CN116350849A - 基体表面生长因子的固定方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种基体表面生长因子的固定方法，属于金属材料表面改性技术领域。本申请固定方法包括：制备表面接枝聚合物分子刷涂层的改性基体A，并将改性基体A与核酸适配体溶液反应以制成表面负载核酸适配体的改性基体B，以及将改性基体B与生长因子接触后，室温孵育，即可完成生长因子在基体表面的结合与固定。该固定方法一方面能够使得核酸适配体与基体表面的结合牢固度明显提高，从而有效避免核酸适配体及其结合生长因子的剥落，另一方面能够使得生长因子的载入效率明显提高并保证生长因子的生物活性。
Description
技术领域
本申请属于医用金属表面改性技术领域，尤其涉及一种基体表面生长因子的固定方法。
背景技术
基体具备优异的机械性能和耐蚀性能，并且与人体的生物相容性良好，可以用于骨科关节的置换与修复，已经成为骨科关节临床修复中使用最广的金属材料。然而，基体是一种生物惰性材料，临床应用中经常出现骨整合不良情况。因此，有必要功能化改性基体表面以赋予其表面生物活性，从而促进植入材料的骨整合能力。
功能化改性基体表面最有效的方法之一是在基体表面载入生长因子以加快骨愈合和改善骨整合能力。目前，基体表面载入生长因子一般通过“液体滴加法”、“冷冻干燥法”、“包裹法”、“涂层法”以及“电荷吸附法”等方法，虽然能够使生长因子载入基体表面，达到功能化改性基体表面的目的。
但是，临床应用中发现上述载入生长因子的方法存在以下缺点：一是生长因子涂层与基体表面的结合牢固度较差，容易发生生长因子涂层的提前剥落；二是结合出现效能较低，使得生长因子的释放速度不稳定；三是结合特异性较差。
发明内容
本申请的目的在于提供一种基体表面生长因子的固定方法，旨在解决通过载入生长因子改性基体表面时，现有的载入方法容易造成生长因子与基体表面的结合牢固度差、结合出现效能低以及结合特异性差的技术问题。
为了实现上述目的，本申请的技术方案是：
本申请提供一种基体表面生长因子的固定方法，其包括以下步骤：
制备表面接枝聚合物分子刷涂层的改性基体A；
将改性基体A与核酸适配体溶液反应，得到表面负载核酸适配体的改性基体B；
将改性基体B与生长因子接触后，室温孵育，完成生长因子在基体表面的结合与固定。
在优选的实现方式中，改性基体A的制备方法包括：
制备表面沉积多巴胺涂层的改性基体C；
无氧环境下，将改性基体C与四氢呋喃、溴代异丁酰溴、三乙胺混合反应，得到表面负载聚合反应引发剂的改性基体D；
无氧环境下，将改性基体D在聚合物分子刷反应体系中反应，得到改性基体A。
在优选的实现方式中，改性基体C与四氢呋喃、溴代异丁酰溴、三乙胺混合反应时，改性基体C、四氢呋喃、溴代异丁酰溴和三乙胺的质量比为1:20:1.8:2。
在优选的实现方式中，聚合物分子刷反应体系由CuBr、THF和GMA组成，其中，GMA的用量为10mmol。
在优选的实现方式中，改性基体D在聚合物分子刷反应体系中的反应时间为12-24h。
在优选的实现方式中，改性基体C的制备方法包括：
提供基体；
对基体表面依次进行清洗、干燥、除氧和活化，得到活化基体；
使活化基体与多巴胺溶液反应，得到改性基体C。
在优选的实现方式中，对基体表面进行清洗时，依次使用丙酮、乙醇和去离子水进行清洗；
和/或，对基体表面进行除氧时，使用硝酸、氢氟酸进行酸洗；
和/或，对基体表面进行活化时，使用食人鱼溶液进行浸泡处理。
在优选的实现方式中，使活化材料与多巴胺溶液反应时，多巴胺溶液的浓度为2mg/mL。
在优选的实现方式中，核酸适配体溶液的配制方法包括：
将核酸适配体加入到pH值为7.4-8.5的PBS溶液中，形成4-10mM的核酸适配体溶液。
在优选的实现方式中，孵育时间不小于30min。
与现有技术相比，本申请的优点或有益效果至少包括：
本申请提供的固定方法，通过在基体表面接枝聚合物分子刷涂层后，利用聚合物分子刷涂层以共价结合的方式负载核酸适配体，然后基于特定序列的核酸适配体对生长因子进行快速的识别与结合，实现生长因子基体表面的结合与固定。其中，表面接枝聚合物分子刷涂层的基体能够以共价结合的方式负载核酸适配体，一方面使得核酸适配体在基体表面的结合牢固度明显提高，有效避免核酸适配体及其结合生长因子的剥落；另一方面能够利用核酸适配体快速的识别与结合生长因子的特性，使得生长因子的载入效率明显提高；第三方面，基体表面共价结合的实际主体为核酸适配体，能够有效解决现有技术下通过共价固定生长因子时可能破坏生长因子的蛋白结构的问题，保证生长因子的生物活性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的Ti、Ti-PDA、Ti-Br和Ti-PGMA的XPS图；
图2为本申请实施例提供的不同时间点下钛基表面生长因子PDGF-BB的结合量；
图3为本申请实施例提供的钛基表面生长因子PDGF-BB在5天内的释放量。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
在本实施例以下描述中，术语“和/或”用于描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，单独存在B和同时存在A和B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
在本实施例以下描述中，术语“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a，b或c中的至少一项(个)”，或，“a，b和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a，b，c，a-b(即a和b)，a-c，b-c，或a-b-c，其中a，b，c分别可以是单个，也可以是多个。
本领域技术人员应当理解，在本申请实施例以下描述中，序号的先后并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例和权利要求书中的术语“生长因子”包括骨生长因子，骨生长因子具体为PDGF-BB、BMPs、TGF-β、bFGF、VEGF、IGF中的任一种，本申请对骨生长因子的具体来源不作特别的限制，可以通过相关领域的常规方法获得。其中，优选为PDGF-BB。
本申请实施例提供一种基体表面生长因子的固定方法，其包括以下步骤：
制备表面接枝聚合物分子刷涂层的改性基体A；
将改性基体A与核酸适配体溶液反应，得到表面负载核酸适配体的改性基体B；
将改性基体B与生长因子接触后，室温孵育，完成生长因子在基体表面的结合与固定。
需要说明的是，基体为医用金属材料，可以为钛及钛合金、不锈钢、钴基合金以及贵金属等，其中，本申请实施例的基体优选为钛及钛合金，用于在其表面固定生长因子PDGF-BB。当然，本领域技术人员应当理解的是，本申请实施例的基体还可以为不锈钢、钴基合金以及贵金属中的任一种，使其表面固定生长因子PDGF-BB、BMPs、TGF-β、bFGF、VEGF、IGF；或者，基体为钛及钛合金，使其表面固定生长因子BMPs、TGF-β、bFGF、VEGF、IGF，本申请实施例对于基体与生长因子的具体种类不作特别的限制，以合成能够促进骨生长的改性医用金属为准。
本领域技术人员应当理解的是，本申请实施例中的核酸适配体具备特异性识别要求载入的生长因子的特定序列，如：生长因子为PDGF-BB时，核酸适配体则需要具备能够结合该PDGF-BB的特定序列，其中，特定序列为本领域已知的核酸序列，本申请实施例不作特别的限定。
本申请实施例通过在基体表面接枝聚合物分子刷涂层后，利用聚合物分子刷涂层以共价结合的方式负载核酸适配体，然后基于特定序列的核酸适配体对生长因子进行快速的识别与结合，实现生长因子基体表面的结合与固定。其中，表面接枝聚合物分子刷涂层的基体能够以共价结合的方式负载核酸适配体，一方面使得核酸适配体在基体表面的结合牢固度明显提高，有效避免核酸适配体及其结合生长因子的剥落；另一方面能够利用核酸适配体快速的识别与结合生长因子的特性，使得生长因子的载入效率明显提高；第三方面，基体表面共价结合的实际主体为核酸适配体，能够有效解决现有技术下通过共价固定生长因子时可能破坏生长因子的蛋白结构的问题，保证生长因子的生物活性。
本申请实施例提供改性基体A的制备方法，该制备方法优选包括：
制备表面沉积多巴胺涂层的改性基体C；
无氧环境下，将改性基体C与四氢呋喃、溴代异丁酰溴、三乙胺混合反应，得到表面负载聚合反应引发剂的改性基体D；
无氧环境下，将改性基体D在聚合物分子刷反应体系中反应，得到改性基体A。
在具体实施例中，改性基体C与四氢呋喃、溴代异丁酰溴、三乙胺混合反应时，改性基体C、四氢呋喃、溴代异丁酰溴和三乙胺的质量比为1:20:1.8:2。
需要说明的是，本申请实施例中的聚合物分子刷反应体系是指通过表面上的活性引发剂直接引发合成聚合物分子刷所需要的活性分子混合体系，其中，本申请实施例中的聚合物分子刷反应体系优选由CuBr、THF和GMA(10mmol)组成，通过该聚合物分子刷反应体系反应能够获得表面接枝PGMA(聚甲基丙烯酸缩水甘油酯)分子刷涂层的改性基体A，若基体为钛及钛合金，则示例性的为Ti-PGMA。
在具体实施例中，改性基体D在聚合物分子刷反应体系中的反应时间优选为12-24h。
本申请实施例提供改性基体C的制备方法，该制备方法优选包括：
提供基体材料；
对基体材料表面依次进行清洗、干燥、除氧和活化，得到活化材料；
使活化材料与多巴胺溶液反应，得到改性基体C。
本申请实施例提供的改性基体C的制备方法，通过对基体材料表面进行清洗、干燥、除氧和活化处理，一方面有效除去基体表面的杂质和氧化层，保证生长因子的活性和医用安全性，另一方面能够提高基体材料表面的活性，提高多巴胺涂层的接枝速度和沉积量。
在具体实施例中，对基体表面进行清洗时，优选依次使用丙酮、乙醇和去离子水进行清洗；
和/或，对基体表面进行除氧时，优选使用硝酸、氢氟酸进行酸洗；
和/或，对基体表面进行活化时，优选使用食人鱼溶液进行浸泡。
在具体实施例中，使活化材料与多巴胺溶液反应时，多巴胺溶液的浓度优选为2mg/mL。
本申请实施例提供核酸适配体溶液的配制方法，该配制方法优选包括：
将核酸适配体加入到pH值为7.4-8.5的PBS溶液中，形成4-10mM的核酸适配体溶液。
在具体实施例中，孵育时间优选为不小于30min，保证生长因子能够完全充分地结合并固定于基体材料表面。
以下结合具体实施例对本申请作进一步详细的说明。
实施例1
本实施例提供一种钛基体表面生长因子PDGF-BB的固定方法，具体包括以下步骤：
S101：将钛基体用丙酮、乙醇、去离子水清洗、干燥，然后用硝酸、氢氟酸进行酸洗去除氧化层，以及用食人鱼溶液常温浸泡钛基体30min，得到活化钛基体，干燥、备用；
S102：将步骤S101备用的钛基体浸入2mg/mL的多巴胺溶液中反应12h后，取出后去离子水清洗，得到表面沉积多巴胺涂层的改性基体C，标记为Ti-PDA；
S103：将步骤S102制成的Ti-PDA与四氢呋喃、溴代异丁酰溴、三乙胺混合，并在氩气保护下常温反应12h，取出并用去离子水清洗，得到表面负载聚合反应引发剂的改性基体D，标记为Ti-Br；
S104：将步骤S103制成的Ti-Br放入由CuBr、THF和GMA组成的聚合物分子刷反应体系中，氩气保护下常温反应12h，得到表面接枝聚合物分子刷涂层的改性基体A，标记为Ti-PGMA；
S105：将核酸适配体加入到pH值为7.4的PBS溶液中，得到4mM的核酸适配体溶液后，将步骤S104制成的Ti-PGMA浸入其中，常温下反应18h，反应后通过RO水清洗，得到表面负载核酸适配体的改性基体B，标记为Ti-APT；
S106：将100ng的生长因子PDGF-BB滴加在将步骤S105制成的Ti-APT表面，常温孵育30min，即可在基体表面固定生长因子PDGF-BB。
实施例2
本实施例提供一种钛基体表面生长因子PDGF-BB的固定方法，具体包括以下步骤：
S101：将钛基体用丙酮、乙醇、去离子水清洗、干燥，然后用硝酸、氢氟酸进行酸洗去除氧化层，以及用食人鱼溶液在60℃的温度下浸泡钛基体30min，得到活化钛基体，干燥、备用；
S102：将步骤S101备用的钛基体浸入2mg/mL的多巴胺溶液中反应18h后，取出后去离子水清洗，得到表面沉积多巴胺涂层的改性基体C，标记为Ti-PDA；
S103：将步骤S102制成的Ti-PDA与四氢呋喃、溴代异丁酰溴、三乙胺混合，并在氩气保护下常温反应24h，取出后去离子水清洗，得到表面负载聚合反应引发剂的改性基体D，标记为Ti-Br；
S104：将步骤S103制成的Ti-Br放入由CuBr、THF和GMA组成的聚合物分子刷反应体系中，氩气保护下常温反应24h，得到表面接枝聚合物分子刷涂层的改性基体A，标记为Ti-PGMA；
S105：将核酸适配体加入到pH值为8.0的PBS溶液中，得到8mM的核酸适配体溶液后，将步骤S104制成的Ti-PGMA浸入其中，常温下反应18h，反应后通过RO水清洗，得到表面负载核酸适配体的改性基体B，标记为Ti-APT；
S106：将100ng的生长因子PDGF-BB滴加在将步骤S105制成的Ti-APT表面，常温孵育60min，即可在基体表面固定生长因子PDGF-BB。
实施例3
本实施例提供一种钛基体表面生长因子PDGF-BB的固定方法，具体包括以下步骤：
S101：将钛基体用丙酮、乙醇、去离子水清洗、干燥，然后用硝酸、氢氟酸进行酸洗去除氧化层，以及用食人鱼溶液在60℃的温度下浸泡钛基体30min并干燥，得到活化钛基体，标记为Ti；
S102：将步骤S101备用的钛基体浸入2mg/mL的多巴胺溶液中反应24h后，取出并用去离子水清洗，得到表面沉积多巴胺涂层的改性基体C，标记为Ti-PDA；
S103：将步骤S102制成的Ti-PDA与四氢呋喃、溴代异丁酰溴、三乙胺混合，并在氩气保护下常温反应18h，取出并用去离子水清洗，得到表面负载聚合反应引发剂的改性基体D，标记为Ti-Br；
S104：将步骤S103制成的Ti-Br放入由CuBr、THF和GMA组成的聚合物分子刷反应体系中，氩气保护下常温反应18h，得到表面接枝聚合物分子刷涂层的改性基体A，标记为Ti-PGMA；
S105：将核酸适配体加入到pH值为8.5的PBS溶液中，得到10mM的核酸适配体溶液后，将步骤S104制成的Ti-PGMA浸入其中，常温下反应24h，反应后通过RO水清洗，得到表面负载核酸适配体的改性基体B，标记为Ti-APT；
S106：将100ng的生长因子PDGF-BB滴加在将步骤S105制成的Ti-APT表面，常温孵育150min，即可在基体表面固定生长因子PDGF-BB。
为了验证本申请实施例的实际效果，下面将对实施例3制成的表面结合有生长因子PDGF-BB的钛基材料进行性能表征，具体包括：
1.将实施例3依次得到的Ti、Ti-PDATi-Br和Ti-PGMA进行XPS表征，结果为图1所示。其中，图1示出了本实施例3得到的Ti、Ti-PDA、Ti-Br和Ti-PGMA的XPS图。
根据图1可知，钛基体表面依次成功接枝多巴胺、Br引发点和PGMA分子刷，有望通过共价结合的方式负载核酸适配体。
2.本申请通过测定不同时间节点下生长因子PDGF-BB的结合量来研究生长因子PDGF-BB的载入速度，具体测定了第30min、60min、90min、120min和150min五个时间节点下的生长因子PDGF-BB的结合量，结果为图2所示。其中，图2示出了不同时间点下生长因子PDGF-BB的结合量。
根据图2可知，该五个时间节点下，钛基体与生长因子PDGF-BB均接近完全结合，并且第30min和第150min的结合量无显著性差异，表明钛基体表面结合的核酸适配体可以快速识别并结合生长因子。
3.本申请通过测定生长因子PDGF-BB的释放量来研究生长因子PDGF-BB与钛基体表面结合的牢固性，结果为图3所示。其中，图3示出了生长因子PDGF-BB在5天内的释放量。
根据图3可知，本实施例制备的表面结合有生长因子PDGF-BB的钛基材料累计5天的释放量为8.36±0.504ng，说明本申请实施例的固定方法能够使得钛基体稳定地结合生长因子PDGF-BB。
综合上述，本申请实施例提供的基体表面生长因子的固定方法具有结合牢固度好和生长因子载入速度快的特点，特别适于工业化生产。
本说明书中的各个实施方式采用递进的方式描述，各个实施方式之间相同或相似的部分可互相参见，每个实施方式重点说明的都是与其他实施方式的不同之处。
以上实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对本申请限制；尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，本领域普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种基体表面生长因子的固定方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备表面接枝聚合物分子刷涂层的改性基体A；
将改性基体A与核酸适配体溶液反应，得到表面负载核酸适配体的改性基体B；
将改性基体B与生长因子接触后，室温孵育，完成生长因子在基体表面的结合与固定。
2.根据权利要求1所述的固定方法，其特征在于，改性基体A的制备方法包括：
制备表面沉积多巴胺涂层的改性基体C；
无氧环境下，将改性基体C与四氢呋喃、溴代异丁酰溴、三乙胺混合反应，得到表面负载聚合反应引发剂的改性基体D；
无氧环境下，将改性基体D在聚合物分子刷反应体系中反应，得到改性基体A。
3.根据权利要求2所述的固定方法，其特征在于，改性基体C与四氢呋喃、溴代异丁酰溴、三乙胺混合反应时，改性基体C、四氢呋喃、溴代异丁酰溴和三乙胺的质量比为1:20:1.8:2。
4.根据权利要求2所述的固定方法，其特征在于，聚合物分子刷反应体系由CuBr、THF和GMA组成，其中，GMA的用量为10mmol。
5.根据权利要求4所述的固定方法，其特征在于，改性基体D在聚合物分子刷反应体系中的反应时间为12-24h。
6.根据权利要求2所述的固定方法，其特征在于，改性基体C的制备方法包括：
提供基体；
对基体表面依次进行清洗、干燥、除氧和活化，得到活化基体；
使活化基体与多巴胺溶液反应，得到改性基体C。
7.根据权利要求6所述的固定方法，其特征在于，对基体表面进行清洗时，依次使用丙酮、乙醇和去离子水进行清洗；
和/或，对基体表面进行除氧时，使用硝酸、氢氟酸进行酸洗；
和/或，对基体表面进行活化时，使用食人鱼溶液进行浸泡处理。
8.根据权利要求6所述的固定方法，其特征在于，使活化基体与多巴胺溶液反应时，多巴胺溶液的浓度为2mg/mL。
9.根据权利要求1所述的固定方法，其特征在于，核酸适配体溶液的配制方法包括：
将核酸适配体加入到pH值为7.4-8.5的PBS溶液中，得到4-10mM的核酸适配体溶液。
10.根据权利要求1-9任一所述的固定方法，其特征在于，孵育时间不小于30min。
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