辑载体系统，所述编辑载体系统包含一种或多种载体，所述一种或多种载体至少包含靶向亲本HPPD的引导序列。所述引导序列含有部分亲本型HPPD的核苷酸序列，优选的至少含有15bp的HPPD核苷酸序列，更优选的至少包括20bp的HPPD核苷酸序列。在一种实施方式中，该编辑载体系统还包括基因编辑酶。所述基因编辑酶包括CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶技术TanscriptionActivator-like(TAL)effector nucleases)、ZFN(锌指核酸技术，Zincfinger nuclease)编辑工具的核酸酶。
优选地，所述基因编辑酶为Cas蛋白，又名CRISPR酶或Cas效应蛋白，其种类包括但并不限于：Cas9蛋白、Cas12蛋白、Cas13蛋白、Cas14蛋白、Csm1蛋白、FDK1蛋白。
优选的，Cas蛋白可操作的连接第一调节元件。
在一个实施方式中，所述基因编辑酶为Cas9蛋白，所述载体中还包括与该Cas9蛋白可以特异性结合的Scaffold序列。Scaffold序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(gRNA)。优选的，gRNA可操作的连接第二调节元件。
在其他的实施方式中，所述基因编辑酶为Cas12蛋白，例如，Cas12a、Cas12b、Cas12i，所述载体中还包括与该所述Cas12蛋白特异性结合的单向重复序列(DirectRepeat)。单向重复序列与引导序列可操作连接后，构成引导指导序列(gRNA)。优选的，gRNA可操作的连接第二调节元件。
上述调节元件包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。
优选的，所述编辑载体系统还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。
优选地，所述碱基编辑元件选自evoFENRY脱氨酶、APOBEC脱氨酶、或TadA脱氨酶。
在一种实施方式中，编辑载体中还包含抗性基因以便于筛选，所述抗性基因包括hyg、bar、kana、rif、spec、amp，所述抗性基因是本领域技术人员所熟知的。
优选的，Cas蛋白选用nCas9或其他有nick活性的Cas9蛋白。其中“n”表示nick，即只具有单链切割活性的Cas蛋白。
另一方面，本发明提供了一种基因编辑试剂，所述基因编辑试剂能够在植物中产生上述突变多肽；所述基因编辑试剂包括CRISPR/Cas蛋白和gRNA，所述gRNA可以靶向植物内源性的HPPD；任选的，所述基因编辑试剂还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。
优选地，所述碱基编辑元件选自evoFENRY脱氨酶、APOBEC脱氨酶、或TadA脱氨酶。
在另一个实施方式中，所述基因编辑试剂包括上述编辑载体系统。
本发明还提供了上述基因编辑试剂在制备具有HPPD抑制性除草剂抗性/耐受性的植物中的应用。
本发明还提供了一种赋予植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性/耐受性的方法或者制备具有HPPD抑制性除草剂抗性/耐受性的植物的方法，所述方法包括利用上述基因编辑试剂对植物进行基因编辑的步骤。
本发明另一方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有所述突变型HPPD、所述编码突变型HPPD的基因、所述融合蛋白、载体和核酸构建物中的一种或多种；或者，所述的宿主细胞基因组中整合有所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或动物细胞或植物细胞。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。
在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。
在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。
在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。
另一方面，本发明提供了一种具有除草剂抗性/耐受性的植株，所述植株含有所述突变型HPPD、所述编码突变型HPPD的多核苷酸、所述融合蛋白、载体和核酸构建物中的一种或多种；或者所述的植株基因组中整合有所述的多核苷酸。
本发明另一方面，提供一种制备所述突变多肽或其活性片段的方法，所述的方法包括步骤：
(a)在适合表达的条件下，培养包含所述突变多肽的宿主细胞，从而表达所述的突变多肽；和，任选的，
(b)分离所述的突变多肽。
本发明另一方面，提供一种耐受HPPD抑制性除草剂或对HPPD抑制性除草剂具有抗性/耐受性的植物细胞、植物组织、植物部分、植物，其中，所述植物细胞、植物组织、植物部分、植物含有所述的突变多肽或其多核苷酸序列。
本发明另一方面，提供一种赋予植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性或耐受性的方法，所述方法包括在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中引入所述HPPD突变多肽的步骤。
在另一优选例中，所述的方法中，引入HPPD突变多肽包括将HPPD突变多肽在植物细胞、植物组织、植物部分或植物中进行表达，例如，通过表达载体对所述突变多肽进行表达的，或者将所述编码突变多肽的多核苷酸整合到植物基因组上进行表达。
在另一优选例中，所述的方法中，引入HPPD突变多肽包括自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、X射线或Y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑。
在另一优选例中，上述方法包括以下步骤：
(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有所述的突变多肽或其活性片段的DNA编码序列；
(2)将植物细胞、植物组织、植物部分与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述突变多肽或其活性片段的DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；和
(3)选择已转入所述突变多肽或其活性片段的DNA编码序列的植物细胞。
在另一优选例中，所述方法中，引入HPPD突变多肽包括将植物的内源性HPPD进行突变从而引入所述突变多肽的步骤。
在另一优选例中，所述方法中，引入HPPD突变多肽包括将植物的内源性HPPD核苷酸序列进行突变并表达从而引入所述突变多肽的步骤。
在另一优选例中，所述的方法中，引入突变的方法包括自然变异、物理诱变(如紫外线诱变、X射线或Y射线诱变)、化学诱变(如亚硝酸、羟胺、EMS、亚硝基胍等)、生物诱变(如病毒或细菌介导的诱变)、基因编辑。
在另一优选例中，所述的方法包括将以下步骤：
(1)在植物细胞、植物组织、植物部分中引入含有基因编辑工具的表达载体；
(2)使基因编辑工具作用于其内源性HPPD编码序列，并使其在相应于SEQ ID No.1的上述突变位点发生突变；
(3)筛选突变的植物细胞、植物组织、植物部分；
(4)分离所述的基因编辑工具。
在另一优选例中，所述的基因编辑工具包括CRISPR、TALEN和ZFN。
本发明另一方面，提供一种试剂，所述试剂可用于提高植物细胞、植物组织或植物的除草剂抗性或耐受性，所述的试剂含有本发明所述的突变多肽或编码突变多肽的核苷酸。
本发明另一方面，提供了所述突变多肽、所述多核苷酸、所述融合蛋白、所述核酸构建体或所述载体在培育(制备)对HPPD抑制性除草剂具有抗性或耐受性的植物、或制备用于培育对HPPD抑制性除草剂具有抗性或耐受性的植物的试剂或试剂盒中的用途。
本发明另一方面，提供一种鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分的方法，包括：(i)提供转化的植物细胞、植物组织，植物或其部分，其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分包含所示的多核苷酸或其变体或衍生物，其中多核苷酸编码作为选择标记使用的突变多肽，并且其中所述转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份可以包含另一种分离的多核苷酸部份包含；(ii)使转化的植物细胞、植物组织、植物或其部份与至少一种HPPD抑制性除草剂接触；(iii)确定植物细胞、植物组织、植物或其部分是否受抑制性除草剂影响；和(iv)鉴定或选择转化的植物细胞、植物组织、植物或其部分。
本发明另一方面提供一种在植物栽培地点控制不想要的植物有效量的方法，所述方法包括：
(1)在所述的栽培地点提供包含所述的突变多肽或所述的多核苷酸或所述的核酸构建体或所述载体的植物；
(2)，将植物进行栽培，在所述的栽培地点施用有效量的HPPD抑制性除草剂。
在一个实施方式中，所述不想要的植物为杂草。
另一方面，本发明还提供了一种控制植物附近杂草生长的方法，其包括：
a)提供上述对除草剂具有抗性的植物；
b)向所述植物和其附近的杂草施用有效量的除草剂，从而控制所述植物附近的杂草。
在另一优选例中，所述植物包括被子植物和裸子植物。
在另一优选例中，所述植物包括单子叶植物和双子叶植物。
在另一优选例中，所述植物包括草本植物和木本植物。
在另一优选例中，所述植物包括拟南芥、烟草、水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、小米、大豆、番茄、马铃薯、藜麦、生菜、油菜、白菜、草莓。
在一个实施方式中，所述的HPPD抑制剂类除草剂(或者，称之为HPPD抑制性除草剂)包括三酮类、二酮腈类、异噁唑类、吡唑类、二苯酮类、喹唑啉二酮类或其组合。三酮类除草剂优选双环磺草酮、硝磺草酮、甲基磺草酮、环磺酮、特呋三酮或氟吡草酮中的一种或任意几种；所述异噁唑类除草剂优选异噁唑草酮、异噁氯草酮、异恶草酮中的一种或任意几种；所述吡唑类除草剂优选苄草唑、吡草酮、吡唑特、磺酰草吡唑或苯唑草酮中的一种或任意几种；所述的喹唑啉二酮除草剂优选喹草酮、甲基喹草酮。
在另一优选例中，所述的HPPD抑制性除草剂为三酮类HPPD抑制性除草剂。
在另一优选例中，所述的HPPD抑制性除草剂为Y13287。
一般定义
除非本申请定义，本发明中所使用的科学术语或专业名词具有本领域技术人员所理解的含义，当本领域技术人员理解的含义与本申请所定义的含义出现矛盾时，以本申请所定义的含义为准。
如本文所用，术语“AxxB”表示第xx位的氨基酸A变为氨基酸B，例如“G207S”表示第207位的氨基酸G突变为S，以此类推。对于同一位点的多种突变类型，各类型之间以“/”隔开，例如P336D/L表示相对于SEQ ID No.1的氨基酸序列而言，第336位的脯氨酸被天冬氨酸或亮氨酸取代。对于双重或多重突变，各突变之间以“/”或“+”隔开，例如，L54F+G207S+K401E或L54F/G207S/K401E表示相对于SEQ ID No.1的氨基酸序列而言，第54位的L被F取代，第207位的G被S取代，第401位的K被E取代。
如本文所用，术语“HPPD”是指对羟苯基丙酮酸双氧化酶(4-Hydroxyphenylpyruvate Dioxygenase，HPPD，EC 1.13.11.27)，其存在于各种生物体中，是催化酪氨酸的降解产物-对羟苯基丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate，HPP)加氧生成尿黑酸(homogentisate，HGA)反应的关键酶。HPPD的抑制会导致植物细胞内的光合作用解偶联、辅助捕光色素缺乏，同时由于缺乏通常由类胡萝卜素提供的光保护作用，活性氧中间体和光氧化导致叶绿素破坏，结果造成植物光合作用组织产生白化症状，生长受到抑制，直至死亡。HPPD抑制类除草剂已证实是非常有效的选择性除草剂，具有广谱的除草活性，既可在芽前也可以在芽后使用，具有活性高、残留低、对哺乳动物安全和环境友好等特点。
如本文所用，术语“HPPD抑制剂”、“HPPD除草剂”“HPPD抑制性除草剂”、“HPPD抑制类除草剂”可互换使用，是指本身有除草活性的物质或者与能改变其效果的其他除草剂和/或添加剂合用的物质，其通过抑制HPPD而起作用，表现为抑制植物生长甚至使植物死亡的制剂。本身能够通过抑制HPPD而起除草作用的物质在本领域中是熟知的，包括许多类型，1)三酮类，例如，磺草酮(Sulcotrione，CAS号：99105-77-8)；硝磺草酮(Mesotrione，CAS号：104206-82-8)；氟吡草酮(bicyclopyrone，CAS号：352010-68-5)；环磺酮(tembotrione，CAS号：335104-84-2)；呋喃磺草酮(tefuryltrione，CAS号：473278-76-1)；双环磺草酮(Benzobicyclon，CAS号：156963-66-5)；2)二酮腈类，例如，2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-4-三氟甲基苯基)丙-1,3-二酮(CAS号：143701-75-1)；2-氰基-3-环丙基-1-(2-甲基磺酰基-3,4-二氯苯基)丙-1,3-二酮(CAS号：212829-55-5)；2-氰基-1-[4-(甲基磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙-1,3-二酮(CA S号：143659-52-3)；3)异噁唑类，例如，异噁氟草(isoxaflutole，又称异噁唑草酮，CAS号：141112-29-0)；异噁氯草酮(isoxachlortole，CAS号：141112-06-3)；异恶草酮(clomazone，CAS号：81777-89-1)；4)吡唑类，例如，苯唑草酮(topramezone，CAS号：210631-68-8)；磺酰草吡唑(pyrasulfotole，CAS号：365400-11-9)；苄草唑(pyrazoxyfen，CAS号：71561-11-0)；吡唑特(pyrazolate，CAS号：58011-68-0)；吡草酮(benzofenap，CAS号：82692-44-2)；双唑草酮(CAS号：1622908-18-2)；Tolpyralate(CAS号：1101132-67-5)；苯唑氟草酮(CAS号：1992017-55-6)；环吡氟草酮(CAS号：1855929-45-1)；三唑磺草酮(CAS号：1911613-97-2)；5)二苯酮类；6)喹唑啉二酮类，是指含有如图所示
Figure BDA0004212541320000121
喹唑啉二酮母核结构的HPPD抑制剂类化合物，如公开号CN110669016A、CN104557739A、WO2019196904A1等专利中公开的化合物，如喹草酮(CAS号：1639426-14-4)、甲基喹草酮(CAS号)、6-(2-羟基-6-氧化环己1-烯-1)。7)其他类：lancotrione(CAS号：1486617-21-3)；fenquinotrione(CAS号：1342891-70-6)。优选地，所述除草剂是三酮类；更优选地，所述除草剂是Y13287；所述的除草剂可以综合考虑所适用作物或杂草的类型，在于出苗前、出苗后、种植前和种植时控制不想要植物(如杂草)。
术语“有效量”或“有效浓度”分别意指这样的量或浓度，所述量或浓度足够杀死相似的亲本(或野生型)植物、植物组织、植物细胞或宿主细胞或抑制其生长，但是所述量不杀死本发明的抗除草剂植物、植物组织、植物细胞和宿主细胞或不严重抑制其生长。一般地，除草剂的有效量是农业生产系统中例行用来杀死目的杂草的量。这种量是本领域普通技术人员已知的。本发明所述的除草剂是在任何生长阶段或在种植或出苗之前直接施加至植物或施加至植物的地点时，它们显示除草活性。观察到的效果取决于待控制的植物物种、植物的生长阶段、稀释物的施加参数和喷雾液滴大小、固态组分的粒度、使用时的环境条件、所用的具体化合物、使用的具体辅助剂和载体、土壤类型等，以及施加的化学品的量。如本领域已知，可以调节这些因素和其他因素以促进非选择性或选择性除草作用。
术语“亲本核苷酸或多肽”指的是可以在自然界中被发现存在的核酸分子或多肽(蛋白质)，其包括未经人工改造的野生型核酸分子或蛋白质(多肽)，也可以包括经过人工改造但不含有本发明内容的核酸分子或蛋白质(多肽)。其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(PCR)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述“亲本植物”即含有亲本核苷酸或多肽的植物。所述“亲本核苷酸或多肽”可以根据本领域技术人员所熟知的技术从亲本植物中进行提取，亦可通过化学合成的方法获得。所述亲本HPPD多肽的氨基酸序列，例如SEQ ID No.1所示。
本发明所述的“耐受性”或“抗性”是指HPPD蛋白或含有蛋白的细胞、组织或植物体，在保持酶活性或生存力或植物生长情况下，所能承受除草剂的能力，一般可以用除草剂的使用量或使用浓度等参数进行表征。进一步的，本发明中“对HPPD抑制性除草剂的耐受性增强”或“对HPPD抑制性除草剂的抗性增强”的HPPD酶是指这样的HPPD酶，与亲本HPPD酶在同等条件保持其将对羟基苯丙酮酸催化转化为尿黑酸的活性下，其最大耐受浓度，表现出比亲本HPPD酶高至少1.5-10倍。“对HPPD抑制性除草剂的耐受性增强”或“对HPPD抑制性除草剂的抗性增强”的植物是指这样的植物，其对所述HPPD抑制性除草剂的耐受性或抗性与含有亲本HPPD基因的植物相比提高，其耐受浓度相比亲本植物的耐受浓度高至少2倍-16倍。本发明所述的提高“耐受性”或“抗性”的最佳程度为在同等除草剂使用量或浓度下，可以减少或抑制或杀死不想要植物但不影响含有本发明所述突变蛋白的植物的生长或生存能力。
本发明所述“赋予植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性或耐受性”是包括针对亲本植物中没有对HPPD抑制性除草剂的抗性或耐受性，或亲本植物对HPPD抑制性除草剂有一定或较低的耐受性(在同等除草剂的浓度下)，通过向植物中引入本发明所述的突变多肽或编码突变多肽的核苷酸，从而给予没有抗性的植物一定程度的除草剂抗性或耐受性，提高具有一定或较低耐受性的植物对除草剂的耐受性。
术语“蛋白”、“多肽”和“肽”在本发明中可以互换使用，指的是氨基酸残基聚合物，包括其中一个或多个氨基酸残基是天然氨基酸残基的化学类似物的聚合物。本发明的蛋白和多肽可以重组产生，也可以通过化学合成。术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。如本文所用，术语“除草剂抗性多肽”、“突变的HPPD多肽”、“突变型HPPD多肽”、“突变HPPD蛋白”、“突变HPPD酶”、“突变蛋白”、“突变多肽”、“本发明多肽”等可互换使用。
术语“编码”是指多核苷酸中特定核苷酸序列的固有特性，例如基因，cDNA或mRNA，作为在具有限定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列及其产生的生物学特性的生物学过程中合成其它聚合物和大分子的模板。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码该蛋白质。
术语“氨基酸”是指含有氨基的羧酸。生物体内的各种蛋白质是由20种基本氨基酸构成的。
术语“突变蛋白”或“突变型蛋白”指的是这样的蛋白质，其与亲本蛋白质的氨基酸序列相比，具有一个或多个氨基酸残基的取代、插入、缺失和/或添加。
本发明中，氨基酸残基可以用单字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(Ala，A)，缬氨酸(Val，V)，甘氨酸(Gly，G)，亮氨酸(Leu，L)，谷酰胺酸(Gln，Q)，苯丙氨酸(Phe，F)，色氨酸(Trp，W)，酪氨酸(Tyr，Y)，天冬氨酸(Asp，D)，天冬酰胺(Asn，N)，谷氨酸(Glu，E)，赖氨酸(Lys，K)，甲硫氨酸(Met，M)，丝氨酸(Ser，S)，苏氨酸(Thr，T)，半胱氨酸(Cys，C)，脯氨酸(Pro，P)，异亮氨酸(Ile，I)，组氨酸(His，H)，精氨酸(Arg，R)。
术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸分子”和“核酸”可以互换使用，包括DNA、RNA或者其杂交体，可以是双链或单链的。
如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调节元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
在本发明中，“宿主生物”应理解为可以引入突变型HPPD蛋白编码核酸的任何单细胞或多细胞生物，包括例如细菌如大肠杆菌，真菌如酵母(例如酿酒酵母)、霉菌(例如曲霉菌)，植物细胞和植物等。
术语“调控元件”又称“调节元件”，如本文中所使用的，旨在包括启动子、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因、增强子、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)，其详细描述可参考戈德尔(Goeddel)，《基因表达技术：酶学方法》(GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY:METHODS IN ENZYMOLOGY)185，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福尼亚州(1990)。在某些情况下，调控元件包括指导一个核苷酸序列在许多类型的宿主细胞中的组成型表达的那些序列以及指导该核苷酸序列只在某些宿主细胞中表达的那些序列(例如，组织特异型调节序列)。组织特异型启动子可主要指导在感兴趣的期望组织中的表达，所述组织例如肌肉、神经元、骨、皮肤、血液、特定的器官(例如肝脏、胰腺)、或特殊的细胞类型(例如淋巴细胞)。在某些情况下，调控元件还可以时序依赖性方式(如以细胞周期依赖性或发育阶段依赖性方式)指导表达，该方式可以是或者可以不是组织或细胞类型特异性的。在某些情况下，术语“调控元件”涵盖的是增强子元件，如WPRE；CMV增强子；在HTLV-I的LTR中的R-U5’片段((Mol.Cell.Biol.，第8(1)卷，第466-472页，1988)；SV40增强子；以及在兔β-珠蛋白的外显子2与3之间的内含子序列(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，第78(3)卷，第1527-31页，1981)。
如本文中所使用的，术语“启动子”具有本领域技术人员公知的含义，其是指一段位于基因的上游能启动下游基因表达的非编码核苷酸序列。组成型(constitutive)启动子是这样的核苷酸序列：当其与编码或者限定基因产物的多核苷酸可操作地相连时，在细胞的大多数或者所有生理条件下，其导致细胞中基因产物的产生。诱导型启动子是这样的核苷酸序列，当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当对应于所述启动子的诱导物在细胞中存在时，其导致所述基因产物在细胞内产生。组织特异性启动子是这样的核苷酸序列：当可操作地与编码或者限定基因产物的多核苷酸相连时，基本上只有当细胞是该启动子对应的组织类型的细胞时，其才导致在细胞中产生基因产物。
“核定位信号”或“核定位序列”(NLS)是对蛋白质“加标签”以通过核转运导入细胞核的氨基酸序列，即，具有NLS的蛋白质被转运至细胞核。典型地，NLS包含暴露在蛋白质表面的带正电荷的Lys或Arg残基。示例性核定位序列包括但不限于来自以下的NLS：SV40大T抗原，EGL-13，c-Myc以及TUS蛋白。
如本文中所使用的，术语“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以一种允许该核苷酸序列的表达的方式被连接至该一种或多种调控元件(例如，处于一种体外转录/翻译系统中或当该载体被引入到宿主细胞中时，处于该宿主细胞中)。
术语“载体”是包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。其通常携带不是细胞中心代谢的一部分的基因，并且通常是双链DNA的形式。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。如果使用载体，则载体的选择取决于本领域技术人员众所周知的用于转化宿主细胞的方法。例如，可以使用质粒载体。
术语“植物”应理解为能够进行光合作用的任何分化的多细胞生物，在包括处于任何成熟或发育阶段的作物植物，特别是单子叶或双子叶植物，蔬菜作物，包括洋蓟、球茎甘蓝、芝麻菜、韭葱、芦笋、莴苣(例如，结球莴苣、叶莴苣、长叶莴苣)、小白菜(bok choy)、黄肉芋、瓜类(例如，甜瓜、西瓜、克伦肖瓜(crenshaw)、白兰瓜、罗马甜瓜)、油菜作物(例如，球芽甘蓝、卷心菜、花椰菜、西兰花、羽衣甘蓝、无头甘蓝、大白菜、小白菜)、刺菜蓟、胡萝卜、洋白菜(napa)、秋葵、洋葱、芹菜、欧芹、鹰嘴豆、欧洲防风草、菊苣、胡椒、马铃薯、葫芦(例如，西葫芦、黄瓜、小西葫芦、倭瓜、南瓜)、萝卜、干球洋葱、芜菁甘蓝、紫茄子(也称为茄子)、婆罗门参、苣菜、青葱、苦苣、大蒜、菠菜、绿洋葱、倭瓜、绿叶菜类(greens)、甜菜(糖甜菜和饲料甜菜)、甘薯、唐莴苣、山葵、西红柿、芜菁、以及香辛料；水果和/或蔓生作物，如苹果、杏、樱桃、油桃、桃、梨、李子、西梅、樱桃、榅桲、杏仁、栗子、榛子、山核桃、开心果、胡桃、柑橘、蓝莓、博伊增莓(boysenberry)、小红莓、穗醋栗、罗甘莓、树莓、草莓、黑莓、葡萄、鳄梨、香蕉、猕猴桃、柿子、石榴、菠萝、热带水果、梨果、瓜、芒果、木瓜、以及荔枝；大田作物，如三叶草、苜蓿、月见草、白芒花、玉米/玉蜀黍(饲料玉米、甜玉米、爆米花)、啤酒花、荷荷芭、花生、稻、红花、小粒谷类作物(大麦、燕麦、黑麦、小麦等)、高粱、烟草、木棉、豆科植物(豆类、小扁豆、豌豆、大豆)、含油植物(油菜、芥菜、罂粟、橄榄、向日葵、椰子、蓖麻油植物、可可豆、落花生)、拟南芥属、纤维植物(棉花、亚麻、大麻、黄麻)、樟科(肉桂、莰酮)、或一种植物如咖啡、甘蔗、茶、以及天然橡胶植物；和/或花坛植物，如开花植物、仙人掌、肉质植物和/或观赏植物，以及树如森林(阔叶树和常绿树，如针叶树)、果树、观赏树、以及结坚果的树(nut-bearing tree)、以及灌木和其他苗木。
术语“不想要的植物”理解为影响所需植物(如农作物)正常生长的、没有实用或应用价值的植物，可以包括杂草，例如双子叶和单子叶杂草。双子叶杂草包括，但不限于以下属的杂草：白芥属(Sinapis)、独行菜属(Lepidium)、拉拉藤Galium)、繁缕属(Stellaria)、母菊属(Matricaria)、春黄菊属(Anthemis)、牛膝菊属(Galinsoga)、藜属(Chenopodium)、荨麻属(Urtica)、千里光属(Senecio)、苋属(Amaranthus)、马齿苋属(Portulaca)、苍耳属(Xanthium)、旋花属(Convolvulus)、番薯属(Ipomoea)、蓼属(Polygonum)、田菁属(Sesbania)、豚草属(Ambrosia)、蓟属(Cirsium)、飞廉属(Carduus)、苦苣菜属(Sonchus)、茄属(Solanum)、蔊菜属(Rorippa)、节节菜属(Rotala)、母草属(Lindernia)、野芝麻属(Lamium)、婆婆纳属(Veronica)、苘麻属(Abutilon)、三棘果属(Emex)、曼陀罗属(Datura)、堇菜属(Viola)、鼬瓣花属(Galeopsis)、罂粟属(Papaver)、矢车菊属(Centaurea)、车轴草属(Trifolium)、毛莨属(Ranunculus)和蒲公英属(Taraxacum)。单子叶杂草包括，但不限于以下属的杂草：稗属(Echinochloa)、狗尾草属(Setaria)、黍属(Panicum)、马唐属(Digitaria)、梯牧草属(Phleum)、早熟禾属(Poa)、羊茅属(Festuca)、穇属(Eleusine)、臂形草属(Brachiaria)、黑麦草属(Lolium)、雀麦属(Bromus)、燕麦属(Avena)、莎草属(Cyperus)、高粱属(Sorghum)、冰草属(Agropyron)、狗牙根属(Cynodon)、雨久花属(Monochoria)、飘拂草属(Fimbristyslis)、慈姑属(Sagittaria)、荸荠属(Eleocharis)、藨草属(Scirpus)、雀稗属(Paspalum)、鸭嘴草属(Ischaemum)、尖瓣花属(Sphenoclea)、龙爪茅属(Dactyloctenium)、剪股颖属(Agrostis)、看麦娘属(Alopecurus)和阿披拉草属(Apera)。所述的不想要植物还可以包括与所要栽培植物不同的其他植物，例如在水稻栽培地自然生长的部分或少量大豆等作物。
在本发明中，术语“植物组织”或“植物部分”包括植物细胞、原生质体、植物组织培养物、植物愈伤组织、植物块以及植物胚、花粉、胚珠、种子、叶、茎、花、枝、幼苗、果实、核、穗、根、根尖、花药等。
在本发明中，“植物细胞”应理解为来自或发现于植物的任何细胞，其能够形成例如：未分化组织如愈伤组织，分化组织如胚胎，植物的组成部分，植物或种子。
在本发明中，术语“基因编辑”技术包括CRISPR技术、TALEN技术、ZFN技术。CRISPR技术中所指基因编辑工具包括guideRNA、Cas蛋白(如Cas9、Cpf1、Cas12b等)。TALEN技术中所指的基因编辑工具是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个TAL效应子DNA结合结构域和一个DNA切割结构域。ZFN技术中所指的基因编辑工具也是可以切割特定DNA序列的限制酶，其包括一个锌指DNA结合结构域与一个DNA切割结构域。本领域技术人员熟知，将编码基因编辑工具的核苷酸及其他调控元件构建于适宜的载体中，再转化细胞，可以实现对细胞内基因组的编辑，所述编辑的类型包括基因敲除、插入、碱基编辑。
在本发明中，术语“最大耐受浓度”是指在施用除草剂的情况下，对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)仍能基本保持其催化活性和/或不影响植物正常生长时所能承受的除草剂浓度，所述催化活性即HPPD将对羟基苯丙酮酸转化为尿黑酸的活性。
术语“同源性”或“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。因此，本发明的组合物和方法还包含本发明的核苷酸序列和多肽序列的同源物。可以通过包括但不限于以下的已知方法计算“同源性”：Computational Molecular Biology[计算分子生物学](Lesk,A.M.编辑)Oxford University Press[牛津大学出版社],纽约(1988)；Biocomputing:Informatics and Genome Projects[生物运算：信息学和基因组项目](Smith,D.W.编辑)Academic Press[学术出版社],纽约(1993)；ComputerAnalysis ofSequence Data,Part I[序列数据的计算机分析，第I部分](Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑)Humana Press[胡马纳出版社],新泽西州(1994)；Sequence Analysis in MolecularBiology[分子生物学中的序列分析](von Heinje,G.编辑)Academic Press[学术出版社](1987)；以及Sequence Analysis Primer[序列分析引物](Gribskov,M.和Devereux,J.编辑)Stockton Press[斯托克顿出版社],纽约(1991)。
本发明所述蛋白质内的特定氨基酸位置(编号)是利用标准序列比对工具通过将目标蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID NO.1进行比对而确定的，譬如用Smith-Waterman运算法则或用CLUSTALW2运算法则比对两个序列，其中当比对得分最高时认为所述序列是对准的。比对得分可依照Wilbur,W.J.and Lipman,D.J.(1983)Rapid similarity searchesofnucleic acid and protein data banks.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:726-730中所述的方法进行计算。在ClustalW2(1.82)运算法则中优选使用默认参数：蛋白质缺口开放罚分＝10.0；蛋白质缺口延伸罚分＝0.2；蛋白质矩阵＝Gonnet；蛋白质/DNA端隙＝-1；蛋白质/DNAGAPDIST＝4。优选采用AlignX程序(vectorNTI组中的一部分)，以适于多重比对的默认参数(缺口开放罚分:10og缺口延伸罚分0.05)通过将蛋白质的氨基酸序列与SEQ ID No.1进行比来确定本发明所述蛋白质内特定氨基酸的位置。例如，通过序列比对，确定在大豆作物中(序列登录号NP_001235148.2)其相应于SEQ ID No.1序列的176位为第214位。
应理解，本发明突变蛋白中的氨基酸编号基于SEQ ID No.1作出，当某一具体突变蛋白与SEQ ID No.1所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于SEQ ID No.1的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的N末端或C末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当认为由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似的除草剂耐受活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。
在本发明中，亲本对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白可以来源于任何植物，特别是前述单子叶或双子叶植物。现有技术文献中已经公开了一些来源的亲本(如野生型)对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白序列以及编码序列，这些现有技术文献在此引入本文作为参考。
优选地，本发明的亲本对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白来源于稻属，特别是水稻。更优选地，所述亲本对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
本发明还包括所述突变多肽(蛋白)还包括其活性片段、变体、衍生物和类似物包括以下所述的蛋白的任何取代、突变或修饰所产生的物质。
例如，本领域技术人员还清楚，可以改变蛋白质的结构而不对其活性和功能性产生不利影响，例如可以在蛋白质氨基酸序列中引入一个或多个保守性氨基酸取代，而不会对蛋白质分子的活性和/或三维构型产生不利影响。本领域技术人员清楚保守性氨基酸取代的实例以及实施方式。具体的说，可以用与待取代位点属于相同组的另一氨基酸残基取代该氨基酸残基，即用非极性氨基酸残基取代另一非极性氨基酸残基，用极性不带电荷的氨基酸残基取代另一极性不带电荷的氨基酸残基，用碱性氨基酸残基取代另一碱性氨基酸残基，和用酸性氨基酸残基取代另一酸性氨基酸残基。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。只要取代不损害蛋白质的生物活性，则一种氨基酸被属于同组的其他氨基酸替换的保守取代落在本发明的范围内。因此，本发明的突变型HPPD蛋白除了包含上述突变之外，还可以在氨基酸序列中包含一个或多个其他突变例如保守性取代。另外，本发明也涵盖还包含一个或多个其他非保守取代的突变型HPPD蛋白，只要该非保守取代不显著影响本发明的蛋白质的所需功能和生物活性即可。
如本领域中所熟知的，可以从蛋白质的N和/或C末端缺失一或多个氨基酸残基而仍保留其功能活性。因此，在另一方面，本发明还涉及从突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白的N和/或C末端缺失了一或多个氨基酸残基、同时保留了其所需功能活性的片段(比如含有本发明突变位点的氨基酸片段)，它们也在本发明的范围内，被称为生物活性片段。在本发明中，“生物活性片段”是指本发明的突变型HPPD蛋白的一部分，其保留了本发明的突变型HPPD蛋白的生物学活性、同时对HPPD抑制剂的耐受性或抗性相比于不具有所述突变的HPPD片段有所提高。例如，突变型HPPD蛋白的生物学活性片段可以是在所述蛋白质的N和/或C末端缺失了一个或多个(例如1-50个、1-25个、1-10个或1-5个，例如1、2、3、4或5个)氨基酸残基的部分，但其仍然保留了全长蛋白的生物学活性。
此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。
本发明还提供编码所述突变型HPPD多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。本领域技术人员十分清楚，由于遗传密码的简并性，有多种不同的核酸序列可以编码本文公开的氨基酸序列。产生编码相同蛋白质的其他核酸序列在本领域普通技术人员的能力范围内，因此本发明涵盖因遗传密码子的简并性而编码相同氨基酸序列的核酸序列。例如，为了在目标宿主生物例如植物中实现异源基因的高表达，可以对所述基因采用宿主生物偏好的密码子进行优化，以使其更好地表达。
本发明还包括严格条件下与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％匹配度的多核苷酸。优选地，所述严谨条件可以指6M尿素、0.4％SDS、0.5×SSC的条件或与其同等的杂交条件，也可以指严谨性更高的条件，例如6M尿素、0.4％SDS、0.1×SSC或与其同等的杂交条件，或杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等。在各种条件中，温度可约为40℃以上，如需要严谨性更高的条件时，温度例如可约为50℃，进一步可约为65℃。
本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。所获得的核苷酸序列可将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到大批量有关序列。本发明突变位点亦可通过人工合成引入。
本发明还提供了一种核酸构建体，其中包含编码本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白的核酸序列以及与之可操作连接的一个或多个调控元件。
术语“调控元件”在本发明中指的是能够调节与之可操作连接的核酸的转录和/或翻译的核酸序列。所述的调控元件包括启动子劽、终止子序列、前导序列、多聚腺苷酸化序列、信号肽编码区、标记基因等。
本发明所述的启动子可以是在选定宿主细胞内显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可能获自与宿主细胞同源或异源的编码细胞外或细胞内多肽的基因。作为在植物细胞或植物中表达的启动子，可使用对羟苯基丙酮酸双氧化酶天然的启动子，或者在植物中具有活性的异源启动子。所述启动子可以是组成型表达的，或者可以是诱导型表达的。启动子的实例包括例如组蛋白启动子，水稻肌动蛋白启动子，植物病毒启动子例如花椰菜花叶病毒启动子等。
本发明还提供了一种表达载体，其中包含有编码本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白的核酸序列以及与之可操作连接的表达调控元件。表达载体中还至少含有一个复制起点，以实现自我复制。载体的选择通常取决于载体与该载体待引入之宿主细胞的相容性。载体可能是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制不依赖于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。该载体可能包含保证自我复制的任何元件。或者，所述载体可能是当引入宿主细胞时被整合入基因组中并与其所整合入的染色体一起复制的载体。此外，可使用单个载体或质粒或者一起包含待引入宿主细胞基因组之总DNA的两个或更多个载体或质粒，或者转座子。或者，所述载体也可以是对宿主细胞内源性的HPPD基因进行基因编辑的载体。
载体可以是例如质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的，在本领域中众多描述。优选地，本发明中的表达载体是质粒。表达载体可包含启动子、翻译起始的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、转录终止子、增强子等。表达载体中也可以含有一个或多个可选择标记基因以便用于选择包含载体的宿主细胞。这种可选择的标记包括编码二氢叶酸还原酶的基因，或赋予新霉素耐受性的基因，赋予对四环素或氨苄青霉素耐受性的基因等。
本发明的载体可以包含允许载体整合入宿主细胞基因组或在细胞内不依赖于基因组而自主复制的元件。对于整合进入宿主细胞基因组的方面，所述载体可依靠编码多肽的多核苷酸序列或适于通过同源或非同源重组整合入基因组的载体的任何其它元件。或者，载体可包含用于指导在染色体的准确位置通过同源重组整合入宿主细胞基因组的附加的核苷酸序列。为了提高在准确位置处整合的可能性，整合元件应优选包含足够数目的核酸，譬如100至10,000个碱基对，优选400至10,000个碱基对，更优选800至10,000个碱基对，它们与相应的靶序列具有高度的同一性以提高同源重组的概率。整合元件可能是与宿主细胞基因组内靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可能是非编码的或编码的核苷酸序列。另一方面，载体可能通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组内。对于自主复制而言，载体可能进一步包含能使载体在所述宿主细胞内自主复制的复制起点。复制起点可能是在细胞内发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语″复制起点″或″质粒复制子″在此定义为能使质粒或载体在体内进行复制的核苷酸序列。
可将一拷贝以上的本发明之多核苷酸插入宿主细胞中以提高基因产物的产量。可通过将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组中或者通过将可扩增的可选择标记基因与所述多核苷酸包含在一起来达到多核苷酸拷贝数目的增加，在后一情形下，包含扩增拷贝的选择标记基因以及由此而来的附加拷贝的多核苷酸的细胞可通过在适当的可选择制剂存在的条件下人工培养所述细胞进行选择。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含除草剂抗性多肽编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
本发明中适用的载体包括可从商业渠道获得的质粒，例如但不限于：pBR322(ATCC37017)，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)，GEM1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)pQE70，pQE60，pQE-9(Qiagen)，pD10，psiX174pBluescript IIKS，pNH8A，pNH16a，pNH18A，pNH46A(Stratagene)，ptrc99a，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)，pKK232-8，pCM7，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)，pSVK3，pBPV，pMSG，和pSVL(Pharmacia)等。
本发明还提供了包含本发明核酸序列、核酸构建体或表达载体的宿主细胞。将包含编码本发明的载体引入宿主细胞中使得载体作为染色体整合体的一部分存在或如早先所述作为自我复制的染色体外载体存在，或者载体可以对宿主细胞内源性的HPPD基因进行基因编辑。宿主细胞可以是本领域技术人员熟悉的任何宿主细胞，包括原核生物细胞和真核生物细胞。
本发明的核酸序列、核酸构建体或表达载体可以通过多种技术导入宿主细胞，包括转化、转染、转导、病毒感染、基因枪或Ti-质粒介导的基因传递，以及钙磷酸盐转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔等。
本发明还涉及产生突变型HPPD蛋白或其生物活性片段的方法。包括：(a)在有助于所述突变型HPPD蛋白或其生物活性片段或融合蛋白生产的条件下培养上述宿主细胞；和(b)分离所述突变型HPPD蛋白或其生物活性片段或融合蛋白。
在本发明的生产方法中，用本领域众所周知的方法将所述细胞培养于适于所述多肽产生的营养培养基上。若所述多肽被分泌入营养培养基中，则可直接从培养基中回收该多肽。若所述多肽不分泌到培养基中，则可从细胞裂解物中回收它。
可用本领域已知特异于所述多肽的方法检测该多肽。这些检测方法可包括使用特异抗体、形成酶产物或酶底物的消失。
产生的多肽可用本领域已知的方法回收。例如，可以通过离心收获细胞，用物理的或化学的方法使之破碎，并保留得到的粗提取液以进一步纯化。可以用任何方便的方法裂解表达本发明的突变型HPPD蛋白或其生物活性片段或融合蛋白的转化宿主细胞，包括冻融循环、超声波、机械破碎或使用细胞溶解剂。这些方法是本领域技术人员熟知的。可以从转化宿主细胞的培养物中回收和纯化本发明的突变型HPPD蛋白或其生物活性片段，采用的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲合层析、羟磷灰石层析和植物血凝素层析等等。
本发明还涉及一种制备对HPPD抑制型除草剂具有耐受性或抗性的宿主生物特别是植物细胞、植物组织、植物部分或植物的方法，其中包括用包含本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白或其生物活性片段的编码核酸序列、包含所述核酸序列的核酸构建体或表达载体对所述宿主生物进行转化，合适的载体和选择标记是本领域技术人员所熟知的。宿主细胞例如植物细胞的转化方法是现有技术中已知的，包括例如原生质体转化、融合、注射、电穿孔、PEG介导的转化、离子轰击、病毒转化、农杆菌介导的转化、电穿孔或轰击等。现有技术中描述了一系列这样的转化方法，例如EP1186666中描述了大豆转化的技术，WO 92/09696中描述了单子叶植物特别是水稻转化的合适技术等。还可以有利地用根癌农杆菌或发根农杆菌培养植物外植体，以将DNA转移进植物细胞。然后可以在合适的培养基中从感染的植物材料部分(如叶碎片、茎节段、根以及原生质体或悬浮培养的细胞)再生完整植物，所述培养基可以含有用于选择的抗生素或杀虫剂。转化细胞以通常的方式在植物中生长，它们可以形成生殖细胞并将转化的性状传递到子代植物。这样的植物能以正常方式培养并与具有相同转化遗传因子或其他遗传因子的植物杂交。得到的杂合个体具有相应的表型特性。
本发明还提供了一种提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物的HPPD抑制性除草剂耐受性或抗性的方法，其中包括用包含本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白的编码核酸序列的核酸分子转化所述植物或其部分，并使之表达。所述核酸分子可以作为染色体外实体存在而进行表达，或者可以整合到植物细胞的基因组中实现表达，特别是通过同源重组整合到植物细胞的内源基因位置处实现表达。
发明还提供了一种提高植物或其部分的HPPD抑制性除草剂耐受性或抗性的方法，其中包括将表达本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶(HPPD)蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白的植物与另一植物杂交，以及筛选具有提高的HPPD抑制性除草剂抗性或耐受性的植物或其部分。
本发明还提供了一种提高植物细胞、植物组织、植物部分或植物中的HPPD抑制性除草剂耐受性或抗性的方法，其中包括对所述植物细胞、植物组织、植物部分或植物的内源性HPPD蛋白进行基因编辑，以实现在其中表达本发明的突变型对羟苯基丙酮酸双氧化酶蛋白或其生物活性片段或者融合蛋白。
本发明进一步涉及通过上述方法获得的植物细胞、植物组织、植物部分和植物，及其后代。优选地，可以将转化了本发明多核苷酸的植物细胞、植物组织或植物部分再生为整个植株。本发明包括细胞培养物，包括组织细胞培养物、液体培养物和固体平板培养物。由本发明植物所产生和/或用于再生本发明植物的种子也包括在本发明范围内。其他植物组织和部分也包括在本发明中。本发明同样包括产生含有本发明核酸分子的植物或细胞的方法。产生这类植物的一种优选方法为通过种植本发明的种子。以这种方式转化的植物可以获得对多种具有不同作用模式的除草剂的抗性。
本发明还提供了一种在植物栽培地控制不想要植物有效量的方法，或者控制植物附近杂草生长的方法，其包括：对包含本发明的植物或种子的栽培地施用控制不想要植物有效量的一种或多种HPPD抑制性除草剂。
在本发明中，术语“栽培地”包括栽培本发明植物的场地例如土壤，也包括例如植物种子、植物苗以及长成的植物。术语“控制不想要植物有效量”指的是除草剂的量足以影响不想要植物，如杂草，的生长或发育，例如阻止或抑制不想要植物的生长或发育，或者杀灭所述不想要植物。有利地，所述控制不想要植物有效量不会显著影响本发明植物种子、植物苗或植物的生长和/或发育。本领域技术人员可以通过常规实验确定这样的控制不想要植物有效量。
本发明的主要优点：
本发明筛选出了一种对HPPD抑制剂类除草剂具有较高抗性的HPPD突变多肽，可以用于制备对HPPD抑制剂类除草剂具有抗性或耐受的植物。
附图说明
图1.96孔和方形板固体培养筛选对HPPD抑制性除草剂有抗性的菌株的方法，圈出的部分为可能具有HPPD抑制性除草剂抗性的菌株。图1A为96孔固体培养筛选对HPPD抑制性除草剂有抗性的菌株的方法，每96孔板的左下第一个孔为阳性对照组，第二个孔为阴性对照组。图1B为方形板固体培养筛选对HPPD抑制性除草剂有抗性的菌株的方法，每个方形板的右上第一个为阴性对照组，第二个为阳性对照组。
图2.野生型OsHPPD的大肠杆菌(WT)和HPPD-207菌株在除草剂Y13287浓度为0、2、2.5和3mg/L时的颜色，第一、二、三组为三次重复实验的结果。
图3.野生型OsHPPD的大肠杆菌(WT)和菌株HPPD-148在除草剂Y13287浓度为0、1.5、2、2.5mg/L时的颜色，第一、二组为两次重复实验的结果。
图4.野生型OsHPPD的大肠杆菌(WT)、菌株HPPD-75、菌株HPPD-228、菌株HPPD-333在除草剂Y13287浓度为0、2.5、3mg/L时的颜色。
图5.野生型OsHPPD的大肠杆菌(WT)、菌株HPPD-75、菌株HPPD-228和菌株HPPD-333在除草剂Y13287浓度为0、2.5、3mg/L时的OD值。
图6.野生型OsHPPD的大肠杆菌(WT)、菌株HPPD-54/207/401和菌株HPPD-54/133/207/401在除草剂Y13287浓度为0、2.5、3、3.5mg/L时的颜色。
图7.野生型OsHPPD的大肠杆菌(WT)、菌株HPPD-27/45/75/148/228/333在除草剂Y13287浓度为0、2、2.5、3mg/L时的颜色。
图8.野生型OsHPPD的大肠杆菌(WT)、菌株HPPD-54/207/401和菌株HPPD-54/133/207/401在除草剂Y13287浓度为0、2、2.5、3mg/L时的OD值。
图9.OsHPPD蛋白序列第207位的不同突变类型的大肠杆菌的除草剂抗性，不同突变的克隆在添加除草剂Y13287后的颜色反应，其中，WT为野生型。
图10.OsHPPD蛋白序列第207位的不同突变类型的大肠杆菌的除草剂抗性，不同突变的克隆在添加除草剂Y13287后的OD值，其中，WT为野生型。
图11.野生型水稻植株(WT)和OsHPPD蛋白具有G207S编辑的水稻植株(OsHPPD-G207S)的除草剂抗性。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
以下实验内容结合实施例子对本发明作进一步的解释说明。在这些实施例中描述的所有方法和操作是以举例方式提供的，其不应被理解为限制性的。有关DNA的操作的方法可以参照Current Protocols in Molecular Biology，第1和2卷，Ausubel F.M.GreenePublishing Associates and Wiley Interscience,1989,Molecular Cloning,T.Maniatis et al.,1982，或者Sambrook J.and RussellD.,2001，Molecular Cloning:alaboratory manual,version 3。
实施例1、对OsHPPD抑制剂化合物抗性位点的筛选
HPPD广泛存在于各类生物体中，包括植物、动物和微生物。在植物体内，酪氨酸可以通过细胞内源的酪氨酸氨基转移酶生成对羟基丙酮酸(HPP)，HPP在HPPD的作用下转化为尿黑酸(HGA)，进而转化为光合作用中电子传递所需要的质体醌和生育酚。在微生物体内，HPPD催化底物转化生成的尿黑酸会进一步代谢为马来酰乙酰乙酸外，还会被氧化生成黑褐色的色素。在植物体内，HPPD基因功能被抑制，导致质体醌和生育酚无法生成，进而光合作用无法正常进行，致使植株叶片漂白、死亡。HPPD作为HPPD抑制剂类除草剂的靶标基因，抑制活性的HPPD将无法在生物体内催化尿黑酸(HGA)的生成，不会出现颜色反应。E.coli具备高通量的筛选特征，繁殖快、遗传转化容易。如果将HPPD突变后在大肠杆菌里表达，加入HPPD抑制剂类化合物后，HPPD还能催化对羟基丙酮酸生成尿黑酸，致使大肠杆菌液呈现黑褐色，就会反映出由于HPPD基因的突变，导致此抑制剂类除草剂不能抑制HPPD基因的功能。
本实施方式中，我们在含有酪氨酸和除草剂(HPPD抑制剂类化合物)的固体培养基上培养大肠杆菌，再根据颜色变化筛选HPPD基因对抑制剂类化合物有抗性的突变体位点。
1.1水稻OsHPPD基因的克隆
水稻(Oryzasativa)中对羟基丙酮酸双氧化酶(P-hydroxypyruvate dioxidase，HPPD)基因位于二号染色体Os02g0168100位点。根据其cDNA序列(NCBI编号XP_015626163.1)和克隆载体pMD19序列，设计扩增引物NcoI-OsHPPD-F：AAGAAGGAGATATACCATGCCTCCCACTCCCACCCCCAC和HindIII-OsHPPD-R：AGTGCGGCCGCAAGCTTCTAGGATCCTTGAACTGT。提取水稻叶片总RNA，反转录试剂盒获得cDNA。使用高保真酶进行PCR扩增获得OsHPPD基因编码序列。扩增片段与线性化的基因表达载体连接。
(1)cDNA获取：取水稻新鲜叶片，提取RNA，利用TakaLa试剂盒进行反转录，获得水稻cDNA；
(2)酶切载体：选择高效的原核表达载体pET-28a,筛选两个单一的酶切位点，含有用于筛选的氨苄青霉素抗性基因。100μL酶切体系：用ddH2O(补足至100μL)、Vector(4μg)、CutSmart(10μL)、Nco-I、Hind III(各2uL)混合，37℃反应1h即可；
(3)基因克隆：以OsHPPD编码序列作为扩增模板，设计引物，利用高保真酶进行PCR扩增获得OsHPPD基因编码序列，得到的水稻HPPD(OsHPPD)的核酸序列如SEQ ID No.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
(4)使用胶回收法：切胶回收称重并标记，按0.1g胶重：100μL比例加入BindingBuffer。期间每一次上柱量为700μL，12000rpm，30s离心，弃废液，如此反复，最后一次溶胶液离心为12000rpm，1min，弃废液，加入300μL Binding Buffer，12000rpm，1min离心，弃废液。用已加入无水乙醇的SPW Wash Buffer洗3遍。晾干柱子，加入55℃预热的ddH2O 40μL，12000rpm，1min离心，再加一次ddH2O 40μL，12000rpm，1min离心。混匀洗脱液，测浓度。
(5)同源重组连接载体：利用同源重组连接酶将线性化的酶切质粒与扩增片段进行连接，获得pET28a-OsHPPD载体，10uL连接体系，载体与插入片段摩尔比为1:3。反应条件为50℃，30min。
1.2OsHPPD随机突变和筛选
(1)根据载体pET-28a和OsHPPD序列,设计和合成引物Y122：ACTTTAAGAAGGAGATAT ACCATGCCTCCCACTCCCACCCCCAC和Y123：GGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTCTAGGATCCTTGAACTGTAG。以pET28a-OsHPPD载体作为扩增模板，利用引物Y122/Y123和安捷伦随机突变试剂盒(GeneMorph II Random Mutagenesis Kit)进行Error-prone PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳显示条带大小正确为1.4kb，切胶回收。
Figure BDA0004212541320000231
(2)以回收产物为模板,使用诺唯赞Taq Master Mix(Dye Plus)保真试剂盒进行二次扩增，扩增条件为：95℃3min，95℃15s，62℃15s，72℃1min 30s，重复30次；72℃5min。琼脂糖凝胶电泳显示条带大小正确为1.4Kb，回收后通过分光光度计Nanodrop确定OsHPPD-mut DNA片段浓度。
(3)取适量OsHPPD-mut DNA片段与MfeI-HF(NEB,New England Biolabs,Boston,USA)线性化的pet-28a载体混合(载体与插入片段摩尔比1:3)，加入2x Basic AssemblyMix(全式金同源重组试剂盒
Figure BDA0004212541320000233
-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit)，混匀后，于50℃条件下孵育30min。
Figure BDA0004212541320000232
(4)取适量的连接产物，将连接产物加入到BL21(DE3)中，用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰上静置25min。42℃水浴热激45s，迅速放回冰上并静置两分钟(期间晃动会降低效率)。向离心管中加入700uL不含抗生素的LB无菌培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min。5000rpm离心1min收菌，留取100uL左右的上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含有Kan抗生素的LB培养基上，将平板倒置于37℃培养箱过夜培养。
(5)将长出的单菌落用牙签蘸取，转移至含有HPPD抑制剂类除草剂、底物酪氨酸(1％)和IPTG(0.5mmol/L)诱导剂的96孔板LB固体培养基上，并转化的野生型OsHPPD的大肠杆菌作为阴性对照组，转化的有抗性位点的OsHPPD的大肠杆菌作为阳性对照组，室温倒置培养24-48h后观察显色程度。
配置LB+Tyr(0.1％)固体培养基(加入20ml/L 5％Tyr，0.5mmol IPTG和Kan抗生素100mg/L)，96孔板中加入上述配置的培养基170uL，从上述转化的大肠杆菌平板上，挑取OsHPPD野生型和突变体(OsHPPD-Mut)单克隆进行96孔板固体培养。根据筛选药物的浓度加入HPPD抑制剂。
方形板固体培养的配制方法同96孔板固体培养基，只是接种大肠杆菌采用加入一定体积菌液的方式。
(6)颜色观察：置于室温中静置培养24-48h。用目视或检测培养物在405nm的光吸收，进一步检验不同突变位点的颜色与野生型的对比。
液体筛选体系具有高效、稳定且易观察等优点。为了进一步验证位点的除草剂抗性，在本实验中使用液体筛选体系中进一步进行抗性验证。取50μL甘油保存菌液加入到含有卡纳霉素的LB液体培养基中过夜复苏，使用100mL锥形瓶作为培养皿，每瓶中各加入20mLLB+Tyr(1％)液体培养基，加入200μL过夜培养的菌液，三个独立重复，封口膜密封于37℃，220rpm培养1-2个小时左右。培养OD600至0.4-0.6，用紫外分光光度计进行OD600的测量。用紫外分光光度计测量菌液OD600，待OD值达到0.4-0.6范围内，同时加入0.3M的IPTG诱导剂和不同浓度梯度的Y13287除草剂；Y13287属于三酮类HPPD抑制剂类除草剂，其化学结构式为
Figure BDA0004212541320000241
如专利CN104557739A和CN114774377A所记载；专利CN114774377A记载了Y13287的化学结构式，并记载了其为三酮类的HPPD抑制性除草剂；密封好放入摇床内，22℃，220rpm，过夜诱导培养。诱导好的菌液装入50mL离心管中，12000rpm，离心10min，取上清250μL置于酶标仪板内，测定OD405，进一步统计抗性结果。
1.3实验结果
图1示出了96孔和方形板固体培养筛选对HPPD抑制性除草剂有抗性的菌株的方法，圈出的部分为可能具有HPPD抑制性除草剂抗性的菌株。图1A为96孔固体培养筛选对HPPD抑制性除草剂有抗性的菌株的方法，每96孔板的左下第一个孔为阳性对照组，第二个孔为阴性对照组。图1B为方形板固体培养筛选对HPPD抑制性除草剂有抗性的菌株的方法，每个方形板的右上第一个为阴性对照组，第二个为阳性对照组。
利用96孔和方形板固体培养的筛选方法，在123060个克隆通过多次筛选验证得到HPPD-27、HPPD-45、HPPD-75、HPPD-207、HPPD-228、HPPD-333和HPPD-148突变体。OsHPPD蛋白酶类抑制剂对OsHPPD-mut突变蛋白的抑制效果减弱，表现为在其抑制剂存在条件下仍然可以代谢酪氨酸底物出现颜色变化，突变体显色效果最为明显，颜色较深。
1.3.1通过液体筛选体系验证HPPD抑制剂除草剂抗性突变体
HPPD作为除草剂的主要靶标，在植物体内酪氨酸通过酪氨酸氨基转移酶生成(HPP)，HPP在HPPD的作用下生成尿黑酸(HGA)，突变失活后的HPPD将无法生成尿黑酸(HGA)。大肠杆菌中的酪氨酸氨基转移酶可以催化酪氨酸生成对羟苯基丙酮酸(4-HPP)，后者被HPPD催化生成尿黑酸(HGA)，再经自氧化作用生成黑褐色色素。HPPD抑制剂可以抑制HPPD的催化反应，从而抑制黑褐色色素的产生。因此，可以根据黑褐色色素颜色的深浅来初步判断HPPD活性的强弱或受抑制程度。如果将HPPD突变后在大肠杆菌里表达后，还能氧化对羟苯基丙酮酸生成尿黑酸，说明是抗除草剂或是具有抗性的。本实验中使用含有除草剂的LB+Tyr(0.1％)液体培养基，在100mL锥形瓶中过夜培养大肠杆菌，使HPPD表达，再根据颜色变化验证突变体除草剂抗性。
通过液体筛选结果显示，菌株HPPD-27、HPPD-45、HPPD-75、HPPD-207、HPPD-228和HPPD-333的菌液颜色明显深于野生型。
根据图2可知，与野生型OsHPPD的大肠杆菌(WT)相比，菌株HPPD-207在除草剂Y13287浓度为2、2.5和3mg/L时，菌液颜色分别加深58％，45％和22％。对于菌株HPPD-207(G207S)，其在三个Y13287抑制剂浓度条件下，其抗Y13287的功能相比于野生型都有显著提升。野生型菌株在Y13287浓度为2mg/L、2.5mg/L和3mg/L的条件下其活性分别下降了63％、70％和81％。菌株G207S在三个浓度条件下其功能分别下降了21％、28％和44％，另外，菌株G207S在2mg/L的抑制剂浓度条件下拥有与野生型在不添加抑制剂的条件下相同的酶活性。
根据图3可知，与野生型OsHPPD的大肠杆菌(WT)相比，菌株HPPD-148在除草剂Y13287浓度为1.5、2、2.5mg/L时，菌液颜色不比WT深。
根据图4可知，与野生型OsHPPD的大肠杆菌(WT)相比，菌株HPPD-75、HPPD-228和HPPD-333在除草剂Y13287浓度为2.5和3mg/L时，颜色分别加深27.2％/19.5％、19.4％/29.6％和5％/17.4％。
根据图5可知，菌株HPPD-75、HPPD-228和HPPD-333与野生型对照相比，OD值升高，颜色均加深，表明其对HPPD抑制剂类除草剂的抗性效果明显优于野生型。
将显色液体放入96孔板中，在OD405光照射线下检测吸光度，吸光度值越高，表明表达的OsHPPD酶对溶液中酪氨酸反应越多，说明除草剂对OsHPPD酶的抑制作用越不显著。根据吸光度值，菌株HPPD-27、HPPD-45、HPPD-75、HPPD-207、HPPD-228和HPPD-333在没有抑制剂Y13287的条件下，其吸光度值与野生型的克隆值相比没有降低，表明HPPD蛋白的突变不会对OsHPPD的基因功能造成影响。
在实验中，根据颜色的深度对突变体进行除草剂抗性的评估，星号“*”越多，相较于野生型的颜色越深，抗性/耐受性就越高，如下表所示。
水稻HPPD突变体及其对HPPD抑制剂除草剂相对抗性
Figure BDA0004212541320000251
Figure BDA0004212541320000261
进一步的对菌株HPPD-27、HPPD-45、HPPD-75、HPPD-207、HPPD-228和HPPD-333的基因型进行分析：发现HPPD-27菌株中OsHPPD上有1个核苷酸的突变，第27位的R变为H，导致OsHPPD蛋白序列上一个氨基酸类型发生改变，突变类型为R27H。HPPD-45菌株中OsHPPD上有1个核苷酸的突变，造成OsHPPD蛋白序列上第45位氨基酸由Q变为R；HPPD-75菌株中OsHPPD上有1个核苷酸的突变，造成OsHPPD蛋白序列上第75位氨基酸由A变为V；HPPD-148菌株中OsHPPD上有1个核苷酸的突变，造成OsHPPD蛋白序列上第148位氨基酸由A变为T；HPPD-207菌株中OsHPPD上有1个核苷酸的突变，造成OsHPPD蛋白序列上第207位氨基酸由G变为S；HPPD-228菌株中OsHPPD上有1个核苷酸的突变，造成OsHPPD蛋白序列上第228位氨基酸由V变为M；HPPD-333菌株中OsHPPD上有1个核苷酸的突变，造成OsHPPD蛋白序列上第333位氨基酸由A变为E。
考虑到多点突变可能提高突变型HPPD蛋白对HPPD抑制剂类除草剂的抗性。在之前的结果基础上，采用定点突变的方式将上述筛选结果中显色明显的位点进行叠加，分别设计引物(见表2)，以pET28a-OsHPPD质粒为模板，进行PCR扩增，构建含有相应的突变型HPPD基因的pET28a载体，转入BL21(DE3)感受态细胞，使用Y13287进行除草剂抗性验证。
表2定点突变引物序列
Figure BDA0004212541320000262
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如图6和图8所示，菌株HPPD-54/207/401和菌株HPPD-54/133/207/401在除草剂Y13287浓度为2.5、3、3.5mg/L时的颜色均比野生型菌株的颜色深，OD值高，表明其HPPD除草剂的抗性高于野生型，特别是菌株HPPD-54/207/401的突变型HPPD对应的菌液颜色最深且OD值最大，在浓度为2和2.5mg/L是抗性分别提高52％和41％，表明其对HPPD类除草剂的抗性最强。
如图7所示，菌株HPPD-27/45/75/148/228/333在除草剂Y13287浓度为2、2.5、3mg/L时的颜色均比野生型菌株的颜色深，表明其HPPD除草剂的抗性高于野生型。
在实验中，根据颜色的深度对突变体进行除草剂抗性的评估，星号“*”越多，相较于野生型的颜色越深，抗性/耐受性就越高，如表3所示。
表3多位点叠加突变体及其对HPPD抑制剂除草剂相对抗性
菌株编号 相较于野生型(SEQ ID No.1)的突变位点 Y13287(2mg/L)
HPPD-WT 野生型，氨基酸序列如SEQ ID No.1所示 *
HPPD-54/207/401 L54F/G207S/K401E *****
HPPD-54/133/207/401 L54F/A133T/G207S/K401E ****
HPPD-27/45/75/148/228/333 R27H/Q45R/A75V/A148T/V228M/A333E ***
实施例2、OsHPPD蛋白序列第207位的不同突变类型的菌株的除草剂抗性
采用氨基酸饱和突变技术将OsHPPD蛋白序列第207位点突变为其余19种氨基酸，分别设计构建引物，以pET28a-OsHPPD质粒为模板，进行PCR扩增，构建含有相应的突变型HPPD基因的pET28a载体，转入BL21(DE3)感受态细胞，使用Y13287进行除草剂抗性验证，大肠杆菌菌液显色和OD值统计结果如图9、10所示，菌株G207L、G207V、G207I在不含除草剂的环境下，菌液颜色比野生型菌株的颜色浅，可见菌株G207L、G207V、G207I的酶活性显著降低；菌株G207A、G207Y、G207R、G207M、G207F、G207C、G207H、G207D、G207K、G207E在不含除草剂和含有Y13287除草剂的环境下，菌液颜色野生型菌株相当，可见菌株G207A、G207Y、G207R、G207M、G207F、G207C、G207H、G207D、G207K、G207E的除草剂抗性与野生型相当；菌株G207S、G207T、G207W、G207Q、G207P和G207N在Y13287除草剂浓度为1.5、2、2.5mg/L时的菌液颜色均比野生型菌株的颜色深，可见菌株G207S、G207T、G207W、G207Q、G207P和G207N具有显著的除草剂抗性。
实施例3、在水稻中验证HPPD(G207S)突变植株对除草剂的抗性
1.胞嘧啶碱基编辑载体的构建
(1)引物设计
根据水稻突变位点、载体酶切位点和胞嘧啶单碱基编辑器编辑窗口设计靶点序列，设计的引物序列由北京擎科生物技术有限公司合成，
OsHPPD-G207S-F：TGTGTGGACGCCCTCGAAACCCGGG；
OsHPPD-G207S-R：AAACCCCGGGTTTCGAGGGCGTCCA。
(2)引物退火
各加入上下游引物5μL，用15μL的ddH2O稀释，通过退火程序形成引物二聚体。退火体系和退火程序下表所示。
退火体系
Figure BDA0004212541320000271
退火程序
Figure BDA0004212541320000272
Figure BDA0004212541320000281
(3)载体准备
为了获得OsHPPD(G207S)突变体植株，选择含有evoFENRY脱氨酶和Cas9变体SpRY-Cas9构建载体CBEmax-evoFENRY。已有研究表明，CBE单碱基编辑器对编辑类型具有局限性，偏好TC、CC，几乎不编辑GC。而evoFENRY脱氨酶特性是能够编辑所有的碱基类型，编辑范围大、效率高且生成的副产物少，将PAM范围拓展到NR和NY(R＝A/G，Y＝T/C)。
(4)载体构建
经Bsa-I(New EngLand，NBE)酶切后回收的质粒CBEmax-evoFENRY，采用GoldenGate一步法构建水稻单碱基编辑载体CBEmax-evoFENRY-OsHPPDL54F。构建体系和构建程序如下表所示。经转化到感受态的E.coli DH5α，得到阳性克隆，进行测序验证。
Golden Gate连接体系
Figure BDA0004212541320000282
Golden Gate反应程序
Figure BDA0004212541320000283
(5)农杆菌培养
验证成功的菌株提取质粒转化农杆菌，挑取转化成功的农杆菌单克隆至置于YEP(Kan+rif)液体培养基中28℃，220rpm培养箱中进行培养。
2.愈伤组织转化
(1)水稻愈伤组织准备
选取种皮干净，无霉斑，籽粒饱满的水稻种子，机器去壳后(不能伤胚)，将脱壳后的水稻种子用75％无水乙醇侵染1min，30％NaClO消毒20min，期间不断摇晃，确保消毒充分，消毒结束后，用无菌水冲洗5-6次，冲洗干净并用无菌滤纸吸干。将消毒好的种子移到诱导培养基中，每板培养基放25-30粒水稻种子，25～27℃培养两周左右。
(2)农杆菌侵染与共培养
将携带目的基因靶位点的农杆菌菌株活化培养在含有Kan和Rif抗生素的Yep固体培养基上，28℃培养箱倒置培养48h，用涂布器将所有的菌落刮板到AAM+AS(20mg/L)培养基中，28℃培养1-2h，调整农杆菌悬浮液的OD600在0.4-0.6范围之内。将悬浮好的农杆菌侵染液倒入50ml灭菌的离心管中，倒入预培养的愈伤组织，浸泡2min，期间不断摇晃。空皿上预先垫上两层无菌滤纸，把侵染好的愈伤组织放在上面，吹30min左右。在空皿上预先垫上3层无菌滤纸，滤纸提前均匀加入2mlAAM+AS(20mg/L)培养液，将晾干的愈伤组织接种到含有3层无菌滤纸的皿中，25℃暗培养48-72h。
(3)抗性愈伤的筛选、分化和生根
将共培养后的愈伤组织转移到含有抗生素的筛选培养基上，25～27℃培养30天左右。将筛选后存活的愈伤组织接种到分化培养基上，25～27℃培养一周左右，将开始变绿并开始长出小苗的愈伤组织重新转移到新的分化培养基中，25～27℃培养两周左右。生根培养待水稻幼苗长到5cm左右，拔掉所有的原根，将幼苗移栽到生根培养基上中，光照下培养，待小苗长到与盖子高度一致时，加入无菌水炼苗4-6天。观察幼苗在生根培养基中的生长状态，之后将编辑苗移栽到大田中进行种植培养。
3.编辑苗检测
待组培苗生长到4-5叶期，使用CTAB方法提取DNA，并设计引物
OsHPPD-g-F1：CTCCGTCGCGTTCCTCTTCA；
OsHPPD-g-R1：CGGTGAACCCGGAGATGTAC进行PCR扩增，之后测序检测。
4.编辑苗的除草剂抗性
使用气压式喷雾器对获得的编辑苗(HPPD蛋白的G207S突变植株)进行除草剂叶面喷洒处理，使其均匀分布在叶片的表面，并以野生型水稻植株作为对照，于28℃培养室中继续培养，观察植株生长情况，选取2个具有代表性的独立株系进行拍照。如图11所示，喷洒8天后，野生型水稻植株叶片出现了明显的漂白现象并伴随枯萎，生长停滞，但是编辑水稻植株(HPPD蛋白的G207S突变植株)能够长出新叶并且没有出现植株枯萎现象，且新叶仍然保持绿色，生长状态良好。所用除草剂为Y13287，浓度为0.028mg/L。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (18)

1.一种对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的突变多肽，其特征在于，所述突变型的HPPD多肽选自以下I-III任意一组：
I、所述突变多肽与亲本对羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的氨基酸序列相比，在对应于SEQ ID No.1所示氨基酸序列的以下任一或任意几个氨基酸位点处存在突变：第207位、第75位、第228位、第333位、第27位、第45位、第148位；
II、与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的突变型的HPPD多肽，并且保留了除草剂抗性的活性；
III、与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有I中所述的突变位点；并且，与I所述的突变型的HPPD多肽相比，具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加的序列，并且保留了除草剂抗性的活性。
2.根据权利要求1所述的突变多肽，其特征在于，
所述第207位氨基酸突变为非G的氨基酸；
所述第75位氨基酸突变为非A的氨基酸；
所述第228位氨基酸突变为非V的氨基酸；
所述第333位氨基酸突变为非A的氨基酸；
所述第27位氨基酸突变为非R的氨基酸；
所述第45位氨基酸突变为非Q的氨基酸；
所述第148位氨基酸突变为非A的氨基酸。
3.根据权利要求1-2任一所述的突变多肽，其特征在于，所述突变多肽还包括其他的对除草剂产生抗性的氨基酸位点；
优选地，所述其他的对除草剂产生抗性的氨基酸位点包括对应于SEQ IDNo.1所示氨基酸序列的第54位、第401位、或第133位中的一个或多个位点。
4.根据权利要求1-3任一所述的突变多肽，其特征在于，所述亲本HPPD来源于单子叶植物或双子叶植物。
5.根据权利要求4所述的突变多肽，其特征在于，所述亲本HPPD来源于水稻。
6.一种融合蛋白，所述融合蛋白包含权利要求1-5任一所述的突变多肽。
7.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码权利要求1-5任一所述的突变多肽或权利要求6所述的融合蛋白。
8.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有权利要求7所述的多核苷酸；
任选的，还含有与之可操作连接的调控元件；
优选地，所述调控元件选自下组中的一种或任意几种：增强子、转座子、启动子、终止子、前导序列、多核苷酸序列、标记基因。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括权利要求1-5任一所述的突变多肽，或权利要求6所述的融合蛋白，或权利要求7所述的多核苷酸，或权利要求8所述的核酸构建体。
10.一种基因编辑试剂，其特征在于，所述基因编辑试剂能够在植物中产生权利要求1-5任一所述的突变多肽；所述基因编辑试剂包括CRISPR/Cas蛋白和gRNA，所述gRNA可以靶向植物内源性的HPPD；
优选地，所述基因编辑试剂还包括碱基编辑元件，所述碱基编辑元件选自腺嘌呤脱氨酶和/或胞嘧啶脱氨酶。
11.权利要求1-5任一所述的突变多肽，或权利要求6所述的融合蛋白，或权利要求7所述的多核苷酸，或权利要求8所述的核酸构建体、或权利要求9所述的宿主细胞、或权利要求10所述的基因编辑试剂在制备具有HPPD抑制性除草剂抗性/耐受性的植物中的用途。
12.一种植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物，其包含权利要求1-5任一所述的突变多肽，或权利要求6所述的融合蛋白，或权利要求7所述的多核苷酸，或权利要求8所述的核酸构建体、或权利要求9所述的宿主细胞。
13.一种赋予植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性/耐受性的方法或者制备具有HPPD抑制性除草剂抗性/耐受性的植物的方法，所述方法包括利用权利要求10所述的试剂对植物进行基因编辑的步骤。
14.一种赋予植物对HPPD抑制性除草剂产生抗性/耐受性的方法或者制备具有HPPD抑制性除草剂抗性/耐受性的植物的方法，所述方法包括在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中引入权利要求1-5任一所述的突变多肽的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-5任一所述的突变多肽在植物细胞、植物种子、植物组织、植物部分或植物中进行表达的步骤。
16.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述方法包括将植物的内源性HPPD进行突变从而引入所述的突变多肽的步骤。
17.一种在植物栽培地点控制不想要的植物的方法，所述方法包括：
(1)提供包含权利要求1-5任一所述的突变多肽，或权利要求6所述的融合蛋白，或权利要求7所述的多核苷酸，或权利要求8所述的核酸构建体、或权利要求9所述的宿主细胞的植物，或者提供由权利要求13-16任一方法得到的植物；
(2)将步骤(1)的植物进行栽培，并向所述栽培地点施用HPPD抑制性除草剂。
18.根据权利要求13-17任一所述的方法，其特征在于，所述的HPPD抑制性除草剂为三酮类HPPD抑制性除草剂。
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