KR20130017458A - ３Ｄ８ ｓｃＦｖ－Ｔ 세포 에피토프 융합단백질, 및 이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

３Ｄ８ ｓｃＦｖ－Ｔ 세포 에피토프 융합단백질, 및 이를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 3D8 scFv의 단백질전달도메인 (protein transduction domain, PTD)과 이의 아미노산 말단에 연결된 T 세포 에피토프를 포함하는 융합단백질, 및 이를 유효성분으로 하는 백신조성물에 관한 것으로, 본 발명의 3D8 scFv-T 세포 에피토프 융합단백질은 3D8 scFv로 인하여 핵산가수분해능을 가지면서도 높은 효율로 세포의 핵내부로 침투하는 능력을 가지고, 항원제시세포에서 교차항원제시반응을 일으키므로, 이를 유효성분으로 하는 백신 조성물은 세포독성 T 세포 활성을 증가시켜, 항암 및 항바이러스 효과가 우수하다.

Description

３Ｄ８ ｓｃＦｖ－Ｔ 세포 에피토프 융합단백질, 및 이를 포함하는 백신 조성물{3D8 scFv-T cell epitope fusion protein, and vaccine composition comprising the same}
본 발명은 3D8 scFv-T 세포 에피토프 융합단백질, 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로 3D8 scFv의 단백질전달도메인 (protein transduction domain, PTD)과 이의 아미노산 말단에 연결된 T 세포 에피토프를 포함하는 융합단백질, 및 이를 유효성분으로 하는 백신조성물 등에 관한 것이다.
현재 암의 면역학적 치료를 위하여, 교차항원제시 (cross-presentation)를 유도하는 단백질전달도메인 (protein transduction domain, PTD)들이 활발히 탐색되고 있다. 이러한 단백질전달도메인의 대표적인 예로는 Tat 펩타이드, 열충격단백질 70 (heat shock protein70, Hsp70)이 있다. 즉, Tat 펩타이드-T 세포 에피토프 융합단백질 형태 또는 Hsp70-T 세포 에피토프 융합단백질 형태의 단백질을 정제하여 항원제시세포 (antigen-presenting cells)에 처리하면, 교차항원제시된 후, 단백질전달도메인에 융합되었던 T 세포 에피토프가 MHC class I 분자에 제시되고, 결국 세포표면의 MHC class I-T 세포 에피토프 복합체는 세포독성 T 세포 활성화를 통하여, 암세포를 사멸시킨다는 보고들이 있다.
그러나 세포침투성 항체를 항원제시세포에서 교차항원제시를 유도하는 단백질전달도메인으로 시도한 예는 없다. 특히, 세포침투성 항체인 3D8 scFv는 핵산 가수분해능을 가지고 있어, 그 자체로도 세포 내로 들어가서 다양한 바이러스 증식을 억제하고, 암세포 내로 들어가서 암세포를 죽이는 항암효과를 가지나, 기존에는 3D8 scFv가 항원제시세포에서 교차항원제시를 유도하는 단백질전달도메인으로 사용된 것에 대해서는 보고된 바 없다.
본 발명은 3D8 scFv의 단백질전달도메인 (protein transduction domain, PTD)과 이의 아미노산 말단에 연결된 T 세포 에피토프를 포함하는 융합단백질, 및 이를 유효성분으로 하는 백신조성물을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 3D8 scFv의 단백질전달도메인 (protein transduction domain, PTD)과 이의 아미노산 말단에 연결된 T 세포 에피토프를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 융합단백질을 유효성분으로 하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 백신 조성물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 백신 조성물을 개체에 투여하여 바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 3D8 scFv-T 세포 에피토프 융합단백질은 3D8 scFv로 인하여 핵산가수분해능을 가지면서도 높은 효율로 세포의 핵 내부로 침투하는 능력을 가지고, 항원제시세포에서 교차항원제시반응을 일으키므로, 이를 유효성분으로 하는 백신 조성물은 세포독성 T 세포 활성을 증가시켜, 항암 및 항바이러스 효과가 우수하다.
도 1a는 3D8 scFv-T 세포 에피토프의 모식도이다.
도 1b는 3D8 scFv-T 세포 에피토프를 박테리아 배양으로부터 발현·정제하여 얻은 후, 순도를 분석한 SDS-PAGE 결과이다.
도 2a는 3D8 scFv-T 세포 에피토프가 3D8 scFv 단백질만큼 DNA를 가수분해하는 능력이 있음을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 2b는 3D8 scFv-T 세포 에피토프가 3D8 scFv 단백질만큼 DNA를 가수분해하는 능력이 있음을 보여주는 아가로스 겔 분석결과이다.
도 2c는 3D8 scFv-T 세포 에피토프가 3D8 scFv 단백질만큼 RNA를 가수분해하는 능력이 있음을 보여주는 아가로스 겔 분석결과이다.
도 2d는 3D8 scFv-T 세포 에피토프가 3D8 scFv 단백질만큼 세포질 내로 이동할 수 있음을 보여주는 공촛점 현미경 분석 결과이다.
도 3a는 3D8 scFv-T 세포 에피토프를 항원제시세포에 처리했을 때, 단백질 농도에 따라 교차항원제시가 증가함을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 3b는 3D8 scFv-T 세포 에피토프를 항원제시세포에 처리했을 때, 처리시간에 따라 교차항원제시가 증가함을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 4a는 3D8 scFv-T 세포 에피토프를 항원제시세포에 처리한 후, 세포표면의 MHC class I 분자와 T 세포 에피토프의 복합체가 형성됨을 보여주는 공촛점 현미경 분석 결과이다.
도 4b는 3D8 scFv-T 세포 에피토프를 항원제시세포에 처리한 후, 세포표면의 MHC class I 분자와 T 세포 에피토프의 복합체가 형성됨을 보여주는 유세포 분석 결과이다.
도 5는 3D8 scFv-T 세포 에피토프의 교차항원제시가, 정제한 단백질에 오염된 불순물이 아닌 융합단백질 고유의 특성임을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 6은 3D8 scFv-T 세포 에피토프의 교차항원제시 경로가 프로테아좀 (proteasome) 의존성 경로임을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 7a는 3D8 scFv-T 세포 에피토프의 교차항원제시 경로가 클로로퀸 (chloroquine, CQ)에 영향을 받지 않음을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 7b는 3D8 scFv-T 세포 에피토프의 교차항원제시 경로가 류펩틴 (leupeptin)에 영향을 받지 않음을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 7c는 3D8 scFv-T 세포 에피토프의 교차항원제시 경로가 펩스타틴 A (pepstatin A)에 영향을 받지 않음을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 8a는 3D8 scFv-T 세포 에피토프의 교차항원제시 경로가 프리마퀸 (primaquine)에 영향을 받지 않음을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 8b는 3D8 scFv-T 세포 에피토프의 교차항원제시 경로가 브레펠딘 A (brefeldin A)에 영향을 받음을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 8c는 3D8 scFv-T 세포 에피토프의 교차항원제시 경로가 사이클로헥사미드 (cycloheximide)에 영향을 받음을 보여주는 ELISA 결과이다.
도 9는 3D8 scFv-T 세포 에피토프의 세포내 유입경로가 소포체 (endoplasmic reticulum) 경로를 통하며, 리소좀 (lysosome) 경로와는 관계가 없음을 보여주는 공촛점 현미경 분석 결과이다.
도 10은 3D8 scFv-T 세포 에피토프를 마우스에 투여했을 때, T 세포 에피토프에 특이적으로 MO5 세포독성 T 세포를 활성화시킴을 보여주는 51Cr-방출 어세이 결과이다.
도 11a는 3D8 scFv-T 세포 에피토프를 종양세포가 자란 마우스에 투여했을 때, 면역증강제를 함께 투여하지 않아도, T 세포 에피토프를 세포표면에 표현하는 종양세포에서 더 강한 세포증식이 억제효과가 나타나며, 3D8 scFv 투여 시 보다, 더 높은 항-종양 활성을 나타나는 것을 보여주는 동물실험 (암세포 크기 측정) 결과이다.
도 11b는 3D8 scFv-T 세포 에피토프를 종양세포가 자란 마우스에 투여했을 때, 면역증강제를 함께 투여하지 않아도, T 세포 에피토프를 세포표면에 표현하는 종양세포에서 더 강한 세포증식이 억제효과가 나타나며, 3D8 scFv 투여 시 보다, 더 높은 항-종양 활성을 나타나는 것을 보여주는, 마우스에서 추출한 종양덩어리 사진이다.
종래에는 세포침투성 항체를 항원제시세포에서 교차항원제시를 유도하는 단백질전달도메인으로 시도한 예는 없다. 이에, 본 발명자들은 3D8 scFv-T 세포 에피토프 융합단백질이 항원제시세포에서 교차항원제시되어 T 세포 에피토프에 특이적인 세포독성 T 세포 활성화를 통해 항암 효과가 증강됨을 확인하고, 이를 통하여 항바이러스 효과가 증강됨을 예측함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
구체적으로, 본 발명은 3D8 scFv의 단백질전달도메인 (protein transduction domain, PTD)과 이의 아미노산 말단에 연결된 T 세포 에피토프를 포함하는 융합단백질을 제공한다.
본 발명에서 "3D8"이란 세포침투성 항체의 일종으로, 이는 핵산가수분해능을 가지고 있어, 항바이러스 효과 및 항암 효과를 가지는 항체를 말한다.
또한, 본 발명에서 "scFv (single chain variable fragment)"는 중쇄가변영역 (VH)과 경쇄가변영역 (VL)이 링커로 연결된 것으로 중쇄가변영역 또는 경쇄가변영역을 사용한 것보다 통상적으로 항원에 대한 결합력이 우수하다고 알려져 있다. 이때, VH와 VL을 결합하는 링커는 당업계에서 통상적으로 사용되는 링커라면 어느 것을 사용해도 무방하다.
상기 T 세포 에피토프는 OVA (ovalbumin)의 전체 또는 일부분일 수 있고, 상기 T 세포 에피토프는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 기재된 OVA (ovalbumin)의 일부분인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 융합단백질을 유효성분으로 하는 백신 조성물을 제공한다. 상기 백신 조성물은 세포독성 T 세포의 활성을 증가시키는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 백신 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 상기 약제학적으로 허용가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명의 백신 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여방법에는 제한이 없다. 예를 들면, 경구 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 경피 주사, 비강 내 투여, 경기관지 투여 또는 근육 내 투여 등이 포함된다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다.
상기 융합단백질 형태의 단백질을 정제하여 항원제시세포 (antigen-presenting cells)에 처리하면, 교차항원제시된 후, 단백질전달도메인에 융합되었던 T 세포 에피토프가 MHC class I 분자에 제시되고, 결국 세포표면의 MHC class I-T 세포 에피토프 복합체는 세포독성 T 세포 활성화를 통하여, 암세포를 사멸시킴으로써 백신 조성물로 이용될 수 있다.
이때 항원제시세포는 외부환경으로부터 유입된 단백질 항원이라 할지라도, MHC class I 항원제시 경로를 통하여, 세포독성 T 세포를 활성화시킬 수 있는데, 이를 교차항원제시라 한다. 교차항원제시할 수 있는 단백질은 암세포 및 바이러스 감염세포 사멸에 중추적인 역할을 하는 세포독성 T 세포를 활성화시킬 수 있기 때문에, 항암 및 항바이러스 백신 조성물로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하여 암의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한 본 발명에서 "약제학적 유효량"은 투여되는 질환 종류 및 중증도, 환자의 체중, 연령, 성별, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정되며 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최대 효과를 얻을 수 있는 양으로, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적 조직에 도달할 수 있는 한 투여방법에는 제한이 없다. 일일 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 mg/kg이며, 하루 일회 내지 수회 나누어 투여하는 것이 바람직하다. 그러나 상기 백신 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 자명하다.
상기 암은 인체의 각종 암, 부인과 종양, 내분비계 암, 중추신경계 종양, 수뇨관암 등이 있으며, 구체적으로는 혈액암, 폐암, 위암, 간암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 대장암, 결장암, 유방암, 자궁 육종, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 식도암, 후두암, 소장암, 갑상선암, 부갑상선암, 연조직의 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 유년기의 고상 종양, 분화 림프종, 방광암, 신장암, 신장 세포 암종, 신장 골반 암종, 제 1 중추신경계 림프종, 척수축 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 아데노마 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 백신 조성물을 개체에 투여하여 바이러스 감염의 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.
상기 바이러스는 바람직하게는 RNA 계통의 바이러스 또는 DNA 계통의 바이러스를 포함하는 것이고, 더욱 바람직하게는 HIV 바이러스나 SARS 바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
본 발명의 이해를 돕기 위한 실시예에 사용되는 B16 뮤린 흑색종 세포는 연세대학교 (서울, 한국)로부터 획득하였다. DC2.4 세포, 뮤린 수지상 세포의 세포라인 (단상형 H-2Kb) 및 MO5 세포, B16 흑색종의 클론이 형질주입된 OVA (ovalbumin)는 Dr. K. L. Rock (University of Massachusetts Medical School, Worcester, MA)로부터 제공받았다. CD8OVA1.3 세포, OVA257-264-H-2Kb 에 특이적인 T 하이브리도마 세포는 Dr. C. V. Harding (Case Western Reverse University, Cleveland, OH)으로부터 제공받았다. B16 세포 및 CD8OVA1.3 세포는 10% fetal calf serum (FCS), 및 항생물질 (10 U/㎖ 페니실린 및 100 ㎕/㎖ 스트렙토마이신)로 보충된 Dulbecco의 변형된 Eagle's 배지 (DMEM, 웰젠, 한국)에서 배양하였다. DC2.4 세포는 10% FBS, 2mM L-글루타민, 100 μM 비필수 아미노산, 10mM HEPES (pH 7.5), 50 μM 2-ME, 및 항생물질로 보충된 RPMI1640 배지 (Welgene, 한국)에서 배양하였다. MO5 세포는 G418 (1㎎/㎖)로 보충한 것을 제외하고는 DC2.4와 같은 배지에서 배양하였다. 수컷 C57BL/6 (H-2Kb) 마우스 (6-8 주령)는 오리엔트바이오 (경기도, 한국)에서 구입하였다.
또한, 본 발명의 이해를 돕기 위한 실시예에 사용되는 TRITC-anti-rabbit IgG, 및 정제된 rabbit IgG는 Sigma (St Louis, MO)로부터 구입하였다. Hoeschst 33342, 및 lysotracker-green은 인비트로젠으로부터 획득하였다. FITC-anti-calnexin 항체는 BD Biosciences에서, Biotin-anti-SIINFEKL-H-2Kb (클론 25-D1.16)은 eBioscience로부터 획득하였다. FITC-Streptavidin은 Vector Laboratories로부터 구입하였다. Polyclonal rabbit anti-3D8 scFv는 본 연구실에서 면역주사를 통해 생산하였다. 순도 90% 근처의 OVA257-264 (SIINFEKL) 합성펩타이드는 펩트론 (대전, 한국)에서 구입하였다.
실시예 1. 3D8-OVA 융합단백질의 제조
모델 H-2Kb 에피토프, OVA257-264 (SIINFEKL; 서열번호 2), 및 OVA250-264 (SGLEQLESIINFEKL; 서열번호 3)의 아미노산 서열에 대응하는 뉴클레오티드를 포함하는 프라이머를 이용한 PCR 방법으로 모델 H-2Kb 에피토프, OVA257 -264 (SIINFEKL; 서열번호 2), 및 OVA250 -264 (SGLEQLESIINFEKL; 서열번호 3)를 3D8 scFv 또는 대조군 HW6 scFv의 3'-말단 부위에 삽입하였다. 증폭된 유전자를 pIg20 박테리아 발현 벡터 (phoA 리더 펩티드와 단백질 A tag을 가지고 있음)에 클로닝하였다. pIg20 벡터를 BL21 DE3 (pLysE) 박테리아에 형질전환한 후, IPTG (0.5 mM)를 첨가함으로써 단백질 발현을 유도하였고, 박테리아 배양액으로부터 단백질을 정제하였다. 단백질은 기존의 방법에 따라 IgG-세파로오스 친화성 크로마토그라피에서 가용성으로 정제되었다. 상기 3D8 scFv, 3D8-OVA250-264, 3D8-OVA257-264, HW6 scFv, 및 HW6-OVA250-264 단백질 농도는 상대적으로 280nm에서 ㎎㎖-1㎝-1 단위의 1.558, 1.430, 1.458, 1.558, 및 1.501의 흡광계수를 이용하여 결정되었다.
도 1a는 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질의 모식도를 나타내는 것이고, 도 1b는 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질을 박테리아 배양으로부터 발현하고 정제하여 얻은 후, 순도를 분석한 SDS-PAGE 결과이다.
실시예 2. 3D8-OVA 융합단백질의 핵산결합능, 핵산 가수분해능 및 세포침투능 비교
3D8-OVA 융합단백질의 DNA 결합능은 ELISA로 평가하였다. pUC19 플라스미드 DNA (200 ng/웰)로 96-웰 플레이트 웰을 코팅한 후, 5% 스킴 밀크/PBS로 상온에서 1시간 블로킹하였다. 각 웰에 단백질 (10 ㎍/㎖)을 넣고 상온에서, 1시간 동안 반응시킨 후, 항-3D8 scFv 일차 항체 및 알칼리성 인산분해효소 (alkaline phosphatase)가 결합된 항-토끼 항체와 순차적으로 실온에서 1시간 반응시켰다. 기질 용액 (p-nitrophenyl phosphate 1 mg/ml in 0.1 M glycine, 1 mM ZnCl2 , 1 mM MgCl2, pH10.3)을 각 웰에 넣고 발색정도를 405 nm 파장에서 분석하였다.
3D8-OVA 융합단백질의 DNA 가수분해활성 분석에 있어서, pUC19 plasmid DNA (200 ng)와 각 단백질 (0.5 μM)을 섞은 후 37℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 이때 반응액은 2 mM MgCl2 ("Mg") 또는 50 mM EDTA ("E")를 함유하는 TBS 완충용액 이었다 (50 mM Tris-Cl, 50 mM NaCl, pH 7.4). 반응혼합물을 아가로스 겔 (0.8%)에서 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide)로 염색하였다 (도2b에서 "B"는 TBS 버퍼를, "M"은 molecular mass marker를 나타냄). 3D8 단백질과 동일한 과정을 거쳐, 박테리아 배양액으로부터 정제한 HW6 scFv 단백질을 가수분해반응에 대한 음성대조로 사용하였다.
3D8-OVA 융합단백질의 RNA 가수분해활성 분석에 있어서, HeLa 세포에서 추출한 리보좀 RNA (1 μg)와 단백질 (0.5 μM)을 섞은 후, TBS 완충용액에서 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응혼합물을 아가로스 겔 (0.8%)에서 전기영동한 후, 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide)로 염색하였다. RNase A (1 U/ New England Biolabs)가 가수분해반응에 대한 양성 대조로, HW6 scFv 단백질이 음성대조로 사용되었다.
3D8-OVA 융합단백질의 세포내 침투능 분석을 위하여 공촛점 현미경법을 이용하였다. 세포에 단백질 (10 μM)을 처리한 후 37℃에서 6시간 동안 배양하였다. 세포를 PBS-2% FCS로 세 차례 세척한 후, 상온에서 10분 동안 2% 파라포름알데히드로 고정화하였고, Perm-buffer (1 % BSA, 0.1 % saponine, 0.1 % sodium azide/PBS)로 상온에서 10분 동안 처리하여 세포막이 비특이적 투과성을 갖도록 하였다 (permeabilization). Perm-buffer를 처리한 세포에 토끼 IgG (1 μg/ml) 및 TRITC-표지된 항-토끼 IgG 이차 항체를 상온에서 1시간씩 연속적으로 처리함으로써, 세포내로 침투해 들어온 단백질을 검출하였다. HW6을 음성대조로 사용하였다.
도 2는 3D8 scFv와 3D8 scFv-OVAs의 생화학적 활성을 비교한 결과이다. 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질은 3D8 scFv 단백질만큼 DNA에 결합하고, DNA를 가수분해하는 능력이 있음을 확인하였다. 도 2c에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질은, 3D8 scFv 단백질만큼 RNA를 가수분해하는 능력이 있음을 확인하였다. 도 2d에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질은, 3D8 scFv 단백질만큼 세포질 내로 이동할 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 항원제시세포에서의 3D8-OVA 융합단백질의 교차항원제시 분석
DC2.4 세포(1×105 세포/웰)를 37℃에서 특정시간 동안 단백질 항원이 펄싱된 96-웰 플레이트에서 배양한 다음, 즉시 37℃에서 24시간 동안 CD8OVA1.3 T 하이브리도마 세포 (1×105 세포/웰)와 함께 배양하였다. CD8OVA1.3 T 세포의 반응은 ELISA 키트 (R&D systems)의 상청액에서 인터류킨-2 (IL-2) 레벨의 측정에 의해 결정되었다. 다양한 약품을 사용하는 항원제시 분석 실험에서는, DC2.4 세포막을 고정한 후, CD8OVA1.3 T 하이브리도마 세포 (1×105 세포/웰)와 함께 배양하였다. 즉 DC2.4 (1×105 세포/웰)를 각 약품과 함께 1시간 (사용된 모든 약품에 적용) 또는 30분 (MG-132에 적용) 동안 미리 배양한 후, 37℃에서 6시간 동안 단백질 항원 (1-10 μM) 또는 OVA257-264 펩타이드 (1 μM)로 펄싱하였다. 항원-펄싱된 DC2.4 세포를 PBS-2% FCS로 세 차례 세척하고 1% 파라포름알데히드로 고정하였다. 고정된 DC2.4 세포를 CD8OVA1.3 T 세포 (1×105 세포/웰)와 섞어서 37℃, 12~48 시간 동안 함께 배양한 후, 상기 상청액에서 IL-2 레벨을 측정하였다.
본 실시예 3에서 사용된 약품의 농도는 다음과 같다: 폴리믹신 B (20 ㎍/㎖), 브레펠딘 A (5 ㎍/㎖), 클로로퀸 (100 μM), 프리마퀸 (50 μM), 사이클로헥시마이드 (5 ㎍/㎖), 및 헤파린 (50IU/㎖)[Sigma, St. Louis, MO]. MG-132 (20 μM), 류펩틴 (50 ㎍/㎖), 및 펩스타틴 (50 ㎍/㎖)[Calbiochem].
공촛점 현미경을 이용한 H-2Kb-OVA257-264 복합체를 탐지하기 위한 실험에서, 24-웰 플레이트의 커버글라스 상에서 배양한 세포 (5×104 세포/웰)를 37℃, 6시간 동안 3D8-OVA 단백질로 펄싱시켰다. 세포를 PBS-2% FCS로 세 차례 세척한 후, 상온에서 10분 동안 2% 파라포름알데히드로 고정화하였다. 그 후, 세포를 비오틴-항- (H-2Kb-OVA257-264) 항체와 FITC-스트렙타아비딘과 함께 각각 4℃, 1시간씩 반응시켰다. 세 차레의 세포 세척 후, 핵은 상온에서 10분 동안 Hoechst 33342로 염색하였다. 커버스립 위의 세포를 Vectashield anti-fade mounting 용액 (Vector Labs)으로 처리한 후, Zeiss LSM 510 레이저 공촛점 현미경으로 관찰하였으며, Carl Zeiss LSM 이미지 소프트웨어로 분석하였다. H-2Kb-OVA257-264 복합체를 탐지하기 위한 유세포 분석 실험에서는, 6-웰 플레이트에서 1×106 세포/웰의 농도에서 성장한 세포를 37℃에서 6시간 동안 단백질로 펄싱하였다. Trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 수확한 후, 상기 언급한 공촛점 현미경에서와 같은 과정으로 세포를 처리하였다. 유세포 분석은 FACSCaliburTM (Bscton Dickinson, CA)으로 수행하였다.
공촛점 현미경을 이용한 단백질의 위치를 알아내기 위한 pulse-chase 분석에서, Rhodamine Red-X protein labeling kit (Invitrogen)를 사용하여 3D8-OVA250-264 단백질을 rhodamine으로 표지하였다. DC2.4 세포를 4℃, DMEM에서 2시간 동안 Rhodamine-labeled-3D8-OVA250-264 (3 μM)로 펄싱하였고, PBS로 두 차례 세척한 후, 37℃에서 30분, 4시간, 또는 6시간 동안 배양하였다. 세포를 세척, 고정, 및 상온에서 10분 동안 Perm-buffer (1 % BSA, 0.1 % saponine, 0.1 % sodium azide/PBS)로 permeabilization한 후, FITC-anti-calnexin 항체와 반응시켰다. 한편 리소좀 염색의 경우, 4℃, DMEM에서 2시간 동안 Rhodamine Red-labeled-3D8-OVA250-264 (3 μM)로 펄싱된 DC2.4 세포를 상온에서 30 분간 동안 0.5 μM lysotracker-green과 함께 배양한 후, 세포를 세척, 고정하고 공촛점 현미경으로 관찰하였다.
도 3 내지 도 5는 항원제시세포에서 MHC class I-제한적인 외인성 3D8-OVA 단백질의 교차항원제시를 나타낸 결과이다.
도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질을 항원제시세포에 처리했을 때, 단백질 농도 및 처리시간에 따라 교차항원제시가 증가함을 IL-2 발현으로 확인하였다. 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질을 항원제시세포에 처리한 후, 세포표면의 MHC class I 분자와 T 세포 에피토프의 복합체가 형성됨을, H-2Kb-OVA257-264 복합체 특이 항체를 이용한 공촛점 현미경법으로 확인하였다. 도 5는 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질에 의한 교차항원제시 반응이, 세균유래 불순물인 당지질 (lipopolysaccharide)을 불활성화시키는 폴리믹신 B에 의해 증가되지 않음을 보여주는 실험결과로서, 이는 교차항원제시 반응이 정제한 단백질에 오염된 당지질의 영향이 아닌, 융합단백질 고유의 특성에 의한 것임을 보여주는 결과이다.
도 6 내지 도 8은 canonical MHC class I 제시 경로를 통한 3D8-OVA250-264 단백질의 교차항원제시를 나타낸 결과이다.
도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질의 교차항원제시 경로는 프로테아좀 (proteasome) 의존성 경로임을 확인하였다. 도 7a 내지 도 7c에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질의 교차항원제시 경로는 클로로퀸 (chloroquine, CQ), 류펩틴 (leupeptin), 및 펩스타틴 A (pepstatin A)에 영향을 받지 않음을 확인하였다. 도 8a 내지 도8c에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질의 교차항원제시 경로는 프리마퀸 (primaquine)에 영향을 받지 않으나, 브레펠딘 A (brefelin A) 및 사이클로헥사미드 (cycloheximide)에 영향 받음을 확인하였다.
도 9는 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질이 세포내 소포체 (endoplasmic reticulum;ER) 성분 (calnexin) 마커와 같은 구획에서 관찰되지만, 말기 엔도솜/라이소좀 마커와는 같은 구획에 위치하지 않음을 보여주는 결과이다.
도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질의 세포내 유입경로는 소포체 (endoplasmic reticulum) 성분을 함유한 초기 엔도솜 경로를 통하며, 리소좀 (lysosome) 경로와는 관계가 없음을 확인하였다.
실시예 4. 3D8-OVA 융합단백질-특이 CTL 활성
C57BL/6 마우스 (H-2d)의 등에 25 ㎍의 단백질 (3D8 scFv, 3D8-OVA250-264, HW6-OVA250-264, 및 전체 OVA 단백질)을 1일 및 7일째 모두 두 차례 피하 주사하였다. 15일째에 면역된 마우스로부터 분리한 지라로부터 세포를 수확한 후, 지라세포를 미토마이신 C가 처리된 (50 ㎍/㎖ 농도로, 37℃, 1시간 처리) H-2d 표적세포 (OVA를 발현하지 않는 B7 또는 OVA를 발현하는 MO5 세포)와 함께 5일간 배양하였다. 즉, T75-플라스크에서 1:100의 비율로 미토마이신 C-처리된 표적 세포 (H-2d)로 지라세포를 5일 동안 자극하였다 (1×108 지라세포 및 1×106 MO5 표적세포/20㎖). B16은 음성 표적 대조군으로 사용하였다. 6일 째, 지라세포 유래 CTL 활성을 51Cr 방출 실험법으로 분석하였다. 표적 종양 세포 (MO5 또는 B16)를 37℃, 45분 동안 배양배지에서 100 μ CiNa2 51CrO4 와 함께 배양함으로써 51Cr로 표지하였다. 세척 후, 2×104의 51Cr-표지된 표적 세포에 지라세포를 10, 50, 또는 100배 비율로 섞고 37℃, 4시간 동안 200 ㎕ 배양배지에서 배양하였다. 세포를 5분 동안 원심분리 (400 ｇ)하고, 상청액 100 ㎕으로 부터 방사능을 측정하였다. 지라세포를 넣지 않았을 때의 51Cr의 자발적 방출 및 1% Triton X-100 처리 시의 최대 51Cr 방출량도 측정하였다. 표적 세포의 용해 퍼센트는 하기 식으로 계산되었다:
% 용해=(테스트 샘플의 cpm-지라세포 방출의 cpm)/(최대 방출의 cpm-자발적 방출의 cpm)
도 10은 3D8-OVA250-264의 투여에 의한 OVA-특이 CTL이 활성화됨을 생체외 실험으로 보여준 결과이다.
도 10에 나타난 바와 같이, 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질을 마우스에 투여했을 때, T 세포 에피토프에 특이적으로 MO5 세포 독성 T 세포를 활성화시킨다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 3D8-OVA250-264가 OVA-특이 CTL을 생성시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 5. 3D8-OVA 융합단백질을 이용한 종양 치료 효과
그룹당 다섯 마리의 C57BL/6 마우스의 등에 5×104 의 MO 세포 또는 B16 세포를 피하 주사하였다. 평균 종양 크기가 40~50 ㎣에 다다랐을 때 (10~12일째), 그룹당 다섯 마리의 마우스의 목덜미에 하루 간격 (B16 세포는 10, 11, 및 12일째에, MO5 세포는 12, 13, 및 14일째에)으로 세 차례씩 단백질 50 ㎍을 주사하였다. 이후 종양의 가장 긴 직경 및 가장 짧은 직경을 측정함으로써 종양 성장을 기록하였다. 종양 부피는 하기 식으로 계산되었다:
(가장 긴 직경×가장 짧은 직경)3/2×π/6
도 11a 및 도 11b는 3D8 단백질 자체로도, B16 (OVA를 발현하지 않음) 및 MO5 (OVA를 발현함) 암세포에 대해 증식억제 효과를 같은 정도 나타내지만, 3D8에 OVA 펩티드가 결합된 융합단백질 (3D8-OVA)은 MO5에 더욱 강한 암 증식억제효과를 나타냄을 보여주는 결과이다.
도 11는 본 발명의 3D8 scFv 말단부위에 T 세포 에피토프를 연결시킨 융합단백질을, 종양세포가 자란 마우스에 투여했을 때, T 세포 에피토프를 세포표면에 표현하는 종양세포에만 특이적으로 종양세포 증식이 억제되며, 3D8 scFv 단독 투여시 보다, 더 높은 항-종양 활성이 나타남을 보여준다.
이러한 결과로부터 3D8 scFv는 고유의 세포독성반응을 통한 치료적인 항-종양효과뿐만 아니라 CTL-에피토프가 3D8 scFv에 컨쥬게이트 되었을 때 에피토프-특이 CTL반응을 나타냄으로써 이러한 항-종양 효과를 향상시킬 수 있음을 알 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> 3D8 scFv-T cell epitope fusion protein, and vaccine composition comprising the same <130> P11-09053 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 249 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D8 scFv <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ala Tyr Lys Arg Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Leu Val Met Ser Gln Ser Pro 130 135 140 Ser Ser Leu Ala Val Ser Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys 145 150 155 160 Ser Ser Gln Ser Leu Phe Asn Ser Arg Thr Arg Lys Asn Tyr Leu Ala 165 170 175 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp 180 185 190 Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly 195 200 205 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp 210 215 220 Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Tyr His Met Tyr Thr Phe 225 230 235 240 Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 245 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA257-264 peptide <400> 2 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OVA250-264 peptide <400> 3 Ser Gly Leu Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 10 15

Claims (6)

  1. 3D8 scFv의 단백질전달도메인 (protein transduction domain, PTD)과 이의 아미노산 말단에 연결된 T 세포 에피토프를 포함하는 융합단백질.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 3D8 scFv의 단백질전달도메인은 서열번호 1에 기재된 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 T 세포 에피토프는 OVA (ovalbumin) 펩타이드의 전체 또는 일부분인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 T 세포 에피토프는 서열번호 2 또는 서열번호 3에 기재된 OVA (ovalbumin) 펩타이드의 일부분인 것을 특징으로 하는 융합단백질.
  5. 제 1항의 융합단백질을 유효성분으로 하는 백신 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 백신 조성물은 세포독성 T 세포의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
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