CN116326537A - 一种大鼠克罗恩病模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种大鼠克罗恩病模型的构建方法，包括分两次向大鼠结肠内注入2,4,6‑三硝基苯磺酸(TNBS)与无水乙醇的等体积混合液的步骤，第一次注入剂量为70～80mg/kg TNBS，第二次注入剂量为120～130mg/kg TNBS，两次给药间隔6天。本发明方法构建的大鼠克罗恩病模型造模成功率高，大鼠死亡率低，而且可重复性强、模型一致性好，与人类克罗恩病疾病更为接近，在临床上用于克罗恩病机理和药物筛选等研究具有非常好的应用潜能。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种大鼠克罗恩病模型的构建方法。
背景技术
炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一类由遗传、感染、免疫或环境因素等多种病因引起的、异常免疫介导的肠道慢性炎症性疾病，有终生复发倾向。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn disease，CD)是其主要的类型。
克罗恩病多见于15～30岁，首次发作可出现在任何年龄组，男女发病率无明显差别。近年来，我国克罗恩病患病率有增加趋势，其属一种病因不明确的胃肠道慢性非特异性、溃疡、坏死性验证，常伴有炎性肉芽肿性疾病，临床以腹痛、腹泻、腹块、瘘管形成和肠梗阻为特点，可伴有发热、贫血、营养障碍以及关节、皮肤、眼、口腔黏膜、肝脏等肠外损害。因此，克罗恩病严重威胁着人们的健康，但是目前尚无根治CD的有效方法，因其病因尚不明晰，诱因复杂，又具有反复发作的特点，给治疗带来了更多的难度。
动物模型的构建为疾病的机理研究和治疗药物筛选提供了很好的手段。目前研究克罗恩病发病机制和评价治疗效果的比较理想的模型制备方法是参照Morris于1984年首创的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)动物模型，基于此，研究人员在Morris的方法基础上对使用TNBS进行大鼠克罗恩病模型构建进行了诸多研究，目前最常用的手段是对大鼠灌肠给予TNBS乙醇溶液，利用乙醇清除粘液层从而削弱结肠粘膜屏障，便于药物进入肠道粘膜，而作为半抗原物质TNBS进入结肠粘膜后与组织蛋白共同形成抗原物质致使细胞活化，从而激活获得性免疫反应，最终引发肠道炎症。TNBS作为一种化学性半抗原，能够与组织蛋白结合形成完全抗原，从而介导细胞免疫反应，诱导形成CD。
然而，目前报道的以TNBS对大鼠灌肠构建克罗恩病模型的方法，仍存在TNBS给药剂量大、动物死亡率高等缺点。例如，张弛等人对诱导大鼠克罗恩病模型的TNBS和乙醇的浓度进行了筛选，在多种不同的浓度下，连续4周每周按照100～150mg/kg的TNBS剂量灌肠一次，建模的过程中，大鼠死亡率高达30％以上(张驰,肖玲,刘涛,王园园,张国山,刘密.克罗恩病大鼠模型制备最佳TNBS与乙醇浓度的筛选实验[J].中国中医药现代远程教育,2018,16(18):72-75.)。此外，现有的让大鼠自由饮用TNBS溶液单次诱导克罗恩病的建模方式对病症程度、模型一致性的控制、以及动物模型与人类实际CD疾病的相似性也有待进一步提高。
因此，进一步探索大鼠死亡率低、模型一致性高、与人类实际克罗恩病疾病更接近的大鼠克罗恩病疾病模型，具有非常重要的临床研究意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大鼠死亡率低、模型一致性高、与人类实际克罗恩病疾病更接近的大鼠克罗恩病模型。
本发明提供了一种大鼠克罗恩病模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)第一次给药：按照70～80mg/kg的TNBS的剂量，用TNBS与无水乙醇的混合液对大鼠灌肠，TNBS与无水乙醇的体积比为(1～3):1；
(2)第二次给药：第一次给药后的第6天，再次按照120～130mg/kg的TNBS的剂量，用TNBS与无水乙醇的混合液对大鼠灌肠，TNBS与无水乙醇的体积比为(1～3):1。
进一步地，步骤(1)所述给予TNBS的剂量为70mg/kg。
进一步地，步骤(1)所述TNBS与无水乙醇的体积比为1:1。
进一步地，步骤(2)所述给予TNBS的剂量为125mg/kg。
进一步地，步骤(2)所述TNBS与无水乙醇的体积比为1:1。
更进一步地，上述大鼠在第一次给药前禁食不禁水24h。
更进一步地，上述大鼠在第一次给药前进行麻醉，并用PBS灌肠清洗肠道。
更进一步地，上述大鼠在每次给药后倒立姿势维持30s，每次给药后自由饮水进食。
本发明还提供上述的方法构建得到的大鼠克罗恩病模型在克罗恩病疾病研究中的应用，所述研究是以非疾病的诊断或治疗为目的；
进一步地，上述研究是筛选防治克罗恩病的药物的研究，或克罗恩病炎症机制的研究。
本发明的有益效果：
本发明分多次、低浓度对大鼠进行TNBS给药诱导，构建得到大鼠克罗恩病模型，大鼠死亡率低，模型可重复性强、一致性好，并且与人类克罗恩病疾病更为接近，在临床上用于克罗恩病机理和药物筛选等研究具有非常好的应用潜能。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为试验周期内各组动物体重变化曲线；数据均采用平均值(Mean)±标准差(SD)进行统计分析(空白对照组n＝3，模型组n＝7)。
图2为试验周期内各组动物DAI评分统计图；数据均采用平均值(Mean)±标准差(SD)进行统计分析(空白对照组n＝3，模型组n＝7)。
图3为试验周期终点各组动物局部中性粒细胞引起炎症的统计图；所有个体数据均采用平均值(Mean)±标准差(SD)进行统计分析，(空白对照组n＝3，模型组n＝7)。
图4为试验周期终点各组动物结肠组织损伤病理图。
具体实施方式
本发明大鼠为SD大鼠，购自北京维通利华实验技术有限公司；生产许可证号：SCXK(浙)2019-0001。
除另有说明外，所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明大鼠克罗恩病模型的构建
1)模型构建前实验动物禁食不禁水24h；
2)将大鼠放入充满3.0％异氟烷的麻醉诱导盒进行麻醉诱导，经过麻醉诱导的动物转移至操作台上；
3)使用小动物气体麻醉机以2.0％～2.5％异氟烷按200mL/min进行麻醉维持，观察大鼠眼睑反射和痛觉反应，在眼睑反射反应及四肢和尾部痛觉反应消失后将大鼠按仰卧姿势固定于操作台上；
4)橡胶软管均匀涂抹凡士林轻柔缓慢由肛门插入至结肠内约8cm处，注入1mL PBS清洗肠道；
5)D1将TNBS与无水乙醇等体积混合，按TNBS 75mg/kg剂量注入大鼠结肠内，注入结束缓慢拔出软管，大鼠呈倒立姿势保持30s后再放回饲养笼中，苏醒后自由饮水进食；
6)D7将TNBS与无水乙醇等体积混合液按TNBS 125mg/kg剂量注入大鼠结肠内，注入结束缓慢拔出软管，大鼠呈倒立姿势保持30s后再放回饲养笼中，苏醒后自由饮水进食，继续饲喂至少1天，造模完成。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、
1、实验方法
3只大鼠作为空白对照组，给予同剂量的生理盐水；7只大鼠作为模型组，按照实施例1的方法构建克罗恩病模型。
1.1体重
测定动物：所有计划测定的存活实验动物；
测定时间：给药周期内，每天称量1次大鼠体重，绘制诱导周期内动物体重变化曲线；试验终点称量一次，用于计算解剖麻醉所用戊巴比妥钠用量。
1.2疾病活动度指数(DAI)
测定动物：各组存活动物；
测定方法：基于动物体重、粪便形态及性状、隐血或便血情况对各组实验动物疾病活动指数进行评分，评分标准见表1。
表1 DAI评分标准表
注：基于体重下降幅度、粪便形态及便血进程进行DAI评分，分别计算各个指标分值，采用三个评分指标之和进行统计分析。
测定时间：D6开始测定，每天一次。
1.3髓过氧化物酶活性检测
评价指标：髓过氧化物酶(MPO)活性指标；
检查时间：D14；
检测方法：在460nm处酶标仪读取光密度值(OD)进行计算
采集动物：各组存活动物；
采集方法：禁食16h后，观察，称重，采血。戊巴比妥钠麻醉后处死解剖，摘取结肠，测量长度，评分、拍摄大体外观图像。结肠一半用于MPO活性检测，通过测定大鼠结肠组织髓过氧化物酶MPO活性来评估大鼠结肠组织中性粒细胞的浸润程度，采用分光光度法。
计算公式：MPO活力(单位/升)＝(测定OD值-对照OD值)/(11.3*取样量)
1.4结肠组织病理学检测
检测动物：各组存活动物；
检测方法：实验动物经安可乐死后行大体解剖，取结肠组织(1cm)，称重后，10％甲醛固定，石蜡包埋，切成3μm厚的切片，然后在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇水合，HE染色，脱水、透明，封固，显微镜下观察并拍摄结肠组织病理学改变。
检测时间：D14，常规固定48小时后进行HE染色。
评价指标：组织炎症、病变深度、隐窝破坏和病变范围。
2、实验结果
整个造模过程中，模型组与空白对照组的大鼠均未出现死亡，说明本发明造模方法死亡率低。
基于各组实验动物体重及相关动物临床观察指标的变化，分析TNBS诱导的体重下降进程。
(1)体重检测实验结果表明(图1)，D8-D13期内，空白对照组动物体重正常增长，D8空白对照组动物体重为285.40±22.01g，体重均值至试验终点为320.83±19.07g。模型组动物体重则在模型诱导下出现缓慢下降，具有明显下降趋势，其中试验终点与同等周期内空白对照组动物体重变化相比下降明显，有统计学差异，P＝0.0306。说明本发明造模方法成功引起了大鼠体重下降。
(2)DAI评分实验结果表明(图2)，在整个试验周期内，空白对照组动物DAI评分均不超过1分，D8、D9空白对照组DAI分值均为0.00±0.00，，至试验终点时，空白对照组的DAI平均值仅为0.67±0.58。
而模型对照组自第二次诱导后，DAI平均值始终维持在1以上，且D8～D9模型对照组动物的DAI评分相对于空白对照组有统计学差异(D8：P＝0.0295，D9：P＝0.0001)，说明本发明造模方法显著提高了大鼠的DAI评分，大鼠出现了CD的显著症状。
(3)TNBS与乙醇诱导急性结肠炎试验使SD大鼠形成自身抗原，导致发生针对肠黏膜的一系列免疫反应。动物结肠炎症和溃疡至少维持7～8周。其中，1～3周为急性期改变，以中性粒细胞浸润为主；4～8周为慢性炎症改变，浸润细胞主要为淋巴细胞和浆细胞。MPO是近年来临床广泛采用的一种诊断指标，MPO主要位于多形核白细胞嗜苯胺蓝颗粒中，其在结肠中的活性与组织中性粒细胞浸润程度呈线性关系，在急性炎症期，肠壁主要为中性粒细胞浸润，故MPO活性增加。MPO实验结果表明(图3)，模型对照组相对于空白对照组MPO值上升113.41％，说明本发明造模方法成功诱导了大鼠结肠的急性炎症，在D14仍具有明显的炎症，炎症持续时间长。
(4)空白对照组3只大鼠与模型组7只大鼠的结肠解剖病理图(图4)显示相对于空白对照组，模型组7只大鼠均可见明显的肠壁增厚，黏膜和黏膜下层血管高度扩张充血、水肿及出血现象，可见结肠局部炎症已蔓延至黏膜下层，糜烂到黏膜全层溃疡，与人类CD疾病的病理相似度高，同时说明炎症持续时间长。
上述结果表明，本发明构建大鼠克罗恩病模型的方法成功率高(死亡率低)，构建的大鼠克罗恩病模型可重复性强，模型一致性好、病理更接近人类CD疾病且炎症持续时间长。
综上，本发明提供了一种大鼠克罗恩病模型的构建方法，本发明方法可重复性强、模型一致性好，并且与人类克罗恩病疾病更为接近，在临床上用于克罗恩病机理和药物筛选等研究具有非常好的应用潜能。
Claims (10)
1.一种大鼠克罗恩病模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)第一次给药：按照70～80mg/kg的TNBS的剂量，用TNBS与无水乙醇的混合液对大鼠灌肠，TNBS与无水乙醇的体积比为(1～3):1；
(2)第二次给药：第一次给药后的第6天，再次按照120～130mg/kg的TNBS的剂量，用TNBS与无水乙醇的混合液对大鼠灌肠，TNBS与无水乙醇的体积比为(1～3):1。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述给予TNBS的剂量为70mg/kg。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述TNBS与无水乙醇的体积比为1:1。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述给予TNBS的剂量为125mg/kg。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述TNBS与无水乙醇的体积比为1:1。
6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述大鼠在第一次给药前禁食不禁水24h。
7.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述大鼠在第一次给药前进行麻醉，并用PBS灌肠清洗肠道。
8.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述大鼠在每次给药后倒立姿势维持30s，每次给药后自由饮水进食。
9.权利要求1～8任一项所述的方法构建得到的大鼠克罗恩病模型在克罗恩病疾病研究中的应用，所述研究是以非疾病的诊断或治疗为目的。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述研究是筛选防治克罗恩病的药物的研究，或克罗恩病炎症机制的研究。
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| CA2920533A1 (en) * | 2013-08-06 | 2015-02-12 | Tasly Pharmaceutical Group Co., Ltd.. | Application of andrographolide in the preparation of a pharmaceutical for treatment of inflammatory bowel disease, andrographolide enteric targeting micropellet, and method for preparation thereof |
| CN106822076A (zh) * | 2016-12-23 | 2017-06-13 | 广州中大南沙科技创新产业园有限公司 | 一种改进的sd大鼠克罗恩病造模方法 |
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