CN116356029A - Txnrd1基因甲基化水平检测在子宫内膜癌诊断和/或筛查中的应用 - Google Patents

Txnrd1基因甲基化水平检测在子宫内膜癌诊断和/或筛查中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明大体涉及分子生物学检测技术领域，具体而言，涉及TXNRD1基因甲基化水平检测在子宫内膜癌诊断和/或筛查中的应用。本发明提供了以宫颈脱落细胞作为检测样本用于子宫内膜癌诊断和/或筛查的试剂盒以及应用，其以TXNRD1基因为靶点，通过检测其甲基化，可用于子宫内膜癌的诊断和/或筛查。宫颈拭子样本可在门诊完成采样，无需侵入性取样，患者接受度更高，而且具有检测速度快、更高的灵敏度和特异性等优点，将使子宫内膜癌初筛工作更为便捷及普及，对子宫内膜癌的早诊早治具有重要的意义。

Description

TXNRD1基因甲基化水平检测在子宫内膜癌诊断和/或筛查中 的应用
技术领域
本发明大体涉及分子生物学检测技术领域，具体而言，涉及TXNRD1基因甲基化水平检测在子宫内膜癌诊断和/或筛查中的应用。
背景技术
子宫内膜癌是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，又称子宫体癌，是女性生殖道三大常见恶性肿瘤之一。子宫内膜癌在发达国家是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，且近年来发病率呈现上升趋势且趋于年轻化。目前子宫内膜癌的筛查手段包括经阴道超声检查、子宫内膜微量组织病理检查和子宫内膜细胞学检查等，阴道超声对于绝经前女性灵敏度有限，不推荐作为子宫内膜癌单独筛查的方法；子宫内膜微量组织病理检查和子宫内膜细胞学检查，虽然可以无需麻醉、无需扩张子宫颈，但是均需侵入至子宫腔内，取得子宫内膜组织或细胞，取材满意度低且易引起患者不适，并且两种方法对于病理组织的诊断、细胞涂片的阅片，缺乏病理学家或细胞学家一致认可的严格的诊断标准，存在较强的主观性；另外，由于子宫内膜的变化与激素水平相关，细胞学检查的取材时间也会影响结果的判别。一种可以无创或微创采样、客观评判结果且具有较高灵敏度和特异性的新的子宫内膜癌筛查手段亟待开发。
DNA甲基化是DNA序列上特定的碱基在DNA甲基转移酶(DNMT)的催化作用下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，通过共价结合的方式获得一个甲基基团的化学修饰过程。DNA甲基化主要发生在5’-CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。在正常组织里，70％～90％分散的CpG是被甲基修饰的，对维持基因族的稳定性具有重要作用，而位于基因转录调控区域例如启动子区CpG岛中的CpG可通过甲基化状态，调控基因的转录。研究表明，启动子区的DNA被甲基化后通常能抑制基因的表达，导致基因沉默。而启动子区的超甲基化导致肿瘤抑癌基因的沉默与肿瘤的发生密切相关，且该现象在肿瘤发生的早期既已显现，因此DNA甲基化被认为是进行肿瘤早期筛查的非常有潜力的生物标记物。
鉴于此，特提出本项发明用于子宫内膜癌的诊断和/或筛查。
发明内容
本发明涉及一种引物探针组合产品，包括a)-f)组合中的至少一组：
a)核苷酸序列为SEQ ID NO：1～2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针；
b)核苷酸序列为SEQ ID NO：4～5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针；
c)核苷酸序列为SEQ ID NO：7～8所示的引物以及SEQ ID NO：9所示的探针；
d)核苷酸序列为SEQ ID NO：10～11所示的引物以及SEQ ID NO：12所示的探针；
e)核苷酸序列为SEQ ID NO：13～14所示的引物以及SEQ ID NO：15所示的探针；
f)核苷酸序列为SEQ ID NO：16～17所示的引物以及SEQ ID NO：18所示的探针。
根据本发明的再一方面，涉及含有如上所述的引物探针组合产品的试剂盒。
根据本发明的再一方面，涉及TXNRD1基因甲基化水平的检测剂在制备子宫内膜癌诊断和/或筛查试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了以宫颈脱落细胞作为检测样本用于子宫内膜癌诊断和/或筛查的试剂盒以及应用，其以TXNRD1基因为靶点，通过检测其甲基化，可用于子宫内膜癌的诊断和/或筛查。宫颈拭子样本可在门诊完成采样，无需侵入性取样，患者接受度更高，而且具有检测速度快、更高的灵敏度和特异性等优点，将使子宫内膜癌初筛工作更为便捷及普及，对子宫内膜癌的早诊早治具有重要的意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例所提供的子宫内膜癌相关的甲基化标志物的初筛结果图；
图2为本发明一个实施例所提供的根据中国人群宫颈拭子高通量测序数据进一步筛选子宫内膜癌甲基化生物标志物的结果图；
图3为TXNRD1基因在样本内的诊断表现结果；
图4为针对宫颈脱落细胞内TXNRD1基因的甲基化水平检测流程示意图；
图5为针对TXNRD1的6个靶区域的特异性引物和探针组合进行检测后的ROC结果图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2％，可以允许±0.1％范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1％、±2％、±5％等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10％的波动。
本发明中’涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本文所用的术语“诊断”是指这样的行为或过程：通过评价疾病或失调的体征和症状，或遗传分析、病理分析、组织学分析等鉴定或确定哺乳动物的疾病或病症、或者引起疾病或病症的因素；是直接目的是判断疾病的有无。通常，基于对象征疾病的一种或多种因素和/或症状进行评价来诊断疾病或病症。即，可以根据象征疾病或病症存在与否的因素的存在与否或其量来作出诊断。各个被认为象征特定疾病而用于诊断的因素或症状不需要独特地与所述特定疾病相关；即，可能存在可从诊断性因素或症状推断出的不同诊断。同样地，可能存在这样的情况：在不具有特定疾病的个体中，存在象征该特定疾病的因素或症状。
诊断的对象可以为疑似患有子宫内膜癌的受试者。“疑似患有子宫内膜癌的受试者”涵盖已接受初步诊断(例如，显示出团块的CT扫描，或CA199、CA125等标志物水平升高)但尚不清楚其癌症阶段的个体。该术语还包括曾经患有子宫内膜癌的人(例如，缓解中的个体)。如本文所用，术语“癌症的阶段”是指对癌症发展水平的定性或定量评估。用于确定癌症阶段的标准包括但不限于肿瘤的大小和转移的程度(例如，局限性或远处)。在一些实施方案中，“受试者”为疑似患有子宫内膜癌或诊断患有子宫内膜癌的对照受试者。在一些实施方案中，诊断是早期诊断。
本文所用的术语“筛查”的基本目标是发现大量其他方面健康的人的早期疾病或疾病风险，其目的是为了判断出现某种健康问题的风险高低。在一些实施方案中，筛查是早期筛查。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本发明的第一方面涉及引物探针组合产品，包括包括a)-f)组合中的至少一组：
a)核苷酸序列为SEQ ID NO：1～2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针；
b)核苷酸序列为SEQ ID NO：4～5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针；
c)核苷酸序列为SEQ ID NO：7～8所示的引物以及SEQ ID NO：9所示的探针；
d)核苷酸序列为SEQ ID NO：10～11所示的引物以及SEQ ID NO：12所示的探针；
e)核苷酸序列为SEQ ID NO：13～14所示的引物以及SEQ ID NO：15所示的探针；
f)核苷酸序列为SEQ ID NO：16～17所示的引物以及SEQ ID NO：18所示的探针。
本发明所提供的引物探针组合产品用于检测TXNRD1基因chr12：104215491-104216453区段的甲基化情况，样本核酸经亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶(C)脱氨成尿嘧啶(U)，甲基化的胞嘧啶(5mC)不变；再由荧光PCR扩增，尿嘧啶(U)转换为胸腺嘧啶(T)，而5mC重新恢复成C，可以通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。
本发明所提供的组合产品灵敏度高，特异性好。
在一些实施方式中，所述的组合产品其含有检测内参核酸的引物和探针。
在一些实施方式中，所述内参核酸为COL2A1基因或其片段。
除COL2A1基因外，也可以采用现有技术的其他的甲基化检测的内参基因，诸如β-actin、GAPDH、B2M、SDHA、HPRT1；内参基因在正常细胞和癌组织细胞中均存在，且不存在序列差异性，因此能够更好的实时监测检测样本，以及反映样本中目标基因的甲基化比例。
在一些实施方式中，所述检测内参核酸的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：19～20所示，所述检测内参核酸的探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：21所示。
另外，需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与SEQ ID NO：1～21所示的引物或探针具有大于80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物和探针修饰并且可根据标准技术制备。
术语“％同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，％同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST(Altschul etal.，1990、J Mol Biol 215：3，403-410；Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res25：17，3389-402)确定百分比同一性。
引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。
碱基修饰例如3’P、5’P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2’-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2’-脱氧腺苷-5’-三磷酸、2，6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响，从而使其能够在较高的温度下进行，在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
在一些实施方式中，所述探针标记有可检测的信号物质。在一些实施方式中，所述信号物质是荧光团、比色标记、胶体金、量子点、生物素以及其他可以用于探测的标签分子(如用于拉曼衍射成像的炔烃基团，用于click反应的环烯烃，用于聚合物标记的引发基团)，也可以选自多肽/蛋白分子，LNA/PNA，非天然氨基酸及其类似物(比如拟肽)，非天然核酸及其类似物(拟核苷酸)和纳米结构(包括无机纳米颗粒，NV-center，聚集/组装诱导发光分子，稀土离子配体分子，多金属氧簇等)。
在一些实施方式中，所述探针均为自身淬灭探针。
在一些实施方式中，各探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPYFL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、AquaPhluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。
在一些实施方式中，各探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。
本发明第二方面还涉及含有如上所述的引物探针组合产品的试剂盒。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)，试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
在一些实施方式中，所述试剂盒其还包含扩增缓冲液、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、水以及亚硫酸盐定序试剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述DNA聚合酶具有5’外切酶活性，例如选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶以及Klenow片段中的任一种。
在一些实施方式中，所述水通常为无核酸和/或无核酸酶的水。水可以为蒸馏水、去离子水或反渗水。
在一些实施方式中，所述阳性样本中含有甲基化靶标；其可以为包含a)-f)所检测区段序列的质粒。
在一些实施方式中，所述阴性样本为无目标基因甲基化的人基因组DNA，或者纯水。
在一些实施方式中，所述亚硫酸盐定序试剂包含亚硫酸盐。
本发明所提供的引物/引物组需要配合亚硫酸盐定序法进行使用。
亚硫酸盐定序法目前应用最普遍的甲基化检测方法，其原理是亚硫酸氢盐的处理将非甲基化的C转化U，经过PCR过程后转变为T，而甲基化的C经过亚硫酸氢盐处理后不会发生变化。
在一些实施方式中，所述亚硫酸盐定序试剂还包含与待检测的核酸片段不相关的外源DNA；进一步的，所述外源DNA为没有甲基化修饰的λDNA。
待检测的核酸片段优选与外源DNA(特别是没有甲基化修饰的λDNA)一起用重亚硫酸盐处理，使非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶。外源DNA的作用是在重亚硫酸盐处理时与样品一起高效共处理，对微量的DNA片段起到保护作用，最大限度的降低重亚硫酸盐对微量DNA的破坏。
各组分优选以冻干形式，例如以一种或多种所谓的冻干珠的形式实现。冻干珠通常可以被理解为是指在制造后(在所述制造后物质通常作为粉末存在)被压制成球形的冻干物。因此，可以例如以冻干形式提供PCR批次所需的组分，特别是DNA聚合酶、核酸组分以及反应缓冲剂组分。以这种方式，可以通过添加待定量的样品以及任选其它所需组分以对于用户非常友好的方式直接开始PCR过程。特别地，冻干形式的提供非常有利于自动化应用。
本发明的第三方面涉及TXNRD1基因甲基化水平的检测剂在制备子宫内膜癌诊断和/或筛查试剂或试剂盒中的应用。
在一些实施方式中，所述检测剂用于检测TXNRD1基因的chr12：104215491-104216453区段的甲基化水平。
在一些实施方式中，所述检测剂用于检测如下区域中至少一段的甲基化水平：
chr12：104215491-104215646、chr12：104215647-104215765、chr12：104215750-104215872、chr12：104215852-104216065、chr12：104216066-104216200以及chr12：104216190-104216453。
在一些实施方式中，所述检测剂用于实现任一项或多项方法：
甲基化特异性PCR(诸如数字PCR，定量的甲基化特异性PCR)、焦磷酸测序法或重亚硫酸盐测序法、甲基化特异性微阵列法、甲基化特异性高效液相层析法、高分辨率熔解(HRM)分析、甲基化敏感性限制性内切酶法或荧光定量、甲基化特异性变性高效液相色谱、HPLC-UV、LC-MS/MS、甲基化敏感性单链构象分析法、甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳法、甲基化敏感性解链曲线分析、Methylight技术、甲基化敏感性斑点分析、甲基化抗体或MBD亲和的富集方法、MeDIP-Seq、RRBS-Seq、WGBS、MBD-Seq和SMRT。
优选地用PCR方式来测定甲基化程度，诸如“基于荧光的实时PCR技术”(Eads等人，Cancer Res.59：2302-2306，1999)、Ms-SNuPE TM(甲基化敏感的单核苷酸引物延伸)反应(Gonzalgo&Jones，Nucleic Acids Res.25：2529-2531，1997)、甲基化特异性PCR(“MSP”；Herman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：9821-9826，1996；美国专利5,786,146)以及甲基化的CpG岛扩增(“MCA”；Toyota等人，Cancer Res.59：2307-12，1999)等测定方法被用于测定TXNRD1基因甲基化水平。
在一些实施方式中，所述检测剂包括第一方面中所述的引物探针组合产品。
在一些实施方式中，所述诊断和/或筛查试剂或试剂盒的检测样本为受试者的宫颈脱落组织、细胞，或它们的裂解物。
本文使用的“裂解物”表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中宫颈脱落组织或宫颈脱落细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语“裂解”包括。
本发明所称的受试者为哺乳动物，优选为灵长类动物，更优选为人。
本发明还涉及一种子宫内膜癌诊断和/或筛查方法，包括：
使用第一方面中所述的引物探针组合产品扩增经亚硫酸盐转化的DNA样本。
在一些实施方式中，所述DNA样本为基因组DNA。
在一些实施方式中，所述DNA样本为来自宫颈脱落组织、细胞，或它们的裂解物。
对于结果而言，内标通道有S型扩增曲线且Ct值≤30为结果有效；
分别记录每个甲基化基因的Ct值，进行性能的评估，Ct值低于38定义为阳性。
本发明中，子宫内膜癌可以包括第一型和/或第二型的子宫内膜癌。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1应用于子宫内膜癌早期筛查的甲基化生物标志物的筛选
首先利用公共数据库数据，初步筛选出子宫内膜癌特异的甲基化生物标志物，然后通过对中国人群的宫颈拭子样本进行高通量捕获测序，对初步筛选的甲基化生物标志物进行验证，进一步确定较优的生物标志物。
1、收集公共数据库子宫内膜癌相关数据
TCGA(The cancer genome atlas，癌症基因组图谱)由National CancerInstitute(NCI，美国国家癌症研究所)和National Human Genome Research Institute(NHGRI，美国国家人类基因组研究所)于2006年联合启动的项目，收录了各种人类癌症(包括亚型在内的肿瘤)的临床数据，基因组变异，mRNA表达，miRNA表达，甲基化等数据，是癌症研究者很重要的数据来源。TCGA上的数据整体质量较高且样本量大，因此，此次研究以TCGA中子宫内膜癌的甲基化数据为主要分析数据来源，最终收集了子宫内膜癌组织样本436例，正常子宫内膜组织样本97例，正常宫颈组织20例，正常宫颈拭子102例。
2.根据公共数据库初步筛选子宫内膜癌甲基化生物标志物
基于上述收集到的公共数据，进行子宫内膜癌甲基化生物标志物的初步筛选，具体来说，共进行两轮筛选，第一轮主要基于子宫内膜正常组织和肿瘤组织的数据进行筛选，筛选根据子宫内膜肿瘤组织和正常组织的平均甲基化水平的差值阈值以及在100bp区间内平均CpG位点个数的阈值确定。依照上述规则共筛选得到232个生物标志物。第二轮筛选主要基于正常宫颈拭子，在满足上述条件下，同时要求正常的宫颈拭子的平均甲基化水平满足特定阈值，这样共筛选得到94个生物标志物，具体结果可参见图1。
3.根据中国人群宫颈拭子高通量测序数据进一步筛选子宫内膜癌甲基化生物标志物
在临床上共收集了87例中国人群的宫颈拭子样本，包括28例子宫内膜癌样本和59例子宫内膜正常的样本，进行高通量捕获测序，得到各样本在上述94个生物标志物中的甲基化水平。整体看来，94个生物标志物均表现出了肿瘤和正常样本间的差异。通过聚类算法，可将上述94个生物标志物聚为4类，其中第一类背景甲基化很低，但是很大一部分肿瘤样本的甲基化过低，不易检测；第二类中背景甲基化水平过高，噪音太大，也不利于检测；第三类和第四类表现较好，尤其是第四类表现最好，背景相对较低且肿瘤样本甲基化信号较高，如图2所示。最终，通过中国人群宫颈拭子样本的高通量测捕获测序的数据结果，我们进一步精选出了10个高性能子宫内膜癌甲基化生物标志物。其中TXNRD1基因在样本内的表现尤为突出，如图3所示。
实施例2 TXNRD1基因的检测
本发明的研究发现，以TXNRD1基因作为靶点，通过检测宫颈脱落细胞内该基因的甲基化状态可以进行子宫内膜癌的早期筛查诊断，此种方法可以避免侵入性取样；
选取已知明确病理结果的子宫内膜癌样本63例，子宫内膜良性样本117例，均为宫颈脱落细胞样本。针对TXNRD1的6个靶区域的特异性引物和探针组合进行检测，对这6个区域的检测灵敏度、特异性以及ROC进行了分析。
具体的检测体系和检测方法如下所示。
本实施例针对TXNRD1基因靶点区域为chr12：104215491-104216453(GRCh38/hg38版本)，引物和探针序列分别为：
Figure BDA0004153105510000141
备注：探针5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。
本发明所述内参基因COL2A1靶点区域为chr12：47987446-47987534
正向引物：GGGAAGATGGGATAGAAGGGAATAT(SEQ ID NO：19)
反向引物：AACAATTATAAACTCCAACCAC(SEQ ID NO：20)
探针：TTCATTCTAACCCAATACCT(SEQ ID NO：21，探针5’端标记荧光集团，3’端标记淬灭基团)
实验步骤示意图如图4所示，包括：宫颈脱落细胞DNA提取、甲基化转化处理、qPCR等。
一、宫颈脱落细胞DNA提取
采用
Figure BDA0004153105510000151
DNA Mini Kit核酸提取试剂作为细胞基因组DNA提取试剂。
将保存管以转速3,000g离心1分钟。
1.1.使用移液枪吸除300μL样本保存液(使保存管中剩余约300μL保存液)至1.5mL微量离心管中留存。
1.2.向含有采样刷的样本保存管中加入20μL Proteinase K，置于震荡混合器充分混合样本与试剂溶液。
1.3.向含有采样刷的样本保存管中加入270μL Buffer AL，置于震荡混合器充分混合样本与试剂溶液。
1.4.将含有采样刷的样本保存管置于水浴或金属浴56℃加热1-2小时，使之样本裂解，加热期间可不定时置于震荡混合器轻微混合再放回继续加热。
1.5.加热完毕后取出，置于震荡混合器轻微混合后放置于室温冷却。
1.6.加入400μL 100％酒精震荡混合15秒。
1.7.将样本全部加入QIAamp Mini Spin Column (含2mL collection tube)，以转速10000rpm离心1分钟，丢掉废液及收集管(collection tube)(每次最多可加入690μL，若样本量过多可分多次加入)。
1.8.将spin column插入新的collection tube，加入500μL Buffer AW1，反应2分钟，以转速10000rpm离心1分钟，离心后丢掉废液及收集管。
1.9.将spin column插入新的收集管，加入500μL Buffer AW2，反应2分钟，以转速10000rpm离心1分钟，离心后丢掉废液及收集管。
1.10.将spin column重新插回收集管，以转速12000rpm离心3分钟以利去除残留的酒精，空离后丢掉废液及收集管。
1.11.将spincolumn插入新的1.5mL微量离心管(标明样本编号、日期及DNA)，晾干5min后，加入60μL Buffer AE(可依据样本浓度适量增加Buffer AE的量，记录Buffer AE用量)置于室温下反应10分钟。
1.12.以转速10000rpm离心1分钟，冲提出样本DNA。
二、DNA重亚硫酸盐转化
采用EZDNAMethylation-GoldTM Kit作为DNA重亚硫酸盐转化试剂，对提取好的DNA进行重亚硫酸盐转化，DNA中未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶(C)不变，得到转化后的bis-DNA。
2.重亚硫酸盐转化：
2.1.计算DNA总量为320ng时，计算所需的DNA体积，并吸取计算出的DNA样本体积至新的PCR管。
2.2.加入适当NFW(不含核酸酶的水)稀释，使稀释后样本总体积为20μL并标明样本编号。
2.3.将已稀释成总体积为20μL的DNA样本，分别加入130μL CTConversionReagent，置于震荡混合器轻微混合后短暂离心。
2.4.将样本管置于PCR仪中，PCR程序设定如下表所示：
程序名称 设定温度(℃) 时间
变性 98 10分钟
保温 64 2.5小时
降温 4 ∞
2.5.反应完后，根据实验所需要的反应量，准备相等数量的Zymo-SpinTM ICColumn与1.5mL微量离心管，并在Zymo-SpinTM IC Column盖子上收集管(Collection tube)以及1.5mL微量离心管预先表明样本编号。
2.6.在Zymo-SpinT MIC Column中加入600μL M-Binding Buffer。
2.7.将样本管内的样本，全部加入Zymo-SpinTM IC Column，并上下颠倒混匀。注意确认样本编号是否相同。
2.8.将Zymo-SpinTM IC Column置于微量高速离心机中，以转速10,000rpm离心1分钟。
2.9.下层收集管废液倒掉后，再小心装回Spin Column，并加入100μLM-WashBuffer至Spin Column。
2.10.反应2分钟后以转速10,000rpm离心1分钟，将Zymo-SpinTM IC Column从离心机内取出置于微量离心管架上。
2.11.打开盖子加入200μL M-Desulphonation Buffer室温反应15分钟后，再以转速10,000rpm离心1分钟。
2.12.Zymo-SpinTM IC Column从离心机内取出，打开盖子加入200μL M-WashBuffer后，反应2分钟，以转速10,000rpm离心1分钟。
2.13.重复上一步骤，Zymo-SpinTM IC Column从离心机取出，打开盖子加入200μLM-Wash Buffer后，反应2分钟，以转速10,000rpm离心1分钟。
2.14.将下层收集管废液倒掉后，再小心装回Spin Column，以转速12,000rpm离心3分钟。以利去除残留的酒精。
2.15.将上层Spin Column插入事先准备的1.5mL微量离心管中，注意确认样本编号是否与其对应的Spin Column相同，打开上层Spin Column盖子，置于室温5分钟，待酒精挥发完全。
2.16.小心加入40μL M-Elution buffer至Spin Column的膜上，盖上Spin Column盖子，于室温静置反应10分钟。反应完后，以转速10,000rpm离心1分钟以冲提出BS-DNA(重亚硫酸盐转化后的DNA)。
2.17.收集下层微量离心管冲提的DNA，并再次确认微量离心管样本编号是否与Spin Column上的编号一致，确认后再标明样本状态BS-DNA。
2.18.收集的BS-DNA可以直接进行后续甲基化特异性qPCR检测，也可以暂时保存于-20℃或-80℃。
3.甲基化特异性qPCR
3.1 PCR反应液和引物探针混合液
组分 每份用量(μL)
正向引物(10μM) 1
反向引物(10μM) 1
探针(10μM) 0.5
qPCR master mix 10
Nuclease-free water 3.5
甲基化转化后DNA 4
每份配制总体积 20
3.2 PCR反应条件
95℃预变性5min；95℃变性15s，60℃退火延伸35s，50个循环；25℃保持10min。
信号收集，60℃收集荧光信号。
3.3结果判读
3.3.1内标通道有S型扩增曲线且Ct值≤30为结果有效；
3.3.2分别记录每个甲基化基因的Ct值，进行性能的评估，Ct值低于38定义为阳性。
检测结果如图5及下表所示。
TxNRD1甲基化区域 真阴性/假阳性 真阳性/假阴性 特异性 敏感性 AUC(ROC曲线下面积)
chr12：104215491-104215646 108/9 56/7 92.3％ 88.9％ 0.956
chr12∶104215647-104215765 107/10 57/6 91.4％ 90.47％ 0.951
chr12：104215750-104215872 112/5 59/4 96.6％ 93.7％ 0.962
chr12：104215852-104216065 19/8 57/6 93.2％ 90.47％ 0.95
chr12∶104216066-104216200 108/9 58/5 92.3％ 92.1％ 0.951
chr12：104216190-104216453 109/8 56/7 93.2％ 88.9％ 0.952
结果表明，基于宫颈脱落细胞样本以TXNRD1的6个甲基化区域检测子宫内膜癌的敏感性和特异性分别均大于88％和91％，ROC曲线下面积均大于0.95。其中chr12：104215750-104215872区域检测效果最好，敏感性和特异性分别为93.7％和96.6％，ROC曲线下面积为0.961。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (15)

1.引物探针组合产品，其特征在于，包括a)-f)组合中的至少一组：
a)核苷酸序列为SEQ ID NO：1～2所示的引物以及SEQ ID NO：3所示的探针；
b)核苷酸序列为SEQ ID NO：4～5所示的引物以及SEQ ID NO：6所示的探针；
c)核苷酸序列为SEQ ID NO：7～8所示的引物以及SEQ ID NO：9所示的探针；
d)核苷酸序列为SEQ ID NO：10～11所示的引物以及SEQ ID NO：12所示的探针；
e)核苷酸序列为SEQ ID NO：13～14所示的引物以及SEQ ID NO：15所示的探针；
f)核苷酸序列为SEQ ID NO：16～17所示的引物以及SEQ ID NO：18所示的探针。
2.根据权利要求1所述的组合产品，其特征在于，还含有检测内参核酸的引物和探针。
3.根据权利要求2所述的组合产品，其特征在于，所述内参核酸为COL2A1基因或其片段。
4.根据权利要求3所述的组合产品，其特征在于，检测所述内参核酸的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO：19～20所示，探针的核苷酸序列为SEQ ID NO：21所示。
5.根据权利要求1～4任一项所述的组合产品，其特征在于，探针均为自身淬灭探针。
6.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，各探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto 425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、YakimaYellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。
7.根据权利要求5所述的组合产品，其特征在于，各探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。
8.试剂盒，其特征在于，含有权利要求1～7任一项所述的引物探针组合产品。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包含扩增缓冲液、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、水以及亚硫酸盐定序试剂中的至少一种。
10.TXNRD1基因甲基化水平的检测剂在制备子宫内膜癌诊断和/或筛查试剂或试剂盒中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述检测剂用于检测TXNRD1基因的chr12:104215491-104216453区段的甲基化水平。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述检测剂用于检测如下区域中至少一段的甲基化水平：
chr12:104215491-104215646、chr12:104215647-104215765、chr12:104215750-104215872、chr12:104215852-104216065、chr12:104216066-104216200以及chr12:104216190-104216453。
13.根据权利要求10～12任一项所述的应用，其特征在于，所述检测剂用于实现以下任一项或多项方法：
甲基化特异性PCR、焦磷酸测序法或重亚硫酸盐测序法、甲基化特异性微阵列法、甲基化特异性高效液相层析法、高分辨率熔解(HRM)分析、甲基化敏感性限制性内切酶法或荧光定量法、甲基化特异性变性高效液相色谱、HPLC-UV、LC-MS/MS、甲基化敏感性单链构象分析法、甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳法、甲基化敏感性解链曲线分析、Methylight技术、甲基化敏感性斑点分析、甲基化抗体或MBD亲和的富集方法、MeDIP-Seq、RRBS-Seq、WGBS、MBD-Seq和SMRT。
14.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述检测剂包括权利要求1～7任一项所述的引物探针组合产品。
15.根据权利要求10～12任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断和/或筛查试剂或试剂盒的检测样本为受试者的宫颈脱落组织、细胞，或它们的裂解物。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190256921A1 (en) * 2016-05-04 2019-08-22 Queen's University At Kingston Cell-free detection of methylated tumour dna
CN113337614A (zh) * 2021-08-05 2021-09-03 北京起源聚禾生物科技有限公司 子宫内膜癌早期筛查诊断用标志物、引物探针及试剂盒
CN113913522A (zh) * 2021-11-18 2022-01-11 武汉艾米森生命科技有限公司 子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒
CN115820850A (zh) * 2022-09-07 2023-03-21 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种子宫内膜癌的生物标志物、探针引物组合和试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190256921A1 (en) * 2016-05-04 2019-08-22 Queen's University At Kingston Cell-free detection of methylated tumour dna
CN113337614A (zh) * 2021-08-05 2021-09-03 北京起源聚禾生物科技有限公司 子宫内膜癌早期筛查诊断用标志物、引物探针及试剂盒
CN113913522A (zh) * 2021-11-18 2022-01-11 武汉艾米森生命科技有限公司 子宫内膜癌检测的试剂及试剂盒
CN115820850A (zh) * 2022-09-07 2023-03-21 武汉凯德维斯生物技术有限公司 一种子宫内膜癌的生物标志物、探针引物组合和试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YU AN等: "Dietary intakes and biomarker patterns of folate, vitamin B 6 , and vitamin B 12 can be associated with cognitive impairment by hypermethylation of redox-related genes NUDT15 and TXNRD1", CLINICAL EPIGENETICS, vol. 11, pages 139 *

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