CN116297908A - 吲哚布芬异构体杂质的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种吲哚布芬异构体杂质的分析方法，用于检测吲哚布芬药品中的异构体杂质，所述分析方法为：采用高效液相色谱法，使用以混合有机硅胶基质为填充剂的色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，将供试品溶液注入高效液相色谱仪进行梯度洗脱。本发明首次提出对吲哚布芬的异构体杂质进行检测分析，方法专属性强，灵敏度高，杂质相邻峰分离度好，有助于完善吲哚布芬的质量控制标准，对提高吲哚布芬原料药的质量以及用药安全性具有重要意义；并且本发明的方法还能对吲哚布芬原料药中的其他多种有关物质进行检测。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，特别涉及一种吲哚布芬异构体杂质的分析方法。
背景技术
吲哚布芬，结构式如下式I所示，是一种异吲哚啉基苯基丁酸衍生物，属于非甾体类抗炎药，化学名为2-[4-(1-氧代-2-异吲哚啉基)苯基]丁酸，是意大利Farmfalia CarloErba公司研制并于1984年8月在意大利首先上市的抗血栓药物，其通过对血小板凝集的抑制可以用于缓解血液的高凝状态，可以缓解由于血小板的过度激活引起的血液凝结等症状，预防血栓的形成，防治血管阻塞。
现有技术中使用较多的吲哚布芬的合成工艺为：采用2-（4-硝基苯基）丁酸（SM1）为合成的起始原料，氢化还原产生还原产物2-（4-氨基苯基）丁酸（中间体1），这一步中，可能因最终残留于原料药中形成杂质2-（4-硝基苯基）丁酸、2-（4-氨基苯基）丁酸、2-（3-氨基苯基）丁酸；中间体1进一步与邻苯二甲酸酐（SM2）进行环化反应生成2-[4-(1,3-二氧代-2-异吲哚啉基)苯基]-丁酸（中间体2），中间体2进一步还原得到产物吲哚布芬。而第一步中的杂质也可能会参与后面的反应，产生新的杂质，如2-（3-氨基苯基）丁酸参与反应后最终会生成2-[3-(1-氧代-2-异吲哚啉基)苯基]丁酸，其结构式如下式II所示：
从结构上分析可知，式II所示化合物为吲哚布芬的同分异构体，即为异构体杂质。
发明专利CN114594168A和CN114624339A均公开了一种吲哚布芬杂质的检测方法，其中检测的杂质如下表，没有对吲哚布芬的异构体杂质进行检测。
表1：工艺杂质列表
发明内容
本发明的目的在于提供一种灵敏度高、专属性好的吲哚布芬异构体杂质的分析方法，用于对吲哚布芬原料药中的异构体杂质进行检测和限度控制，以保证药品的安全性。
根据本发明的一个方面，提供一种吲哚布芬异构体杂质的分析方法，所述吲哚布芬异构体杂质为：
所述分析方法为：采用高效液相色谱法，使用以混合有机硅胶基质为填充剂的色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，将供试品溶液注入高效液相色谱仪进行梯度洗脱。
进一步地，所述流动相A为磷酸二氢钾溶液，pH值为2.4~2.8。
进一步地，所述流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液，pH值为2.6。
进一步地，所述梯度洗脱的程序为：
| 时间/min | 流动相A /% | 流动相B /% |
| 0 | 80 | 20 |
| 12 | 62 | 38 |
| 28 | 62 | 38 |
| 45 | 26 | 74 |
| 45.1 | 80 | 20 |
| 50 | 80 | 20 |
。
进一步地，所述供试品溶液的配制方法为：精密称取吲哚布芬，用甲醇溶解并稀释，制成含吲哚布芬0.5mg/mL的溶液。
进一步地，液相色谱的分析条件包括以下（i）至（v）中的一项或者多项：
（i）色谱柱为YMC-Triart C8，
（ii）柱温为25℃~35℃，
（iii）流速为0.8~1.2ml/min，
（iv）检测波长为228nm，
（v）进样量5~20μl。
进一步地，上述分析方法还可以用于检测以下杂质：
本发明的有益效果：
本发明首次提出对吲哚布芬的异构体杂质进行检测分析，方法专属性强，灵敏度高，杂质相邻峰分离度好，有助于完善吲哚布芬的质量控制标准，对提高吲哚布芬原料药的质量以及用药安全性具有重要意义；并且本发明的方法还能对吲哚布芬原料药中的其他多种有关物质进行检测。
附图说明
图1为实施例1混合溶液的色谱图。
图2为实施例1中供试品溶液的色谱图。
图3为实施例2中混合溶液的色谱图。
图4为实施例3中混合溶液的色谱图。
图5为对比例1中混合溶液的色谱图。
图6为对比例2中混合溶液的色谱图。
具体实施方式
本发明的吲哚布芬异构体杂质的分析方法，检测的吲哚布芬异构体杂质为：
本发明的分析方法为：采用高效液相色谱法，检测器采用紫外检测器或二极管阵列检测器，使用以混合有机硅胶基质为填充剂的色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，将供试品溶液注入高效液相色谱仪进行梯度洗脱。
其中，流动相A优选为磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH值至2.4~2.8。更优选地，流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调pH值至2.6。
其中，梯度洗脱的程序为：
| 时间/min | 流动相A /% | 流动相B /% |
| 0 | 80 | 20 |
| 12 | 62 | 38 |
| 28 | 62 | 38 |
| 45 | 26 | 74 |
| 45.1 | 80 | 20 |
| 50 | 80 | 20 |
。
本发明的分析方法中，供试品溶液的配制方法为：精密称取吲哚布芬，用甲醇溶解并稀释，制成含吲哚布芬0.5mg/mL的溶液。
作为优选的实施方案，液相色谱的分析条件包括以下（i）至（v）中的一项或者多项：
（i）色谱柱为YMC-Triart C8，
（ii）柱温为25℃~35℃，
（iii）流速为0.8~1.2ml/min，
（iv）检测波长为228nm，
（v）进样量5~20μl。
本发明的分析方法，除了可以检测吲哚布芬的上述同分异构体杂质，还可以用于检测以下杂质：
对本发明的方法参照中国药典2020年版9101分析方法验证指导原则进行方法学验证，验证的色谱条件为：色谱柱：YMC-Triart C8，4.6mm×250mm，3μm；检测波长：228nm；柱温：30℃；流速：1.0ml/min；进样量：10μl；流动相A：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH值至2.6）；流动相B：乙腈；稀释剂：甲醇；验证结果如下。
专属性
配制空白溶液（稀释剂）：甲醇。
配制各杂质贮备液（单个），单个杂质贮备液中该杂质的浓度为0.5mg/ml，用甲醇溶解并稀释。
各杂质定位溶液（单个）：精密量取各杂质贮备液适量，用甲醇稀释为5μg/ml。
供试品溶液：精密称取吲哚布芬适量，用甲醇溶解并稀释制成含吲哚布芬0.5mg/ml的溶液。
对照溶液：精密量取供试品溶液适量，用甲醇稀释制成吲哚布芬浓度为1μg/ml的溶液。
对照品溶液：精密称取吲哚布芬对照品适量，用甲醇溶解并稀释制成对照品浓度0.5mg/ml的溶液。
混合溶液：精密称取吲哚布芬适量，置100ml量瓶中，加适量甲醇溶解，取各杂质贮备液1ml，置同一100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。混合溶液含吲哚布芬0.5mg/ml、各杂质约5μg/ml。
分别取空白溶液、各杂质定位溶液、对照品溶液、供试品溶液、对照溶液、混合溶液进样分析，记录色谱图，结果见下表。
表1专属性结果表
由专属性结果表可知，空白溶液无干扰，混合溶液中吲哚布芬峰与相邻峰、各杂质峰之间的分离度均大于1.5，符合要求。
进行检测限和定量限测定，结果如下表所示。
表2检测限与定量限
溶液稳定性
室温下0h、2h、4h、6h、8h、12h、24h或25h进样，对照溶液峰面积的RSD为1.90%；供试品溶液中，杂质B含量的RSD为3.12%、杂质E含量的RSD为13.10%、其他最大未知单杂含量的RSD为6.44%、总杂含量的RSD为3.77%。混合溶液中各杂质峰面积RSD均小于5%，主峰峰面积的RSD小于2%；故供试品溶液、对照溶液24h内均稳定；混合溶液25h内均稳定。
准确度：在限度浓度的50%~150%，
杂质B的回收率在98.34%～104.46%之间，平均回收率为100.92%，RSD为1.82%；
杂质D的回收率在96.05%～101.49%之间，平均回收率为98.66%，RSD为1.82%；
杂质E的回收率在96.75%～100.88%之间，平均回收率为98.48%，RSD为1.47%；
杂质F的回收率在94.47%～100.83%之间，平均回收率为96.65%，RSD为2.25%；
杂质H的回收率在97.58%～103.46%之间，平均回收率为101.31%，RSD为1.96%；
异构体杂质的回收率在94.12%～100.47%之间，平均回收率为98.25%，RSD为1.92%；
杂质中间体2的回收率在105.17%～107.39%之间，平均回收率为106.29%，RSD为0.69%。
耐用性
表3耐用性各色谱条件表
实验结果表明，改变流速（±0.2ml/min）、柱温（±5℃）及使用不同色谱柱进行实验，各杂质检出变化不大，本发明的检测方法耐用性较好。
本发明的检测方法专属性良好，灵敏度高，供试品溶液和对照品溶液的稳定性均良好，方法准确高，重复性好。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
本发明所用的试剂和原辅料均市售可得。
实施例1
取自制吲哚布芬原料药进行检测。
各杂质贮备液（单个）：精密称取杂质B 10.34mg、杂质D 10.59mg、杂质E 10.41mg、杂质F 10.46mg、杂质H 10.24mg、异构体杂质10.23mg、中间体2 10.27mg，分别置20ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。（0.5mg/ml）
混合溶液：精密称取吲哚布芬50.32mg，置100ml量瓶中，加适量甲醇溶解，取各杂质贮备液1ml，置同一100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
供试品溶液：精密称取自制的吲哚布芬原料药25.26mg，精密称定，置50ml的量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪（紫外检测器或二极管阵列检测器），
色谱柱：YMC-Triart C8，4.6mm×250mm，3μm，
检测波长：228nm ，柱温：30℃，流速：1.0ml/min， 进样量：10μl，
流动相A：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH值至2.6），
流动相B：乙腈，
稀释剂：甲醇，
洗脱梯度如下：
| 时间（分钟） | 流动相A（%） | 流动相B（%） |
| 0 | 80 | 20 |
| 12 | 62 | 38 |
| 28 | 62 | 38 |
| 45 | 26 | 74 |
| 45.1 | 80 | 20 |
| 50 | 80 | 20 |
取混合溶液、供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，图1为混合溶液的色谱图，图2为供试品溶液的色谱图。
实施例2
与实施例1的区别仅在于：流动相A为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH值至2.4）。
取实施例1中的混合溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图3所示。
实施例3
与实施例1的区别仅在于：流动相A为0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH值至2.8）。
取实施例1中的混合溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，如图4所示。
对比例1
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱型号：（ZORBAX SB-C184.6mm×250mm，5μm），以甲醇-水-三乙胺（65∶35∶0.5）（用磷酸调节pH值至3.0）为流动相，流速1.0ml/min，检测波长为228nm，进样量：10μl，等度洗脱。
取实施例1中的混合溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图如图5所示。由图5可知：采用该方法无法分离吲哚布芬的异构体杂质，达不到分离要求，并且检测其他杂质时所需时间较长。
对比例2
色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱型号：ZORBAX SB-C184.6mm×250mm，5μm，
检测波长：228nm，柱温：30℃ ，流速：1.0ml/min，进样量：10μl，
流动相A：0.01mol/L磷酸二氢钾溶液（用磷酸调pH值至2.6），
流动相B：乙腈，
稀释剂：甲醇，
按实施例1的梯度洗脱程序进行梯度洗脱。
取实施例1中的混合溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，色谱图如图6所示。由图6可知：采用该方法无法分离吲哚布芬的异构体杂质，达不到分离要求。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
Claims (7)
1.一种吲哚布芬异构体杂质的分析方法，其特征在于，所述吲哚布芬异构体杂质为：
所述分析方法为：采用高效液相色谱法，使用以混合有机硅胶基质为填充剂的色谱柱，以磷酸盐缓冲液为流动相A，以乙腈为流动相B，将供试品溶液注入高效液相色谱仪进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的吲哚布芬异构体杂质的分析方法，其特征在于，
所述流动相A为磷酸二氢钾溶液，pH值为2.4~2.8。
3.根据权利要求2所述的吲哚布芬异构体杂质的分析方法，其特征在于，
所述流动相A为0.01mol/L的磷酸二氢钾溶液，pH值为2.6。
4.根据权利要求1所述的吲哚布芬异构体杂质的分析方法，其特征在于，
所述梯度洗脱的程序为：
。
5.根据权利要求1所述的吲哚布芬异构体杂质的分析方法，其特征在于，
所述供试品溶液的配制方法为：精密称取吲哚布芬，用甲醇溶解并稀释，制成含吲哚布芬0.5mg/mL的溶液。
6.根据权利要求1~5任一项所述的吲哚布芬异构体杂质的分析方法，其特征在于，
液相色谱的分析条件包括以下（i）至（v）中的一项或者多项：
（i）色谱柱为YMC-Triart C8，
（ii）柱温为25℃~35℃，
（iii）流速为0.8~1.2ml/min，
（iv）检测波长为228nm，
（v）进样量5~20μl。
7.根据权利要求1~5任一项所述的吲哚布芬异构体杂质的分析方法，其特征在于，该分析方法还适用于检测以下杂质：
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| CN101270072A (zh) * | 2008-02-25 | 2008-09-24 | 北京阜康仁生物制药科技有限公司 | 右旋吲哚布芬及其用于制备药物的用途 |
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|---|---|
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