CN116322772A - 针对冠状病毒的抗病毒组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及针对冠状病毒的抗病毒组合物。更具体地，抗病毒组合物包括包含由SEQ ID NO:1表示的重链CDR1(VH CDR1)、由SEQ ID NO:2表示的VH CDR2、由SEQ ID NO:3表示的VH CDR3、由SEQ ID NO:4表示的轻链CDR1(VL CDR1)、由SEQ ID NO:5表示的VL CDR2、和由SEQ ID NO:6表示的VL CDR3的抗体或其片段，由此对冠状病毒表现出优异的抗病毒效果以及预防、治疗或改善由冠状病毒引起的疾病的效果。

Description

针对冠状病毒的抗病毒组合物
技术领域
本发明涉及用于冠状病毒的抗病毒组合物。
背景技术
冠状病毒是指属于冠状病毒科的病毒并且通常见于包括鸟类和人类的各种哺乳动物中。已知冠状病毒引起呼吸道和/或消化道感染，这取决于病毒的性质和宿主。
属于冠状病毒科的病毒通常具有长度为27-32kb的单链正义RNA基因组，其中在基因组的5'端存在帽(cap)，并且在3'端存在多聚腺苷酸尾(poly A tail)。冠状病毒的直径为约80至200nm，并且在病毒颗粒的表面上存在棒状刺突(club-shaped spikes)。病毒具有包膜，并且也存在主要外膜蛋白例如刺突蛋白和包膜蛋白。刺突蛋白参与病毒感染和致病，包括中和抗体的诱导、受体结合、膜融合等。包膜蛋白在形成病毒颗粒时或在病毒感染之后在宿主的细胞之间移动时起到保护病毒的作用。
将冠状病毒分为四个属：α、β、γ和δ。α-冠状病毒属进一步分为1a型和1b型，而β-冠状病毒属分为2a型、2b型、2c型和2d型。已知α-冠状病毒属和β-冠状病毒属感染人类和动物，已知γ-冠状病毒属和δ-冠状病毒属感染动物。
通常已知冠状病毒为在人类中引起普通感冒症状的病原体，但是最近作为在人类中发生的新型传染病例如严重急性呼吸系统综合征(SARS)、中东呼吸系统综合征(MERS)和由冠状病毒感染性疾病-19(COVID-19)引起的新型感染性肺炎的主要病原体而引起关注。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供用于冠状病毒的抗病毒组合物。
此外，本发明的另一目的在于提供用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病(COVID)的药物组合物。
此外，本发明的另一目的在于提供用于预防或改善冠状病毒感染性疾病(COVID)的食品组合物。
用于解决问题的方案
1.一种用于冠状病毒的抗病毒组合物，所述组合物包括抗体或其片段，所述抗体或其片段包括：由SEQ ID NO:1表示的重链CDR1(VH CDR1)、由SEQ ID NO:2表示的VH CDR2、由SEQ ID NO:3表示的VH CDR3、由SEQ IDNO:4表示的轻链CDR1(VL CDR1)、由SEQ ID NO:5表示的VL CDR2、和由SEQ ID NO:6表示的VL CDR3。
2.根据上述1的抗病毒组合物，其中抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区。
3.根据上述1的抗病毒组合物，其中抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。
4.根据上述1的抗病毒组合物，其中片段为选自由单链抗体、Fv、scFv、di-scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2和双价抗体(diabody)组成的组中的至少一者。
5.根据上述1的抗病毒组合物，其中片段为包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的scFv。
6.根据上述1的抗病毒组合物，其中抗体或其片段为人源化抗体或其片段、或者嵌合抗体或其片段。
7.根据上述1的抗病毒组合物，其中冠状病毒为选自由α-冠状病毒属和β-冠状病毒属组成的组中的至少一者。
8.根据上述1的抗病毒组合物，其中冠状病毒为选自由SARS-冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、人冠状病毒OC43(hCoV-OC43)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)组成的组中的至少一者。
9.一种用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病的药物组合物，其包含上述1至8中任一项的组合物。
10.根据上述9的药物组合物，其中冠状病毒为选自由SARS-冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、人冠状病毒OC43(hCoV-OC43)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)组成的组中的至少一者。
11.一种用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病的食品组合物，其包含上述1至8中任一项的组合物。
12.根据上述11所述的食品组合物，其中冠状病毒为选自由SARS-冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、人冠状病毒OC43(hCoV-OC43)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)组成的组中的至少一者。
发明的效果
本发明的抗病毒组合物包括具有抑制冠状病毒的感染和增殖的活性的抗体或其片段，从而对冠状病毒表现出优异的抗病毒效果，同时实现对COVID的预防效果、治疗效果或改善效果。
附图说明
图1示出根据本发明的一个实施方案的抗体或其片段的序列。
图2示出确认本发明的一个实施方案中的细胞内穿透活性(intracellularpenetration activity)的结果。
图3示出确认本发明的一个实施方案中的水解病毒基因的功效的结果。
图4示出通过MTT分析来确认本发明的一个实施方案中的相对于浓度的细胞内毒性的结果。
图5示出通过NGS分析来确认本发明的一个实施方案中的相对于浓度的细胞内毒性的结果。
图6示出通过实时定量PCR来确认本发明的一个实施方案中针对SARS-CoV-2的抗病毒功效的结果。
图7示出通过实时定量PCR来确认本发明的一个实施方案中针对SARS-CoV-2的抗病毒功效的结果。
图8示出通过实时PCR来确认本发明的一个实施方案中的相对于浓度的、针对SARS-CoV-2的抗病毒功效的结果。
图9示出通过噬菌斑测定来确认本发明的一个实施方案中针对SARS-CoV-2的抗病毒功效的结果。
图10示出通过实时定量PCR来确认本发明的一个实施方案中针对hCoV-OC43和PEDV的抗病毒功效的结果。
图11示出通过实时PCR来确认本发明的一个实施方案中的相对于浓度的、针对hCoV-OC43和PEDV的抗病毒功效的结果。
图12示出通过噬菌斑测定来确认本发明的一个实施方案中针对hCoV-OC43和PEDV的抗病毒功效的结果。
图13示出通过免疫印迹来确认本发明的一个实施方案中针对hCoV-OC43和PEDV的抗病毒功效的结果。
具体实施方式
下文中，将详细地描述本发明。
本发明提供用于冠状病毒的抗病毒组合物，所述组合物包括抗体或其片段，所述抗体或其片段包括：由SEQ ID NO:1表示的重链CDR1(VH CDR1)、由SEQ ID NO:2表示的VHCDR2、由SEQ ID NO:3表示的VH CDR3、由SEQ ID NO:4表示的轻链CDR1(VL CDR1)、由SEQ IDNO:5表示的VL CDR2、和由SEQ ID NO:6表示的VL CDR3。
术语“互补决定区(CDR)”是指参与抗原识别的区域，其中当该区域的序列变化时，决定了抗体对抗原的特异性。如本文中所使用的，VH CDR是指存在于重链可变区的重链互补决定区，并且VL CDR是指存在于轻链可变区的轻链互补决定区。
术语“可变区”是指在发挥与抗原特异性结合的功能的同时表现出序列变化的区域，并且CDR1、CDR2和CDR3存在于可变区。在CDR之间存在框架区(framework region，FR)部分，其可以用于支承CDR。无论框架区如何，CDR可能是使抗体或其片段表现出特定功能的重要区域。
抗体或其片段可以包括包含由SEQ ID NO:1表示的重链CDR1(VH CDR1)、由SEQ IDNO:2表示的VH CDR2、和由SEQ ID NO:3表示的VH CDR3的重链可变区；以及包含由SEQ IDNO:4表示的轻链CDR1(VL CDR1)、由SEQ ID NO:5表示的VL CDR2、和由SEQ ID NO:6表示的VL CDR3的轻链可变区。
抗体或其片段可以包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区。根据一个实施方案，抗体或其片段可以包括由SEQ ID NO:7的氨基酸序列构成的重链可变区。
抗体或其片段可以包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。根据一个实施方案，抗体或其片段可以包括由SEQ ID NO:8的氨基酸序列构成的轻链可变区。
抗体的片段(‘抗体片段’)可以为选自由单链抗体、Fv、scFv、di-scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fd、LC、dAb、CDR、scFv-Fc和双价抗体(diabodies)组成的组中的至少一者。
抗体片段可以包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列。根据一个实施方案，抗体片段可以由SEQ ID NO:9的氨基酸序列构成。根据一个实施方案，抗体片段可以由包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的scFv构成。
抗体或其片段可以为人源化抗体或其片段、或者嵌合抗体或其片段。人源化抗体可以通过本领域已知的方法来制备。
根据一个实施方案，抗体片段可以为包含SEQ ID NO:9的scFv的CDR序列的人源化scFv。
根据本发明的抗体或其片段可以具有核酸酶活性并且可以降解病毒的RNA和DNA。抗体或其片段可以穿透至病毒感染的宿主细胞的细胞质中而无需进一步处理。可以认为抗体或其片段的细胞质穿透作用是由于胞膜小窝(Caveolae)介导的内吞作用。
根据本发明的抗体或其片段可以穿透至感染有冠状病毒的宿主的细胞质中，并且从感染细胞中除去裸露的病毒RNA，所述抗体或其片段可以诱导病毒基因复制量的减少和病毒蛋白的减少，同时提高病毒治疗的功效。
冠状病毒可以为选自由α-冠状病毒属、β-冠状病毒属、γ-冠状病毒属和δ-冠状病毒属组成的组中的至少一者。
冠状病毒可以为选自由α-冠状病毒属或β-冠状病毒属组成的组中的至少一者。
冠状病毒可以为人冠状病毒或非人动物冠状病毒，例如，动物可以为猪或牛等。
冠状病毒可以为选自由以下组成的组中的至少一者：犬冠状病毒(CCoV)、猫冠状病毒(FeCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、火鸡冠状病毒(TCoV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、大鼠冠状病毒(RCV)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(NL)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-Cov)和SARS冠状病毒2(SARS-CoV-2)。
根据一个实施方案，冠状病毒可以为选自由SARS-冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、人冠状病毒OC43(hCoV-OC43)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)组成的组中的至少一者。
此外，本发明提供用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病的药物组合物，其包含上述抗病毒组合物。
由于以上已经描述了抗病毒组合物、抗体或其片段、以及冠状病毒，因此将不再详细描述。
术语“预防”是指抑制由病毒引起的疾病或延缓疾病的发作的任何行为。
术语“治疗”是指改善或有益地改变由病毒引起的疾病的症状的任何行为。
冠状病毒可以选自由以下组成的组：犬冠状病毒(CCoV)、猫冠状病毒(FeCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、火鸡冠状病毒(TCoV)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、大鼠冠状病毒(RCV)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(NL)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、SARS冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸系统综合征冠状病毒(MERS-Cov)和SARS-CoV-2(SARS-CoV-2)。
冠状病毒感染性疾病可以包括流感、感冒、咽喉痛、支气管炎或肺炎，但是它们不限于此，只要它们是由病毒感染引起的疾病即可。冠状病毒感染性疾病可以为冠状病毒感染性疾病-19(COVID-19)。
本发明的药物组合物可以单独地使用、或与使用手术、药物疗法和生物反应调节剂的方法组合使用，用于预防和治疗疾病。
药物组合物可以包括对病毒感染具有治疗效果的附加成分，并且附加成分可以为已知对病毒感染具有治疗效果的任何组分，包括化合物、天然产物、蛋白质、肽和核酸等。
药物组合物可以进一步包括通常用于制备组合物的合适的载体、赋形剂和稀释剂。此类载体、赋形剂和稀释剂可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、或矿物油等。
本发明的药物组合物可以根据常规方法以口服剂型例如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、气雾剂、外用制剂、栓剂和无菌注射液来配制，并且此类配制可以通过在制药领域中通常进行的方法来进行。在制剂的情况下，可以通过额外应用稀释剂或赋形剂例如常用的填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂和表面活性剂来制备。
用于口服给药的固体制剂可以包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且此类固体制剂可以包括至少一种赋形剂，例如，淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等。除了简单的赋形剂以外，还使用例如硬脂酸镁和滑石等润滑剂。用于口服给药的液体制剂可以包括混悬剂、内服溶液剂、乳剂、糖浆剂等，并且除了作为常用的简单稀释剂的水和液体石蜡以外，还可以包含各种赋形剂例如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。用于肠胃外给药的制剂可以包括无菌水溶液剂、非水溶液剂、混悬剂、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水剂和助悬剂，可以使用丙二醇、聚乙二醇、例如橄榄油等植物油、和例如油酸乙酯等可注射酯类。作为栓剂的基质，可以使用witepsol、聚乙二醇、吐温、可可脂、月桂精、甘油明胶等。
可以根据患者的病况和体重、疾病程度、药物形式、给药途径和持续时间适当地给予本发明的药物组合物。例如，本发明的药物组合物可以以每天约0.1至1,000mg/kg并且具体为100至300mg/kg给药。
本发明的药物组合物中包含的抗体或其片段的浓度可以为低于40μM、低于39μM、低于38μM、低于37μM、低于36μM、低于35μM、低于34μM、低于33μM、低于32μM、低于31μM、低于30μM、低于29μM、低于28μM、低于27μM、低于26μM、低于25μM、低于24μM、低于23μM、低于22μM、低于21μM、低于20μM、低于19μM、低于18μM、低于17μM、低于16μM、低于15μM、低于14μM、低于13μM、低于12μM、低于11μM、或低于10μM。本发明的药物组合物中包含的抗体或其片段的浓度可以超过0μM。
此外，本发明提供用于预防或改善冠状病毒感染性疾病的食品组合物，其包含上述抗病毒组合物。
以上已经描述了抗病毒组合物、抗体或其片段、冠状病毒和疾病，因此将不再详细描述。
术语“改善”是指减轻由病毒引起的疾病的症状的任何行为。
食品组合物可以与其它食品或食品成分一起使用，并且可以根据常规方法适当地使用。
食品组合物中包含的活性成分的混合量可以根据其使用目的(用于预防或改善)适当地确定。具体地，食品组合物中包含的抗体或其片段的浓度可以为低于40μM、低于39μM、低于38μM、低于37μM、低于36μM、低于35μM、低于34μM、低于33μM、低于32μM、低于31μM、低于30μM、低于29μM,低于28μM、低于27μM、低于26μM、低于25μM、低于24μM、低于23μM、低于22μM、低于21μM、低于20μM、低于19μM、低于18μM、低于17μM、低于16μM、低于15μM、低于14μM、低于13μM、12μM、低于11μM或低于10μM。本发明的食品组合物中包含的抗体或其片段的浓度可以超过0μM。
食品组合物的类型没有特别限制，并且可以包括例如肉、香肠、面包、巧克力、糖果、零食、糕点、披萨、拉面、其它面条、口香糖、包括冰淇淋的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮品、酒精性饮料和复合维生素。
与常规食品一样，除了活性成分以外，食品组合物可以进一步包括附加成分例如调味剂或天然碳水化合物。天然碳水化合物可以包括：单糖例如葡萄糖和果糖；二糖例如麦芽糖和蔗糖；多糖例如糊精和环糊精；以及糖醇例如木糖醇、山梨糖醇或赤藓糖醇。甜味剂的实例可以包括天然甜味剂例如索马甜(taumatin)和甜叶菊提取物以及合成甜味剂例如糖精和阿斯巴甜。
除了上述以外，本发明的保健食品可以包括各种营养素、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、酒精、和用于碳酸饮料的碳酸化剂等。此外，其可以包含用于生产天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。
此外，本发明提供预防或治疗冠状病毒感染性疾病的方法，其包括对受试者给予上述抗病毒组合物。
受试者可以为人和/或非人动物，并且具体为能够借助使用本发明的药物的治疗表现出有益效果的哺乳动物。
受试者可以包括患有或有风险患有冠状病毒感染性疾病的症状(例如，发烧、不适、咳嗽、呼吸困难、肺炎、痰、咽喉痛、头痛、咯血、恶心或腹泻)的所有受试者。冠状病毒与上述相同，因此不再详细描述。
对于预防或治疗冠状病毒感染性疾病有效的量意指能够在有需要的受试者中实现期望结果的量、或能够为有需要的受试者提供客观益处或主观益处的量。
对于预防或治疗冠状病毒感染性疾病有效的量可以为单剂量或多剂量。对于预防或治疗冠状病毒感染性疾病有效的量可以为单独提供本发明药物时的量，也可以为与一种或多种其它组合物(例如，其它呼吸道疾病治疗剂等)组合提供时的量。
除非另有说明，本文中所述的数值应当被解释为包括等同的范围。
此外，本发明提供包含上述抗病毒组合物的药物组合物用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病的用途。
下文中，将给出实施例以详细描述本发明。
1.抗体或其片段的制备
使用大肠杆菌BL21细胞作为宿主，生产具有下表1的SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重组蛋白NVG308(scFv)(参见图1)。下表1列出了与NVG308相关的序列(scFv序列；其VH序列、VL序列、CDR序列；及其基因序列)。
将包含SEQ ID NO:10的核苷酸序列的质粒在用CaCl2处理的大肠杆菌BL21细胞中在42℃下进行加热处理1分钟然后在37℃下稳定1小时。此后，选择通过将稳定化产物涂布在含有抗生素的选择性培养基上而转化的菌落，并且在其上培养细胞以表达scFv。为了促进大肠杆菌BL21细胞对培养箱的适应，将在-80℃下、在20％甘油浓度下储存的细胞在30mlLB肉汤培养基中预培养8至9小时。此时，细胞浓度为(A600 nm)OD 5至7。在该培养中，使用LB肉汤培养基，并且培养基的体积为3L。在将预培养的种子(seed)接种至主培养物中之前，添加选择标记物即卡那霉素和氯霉素以分别达到50mg/ml和25mg/ml。接下来，接种30ml制备好的种子，以维持相对于主培养液的体积为1％的接种量。种子接种后，将温度维持在37℃，并且使用浓度为25％至30％的氨水将pH维持在6.8。此外，为了维持含氧环境，将DO设定为40％以上。种子接种后3至4小时，当细胞浓度(A600 nm)OD达到0.7至0.9时，用1mM IPTG(异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)开始诱导，并且在13至15小时后，当细胞浓度达到(A600nm)OD 7至8时终止培养。
[表1]
Figure BDA0004113416530000101
Figure BDA0004113416530000111
2.细胞内穿透活性的确认
根据免疫细胞化学方法，确认了抗体或其片段对细胞的穿透能力。具体地，将Vero-E6细胞用5μM NVG308处理，然后在37℃下、在5％ CO2的条件下、在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)+10％ FBS+1％ P/S抗生素培养基中培养。此后，借助免疫荧光染色，将细胞用Alexa Fluor 488二抗和scFv抗体染色，并且处理后每经过一段时间检查scFv的细胞内穿透活性。使用具有DAPI的抗荧光淬灭封片剂(Antifade mounting medium)对细胞核进行染色。
结果，确认到scFv(用绿色荧光标记)存在于细胞中，直至蛋白质处理后24小时。此外，确认到大多数scFv存在于细胞中达4至8小时(参见图2)。
3.使病毒基因水解的效果的确认
确认了抗体或其片段对冠状病毒刺突基因(NA、HA)的水解活性。具体地，使用RT-PCR来合成hCoV-OC43、PEDV和SARS-CoV-2的刺突基因(NA、HA)。用于RT-PCR的引物在下表2中示出。
[表2]
Figure BDA0004113416530000121
将1.0μg病毒基因和0.5μg NVG308混合并且在37℃下反应1小时。作为对照，将1.0μg病毒基因和0.5μg BSA混合并且在37℃下反应1小时。
然后，作为通过电泳确认核酸水解能力的结果，NVG308显示出降解冠状病毒的病毒基因的功效(参见图3)。
4.细胞内毒性的确认
4-1.MTT分析
为了确认scFv的细胞内毒性，使用Vero-E6细胞进行MTT分析。具体地，分别用1μM、2.5μM、5μM、10μM和40μM的NVG308处理Vero-E6细胞，并且在约24小时之后确认毒性。结果，在细胞存活率方面不存在显著性差异，直至浓度为10μM。然而，当以40μM的浓度处理时，细胞存活率降低约35％(参见图4)。
4-2.NGS分析
进行NGS分析以确认scFv的细胞内毒性。具体地，NVG308分别以0μM、5μM、10μM和40μM的浓度用于A549细胞系的处理。通过DEG分析来证实遗传变化。在分别用5μM和10μM的NVG308处理的组中，几乎没有基因处于上调或下调状态，而用40μM NVG308处理的组显示1,194个上调的基因和102个下调的基因(参见图5的上部)。此外，作为研究管家基因中的突变的结果，R2值在用5μM NVG308处理的组中为0.9912并且在用10μM NVG308处理的组中为0.997。然而，在用40μM NVG308处理的组中，R2值为0.9588。由该结果，确认到在用40μMNVG308处理的组中，管家mRNA显示出不规则的分布(参见图5的下部)。基于上述结果，对抗病毒功效的研究使用5μM和10μM的NVG308来进行。
5.对SARS-CoV-2的抗病毒功效的确认
5-1.通过实时定量PCR确认抗病毒功效
本发明人用NVG308处理细胞然后用SARS-CoV-2病毒感染它们，然后确认抑制病毒感染的功效。具体地，用NVG308以5μM的浓度预处理Vero-E6细胞之后24小时，使用SARS-CoV-2病毒以MOI为0.02的滴度进行感染48小时。感染病毒后24小时确认抗病毒功效。SARS-CoV-2病毒的N(核衣壳)、E(包膜)和RdRp(RNA依赖性RNA聚合酶)病毒基因的增加或减少分别通过基因扩增(实时定量PCR)来确认。通过实时qPCR检测基因的量。结果，对于所有三种病毒基因，与仅用PBS处理的组相比，在用NVG308处理的组中，基因扩增模式(geneamplification pattern)减少了99％以上(参见图6)。
此外，本发明人通过用SARS-CoV-2病毒处理细胞然后用NVG308处理细胞来研究抑制病毒感染的功效。用SARS-CoV-2病毒以MOI为0.02的滴度感染Vero-E6细胞，然后在2小时后用5μM NVG308处理。在24小时的蛋白质处理之后，确认抗病毒功效。通过实时qPCR检测基因的量。结果，在N基因的情况下，与仅PBS处理组相比，NVG308处理组中的病毒基因扩增模式减少了66％。此外，在E基因的情况下，与仅PBS处理组相比，NVG308处理组中的病毒基因扩增模式减少了63％。此外，在RdRp基因的情况下，与仅PBS处理组相比，在用VG308处理的组中，病毒基因扩增模式减少了64％(参见图7)。
此外，在病毒感染之后，本发明人通过将NVG308的浓度从1μM改变至10μM来处理病毒，并且确认对SARS-CoV-2病毒的抗病毒功效。结果，与PBS处理组相比，在用10μM NVG308处理的组中，分别地，N基因的表达水平降低约90％，E基因的表达水平降低约81％并且RdRp基因的表达水平降低约89％。此外，与PBS处理组相比，在用5μM NVG308处理的组中，分别地，N基因的表达水平降低约73％，E基因的表达水平降低约73％并且RdRp基因的表达水平降低约67％(参见图8)。
用于qPCR的引物在下表3中示出。
[表3]
Figure BDA0004113416530000141
5-2.通过噬菌斑测定来确认抗病毒功效
由通过上述5-1中描述的方法用10μM NVG308处理Vero-E6细胞后感染有SARS-CoV-2病毒的样品和在用SARS-CoV-2病毒感染Vero-E6细胞之后用10μM NVG308处理的另一样品二者，获得培养基汤。通过用各自获得的汤进行噬菌斑测定来测量病毒的数量。结果，用PBS处理后的感染有SARS-CoV-2病毒的组显示每1ml 2.6×106PFU，而用10μM NVG308处理后的感染有SARS-CoV-2病毒的组显示每1ml 1.2×105PFU。即，即使在病毒感染之前用NVG308处理，也可以确认到，与未处理组相比，SARS-CoV-2病毒的数量显著减少(参见图9的上部)。此外，在感染SARS-CoV-2病毒之后仅用PBS处理的组显示每1ml 7.0×106PFU，而在感染SARS-CoV-2病毒之后用10μMNVG308处理的组显示每1ml 1.2×106PFU。即，即使在病毒感染之后处理NVG308，也可以确认到，与未处理组相比，SARS-CoV-2病毒的数量显著减少(参见图9的下部)。
6.抗体或其片段对hCoV-OC43和PEDV的抗病毒功效的确认
6-1.通过实时定量PCR确认抗病毒功效
在感染hCoV-OC43病毒之后，本发明人证实了通过NVG308处理抑制病毒感染的功效。具体地，在用hCoV-OC43病毒以MOI为0.02和0.002的滴度感染Vero-E6细胞之后，两小时后用5μM NVG308处理细胞，然后48小时后测量抗病毒功效。通过实时基因扩增(实时qPCR)检测基因的量。结果，与仅用PBS处理的组相比，用MOI为0.02的hCoV-OC43处理的组的N基因减少约73％，同时还确认到用MOI为0.002的hCoV-OC43处理的组显示N基因减少约81％(参见图10的上部)。
此外，本发明人证实了在感染PEDV病毒之后通过用NVG308处理来抑制病毒感染的功效。具体地，在用PEDV病毒以MOI分别为0.002和0.0002的滴度感染Vero细胞之后，两小时后用5μM NVG308处理细胞，然后24小时后测量抗病毒功效。通过实时qPCR检测基因的量。结果，与仅PBS处理组相比，分别用MOI为0.002和0.0002的PEDV处理的两个组均显示N基因减少约97％(参见图10的下部)。
此外，本发明人在病毒感染之后用NVG308处理细胞，同时将NVG308的浓度从0.1μM改变至10μM，然后针对每种病毒测量抗病毒功效。结果，在hCoV-OC43病毒的情况下，与PBS处理组相比，在分别用2.5μM、5μM和10μMNVG308处理的组中确认到抗病毒功效，并且这些组分别显示使N基因减少82％、82％和98％的效果。在PEDV病毒的情况下，在分别用2.5μM、5μM和10μM的NVG308处理的组中确认到抗病毒功效。具体地，与PBS处理组相比，上述各组分别表现出95％、97％和99％的N基因减少效果(参见图11)。
用于qPCR的引物在下表4中示出。
[表4]
Figure BDA0004113416530000161
6-2.通过噬菌斑测定确认抗病毒功效
在通过上述6-1中描述的方法用MOI为0.02的hCoV-OC43病毒感染Vero-E6细胞之后，准备从用10μM NVG308处理的样品获得的培养基汤。通过用准备的汤进行噬菌斑测定来测量病毒的数量。结果，PBS处理组显示每1ml 1.3×107PFU，而NVG308处理组显示每1ml2.2×106PFU。即，可以确认到，通过NVG308处理使hCoV-OC43病毒的数量减少了82％(参见图12的上部)。
此外，在用MOI为0.002的PEDV病毒感染Vero细胞之后，使用从用10μMNVG308处理的样品获得的培养基汤进行噬菌斑测定。结果，仅用PBS处理的组显示每1ml 5.2×103PFU，而用NVG308处理的组显示1.0×103PFU。即，可以确认到，通过NVG308处理使PEDV病毒的数量减少了81％(参见图12的下部)。
6-3.通过免疫印迹确认抗病毒功效
使用针对hCoV-OC43和PEDV病毒的刺突蛋白的抗体来测定各病毒中蛋白质量的变化。具体地，在hCoV OC43的情况下，用MOI为0.02的hCoV-OC43病毒感染Vero E6细胞，然后使用5μM NVG308处理。本文中，使用HW6(没有溶核活性(nucleolytic activity)的scFv)作为阴性对照。在培养48小时之后，进行免疫印迹分析以检测病毒刺突蛋白的量。结果，确认到与仅用病毒感染的实验组相比，在用scFv处理的实验组中，刺突蛋白的量显著减少。另一方面，确认到用HW6处理的实验组几乎不显示刺突蛋白量的减少。此外，在用MOI为0.001的PEDV病毒感染Vero细胞之后，然后使用5μM NVG308处理。然后，在培养48小时之后，进行免疫印迹分析以检测病毒刺突蛋白的量。结果，在PEDV的情况下，也确认到与仅用病毒感染的实验组相比，在用NVG308处理的实验组中，刺突蛋白的量显著减少(参见图13)。
通过上述实验结果，根据本发明的抗体或其片段在10μM以下的浓度不显示对细胞的毒性，相反，确认到可以实现对各种冠状病毒(SARS-CoV-2、hCoV-OC43和PEDV)的抗病毒功效。
本发明的描述用于说明性目的，并且本发明所属领域的技术人员将理解，在不改变本发明的技术精神或必要特征的情况下，可以容易地将本发明修改为其它具体形式。因此，应当理解，上述实施方案在所有方面都是说明性的而不是限制性的。
本发明的范围由所附权利要求表示，并且源自权利要求的含义和范围以及它们的等同物的所有改变或修改应当被解释为包括在本发明的范围内。
<110> 诺福金基因科技有限公司（Novelgen）
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<160> 28
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR1
<400> 1
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His
1 5 10
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR2
<400> 2
Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly
1 5
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH CDR3
<400> 3
Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR1
<400> 4
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR2
<400> 5
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL CDR3
<400> 6
Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Arg
115 120
<210> 8
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 8
Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser
20 25 30
Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln
85 90 95
Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 9
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> NVG308(scFv)
<400> 9
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys
145 150 155 160
Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp
180 185 190
Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe
225 230 235 240
Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 10
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NVG308 基因
<400> 10
gaggtccagc tgcagcagtc tggacctgag ctggtaaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata cacattcact agctatgtta tgcactgggt gaagcagaag 120
cctgggcagg gccttgagtg gattggatat attaatcctt acaatgatgg tactaagtac 180
aatgagaagt tcaaaggcaa ggccacactg acttcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct attactgtgc aagaggggcc 300
tataaaaggg gatatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctct 360
agaggtgggg gcggttcggg tggcgggggc tcgggcgggg gtggctcaga tcttgtgatg 420
tcacagtctc catcctccct ggctgtgtca gcaggagaga aggtcactat gagctgcaaa 480
tccagtcaga gtctgttcaa cagtagaacc cgaaagaact acttggcttg gtaccagcag 540
aaaccagggc agtctcctaa actgctgatc tactgggcat ccactaggga atctggggtc 600
cctgatcgct tcacaggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtgtg 660
caggctgaag acctggcagt ttattactgc aagcaatctt attatcacat gtatacgttc 720
ggatcgggga ccaagctgga aataaaa 747
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PEDV_正向引物
<400> 11
tgtctctgcg tcttttggtg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PEDV_反向引物
<400> 12
ctgccacttg caggatcata 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2_正向引物
<400> 13
cagatgctgg cttcatcaaa 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2_反向引物
<400> 14
cattgaggcg gtcaatttct 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCoV-OC43 刺突表面糖蛋白_正向引物
<400> 15
agctataccc aatggcagga a 21
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCoV-OC43 刺突表面糖蛋白_反向引物
<400> 16
ccagtggtaa tcgctccac 19
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCoV-OC43 血凝素酯酶_正向引物
<400> 17
cgcatgtaaa tggagattgg tt 22
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCoV-OC43 血凝素酯酶_反向引物
<400> 18
cccaaaagaa tgccaagcaa aa 22
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2_RdRP 基因_正向引物
<400> 19
gtgaratggt catgtgtggc gg 22
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2_RdRP 基因_反向引物
<400> 20
caratgttaa asacactatt agcata 26
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2_E 基因_正向引物
<400> 21
acaggtacgt taatagttaa tagcgt 26
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2_E 基因_反向引物
<400> 22
atattgcagc agtacgcaca ca 22
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2_N 基因_正向引物
<400> 23
cacattggca cccgcaatc 19
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2_N 基因_反向引物
<400> 24
caggaacgag aagaggcttg 20
<210> 25
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCoV-OC43_N 基因_正向引物
<400> 25
agtactgcta tttcttgttc aaacatgtg 29
<210> 26
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hCoV-OC43_N 基因_反向引物
<400> 26
gctctacgac ttcgtctgtt tttaga 26
<210> 27
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PEDV_N 基因_正向引物
<400> 27
gatcgtggcc gcaaacg 17
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PEDV_N 基因_反向引物
<400> 28
tgccattgcc acgactcc 18

Claims (12)

1.一种用于冠状病毒的抗病毒组合物，所述组合物包括抗体或其片段，所述抗体或其片段包括：由SEQ ID NO:1表示的重链CDR1(VH CDR1)、由SEQ ID NO:2表示的VH CDR2、由SEQ ID NO:3表示的VH CDR3、由SEQ IDNO:4表示的轻链CDR1(VL CDR1)、由SEQ ID NO:5表示的VL CDR2、和由SEQ ID NO:6表示的VL CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗病毒组合物，其中所述抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的重链可变区。
3.根据权利要求1所述的抗病毒组合物，其中所述抗体或其片段包括包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链可变区。
4.根据权利要求1所述的抗病毒组合物，其中所述片段为选自由单链抗体、Fv、scFv、di-scFv、Fab、Fab’、F(ab’)2和双价抗体组成的组中的至少一者。
5.根据权利要求1所述的抗病毒组合物，其中所述片段为包含SEQ IDNO:9的氨基酸序列的scFv。
6.根据权利要求1所述的抗病毒组合物，其中所述抗体或其片段为人源化抗体或其片段、或者嵌合抗体或其片段。
7.根据权利要求1所述的抗病毒组合物，其中所述冠状病毒为选自由α-冠状病毒属或β-冠状病毒属组成的组中的至少一者。
8.根据权利要求1所述的抗病毒组合物，其中所述冠状病毒为选自由SARS-冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、人冠状病毒OC43(hCoV-OC43)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)组成的组中的至少一者。
9.一种用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病的药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的组合物。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述冠状病毒为选自由SARS-冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、人冠状病毒OC43(hCoV-OC43)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)组成的组中的至少一者。
11.一种用于预防或治疗冠状病毒感染性疾病的食品组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的组合物。
12.根据权利要求11所述的食品组合物，其中所述冠状病毒为选自由SARS-冠状病毒-2(SARS-CoV-2)、人冠状病毒OC43(hCoV-OC43)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)组成的组中的至少一者。
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