CN116287186A - 检测脑组织中tRF表达引物在制备甲基苯丙胺成瘾辅助诊断试剂盒的应用 - Google Patents

检测脑组织中tRF表达引物在制备甲基苯丙胺成瘾辅助诊断试剂盒的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测组织中tRF表达引物在制备甲基苯丙胺成瘾辅助诊断试剂盒的应用，其特征在于：该tRF‑1_32‑Gly‑GCC‑2‑M2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述tRF‑1_32‑Gly‑GCC‑2‑M2在甲基苯丙胺成瘾大鼠组织中的特异性表达下调：所述引物为：F1：5’GATCGCATGGGTGGTTCAGT 3'；R1：5’CTCTTCCGATCTAGGCGAGAAT 3’，与现有技术相比，本发明的优点在于甲基苯丙胺成瘾大鼠组织中的特异性表达下调tRF‑1_32‑Gly‑GCC‑2‑M2可作为甲基苯丙胺成瘾诊断的新型分子标记物。

Description

检测脑组织中tRF表达引物在制备甲基苯丙胺成瘾辅助诊断 试剂盒的应用
技术领域
本发明涉及一种甲基苯丙胺成瘾大鼠脑组织中tRNA衍生片段的检测方法，尤其涉及一种荧光染料法实时定量逆转录-聚合酶链式反应检测甲基苯丙胺成瘾大鼠脑组织中tsRNA的方法及其应用。
背景技术
近几年，甲基苯丙胺是我国滥用人数最多的毒品。吸毒造成药物依赖者劳动能力下降或者丧失，家庭经济遭受损失，诱发犯罪，而且增加HIV的传播机会，给社会带来严重的不稳定因素，阻碍社会进步和经济发展。至今，关于海洛因依赖治疗方法已比较成熟，主要有美沙酮和丁丙诺啡维持治疗等，均得到很好的广泛应用(Schuckit，2016；Townsend etal，2021)。而治疗Meth依赖的临床试验前景一直不容乐观，迄今尚无令人信服的理想治疗方案(
Figure SMS_1
et al，2017；Siefried et al，2020)。生物标志物研发可能是实现药物成瘾诊断、治疗以及防复吸的重要手段之一，而目前尤其甲基苯丙胺的生物标志物的研究仍比较匮乏。能够用于指导临床的成熟生物标志物较少，寻找新的稳定可靠的甲基苯丙胺成瘾相关的生物标志物仍然是药物成瘾研究中亟待解决的问题。因此对甲基苯丙胺的生物标志物研究，不仅可发现相关疾病的分子诊断和治疗的标志物，并有助于加深理解甲基苯丙胺所致的复杂性精神疾病的发病机制，甚至有潜力成为上述疾病的新治疗靶点。
随着分子生物学技术的快速发展，最近的研究已揭示，转运RNA(tRNA)来源的小RNA(tsRNA)在转录或转录后可调控基因表达，并在许多人类疾病的发生发展过程有着重要功能而使其成为生物标志物研究的新热点。tRNA可以被切割裂解成长度为18-40个核苷酸的异质ncRNA群，称为tRNA来源的小RNA(tsRNA)。基于它们的长度和切割位点的数量，tsRNA可分为2种主要类型：tRNA衍生的片段(tRF)和tRNA衍生的应激诱导的RNA(tiRNA)。基于其有多种核苷酸修饰而结构比较稳定。这些RNA最初被认为是tRNA随机切割的副产物。越来越多的证据表明tsRNA在各种疾病(包括精神神经疾病)病理过程中的广泛参与，为人们尝试开发基于tsRNA的生物标志物成为可能(Shenet al，2018)。它们既是细胞缺氧、中毒、氧化等应激反应的信号分子，又是基因表达的重要调节因子，这些特点使得tsRNA在疾病诊断与治疗方法的开发应用上具有广阔的前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术现状而提供一种检测组织中表达tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的引物在制备甲基苯丙胺成瘾辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：该检测组织中tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2表达的引物在制备甲基苯丙胺成瘾辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于：该tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2在甲基苯丙胺成瘾大鼠脑组织中的特异性表达下调：
所述引物为：
F1：5’GATCGCATGGGTGGTTCAGT 3'；
R1：5’CTCTTCCGATCTAGGCGAGAAT 3’。
进一步地，所述试剂盒还包括有外参基因U6的特异性扩增上下游引物：
F2：5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT 3’
R2：5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT 3’。
其中，该用于甲基苯丙胺成瘾检测的tsRNA分子标记物为tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2，对应的tRNA分别为tRNA-Gly-GCC-2-1和tRNA-Gly-GCC-3-1，即这两个tRNA都能产生该tsRNA，该tsRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，为GCATGGGTGGTTCAGTGGTAGAATTCTCGCCT。
本发明还提供一种检测tsRNA分子标记物的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤：
(1)建立甲基苯丙胺自身给药模型大鼠，麻醉处理，取其伏隔核脑区组织，提取组织中的总RNA；
(2)将总RNA进行前处理并特异性逆转录成cDNA；
(3)将cDNA进行荧光染料法qRT-PCR检测，反应结束后检测样品中tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2和外参基因U6的Cq值；
(4)根据Cq值，通过外参基因U6的表达水平来均一化tsRNA的水平，并使用ΔCq公式来计算tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的PCR相对定量值，式中ΔCq＝Cq(tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2)-Cq(U6)；
当样本中的tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2生物标志物的PCR相对定量值ΔCq小于或等于2.572时，则认为是非甲基苯丙胺成瘾样本；大于2.572时，则认为是甲基苯丙胺成瘾样本。
其中，上述步骤(1)中提取甲基苯丙胺自身给药模型大鼠脑组织中总RNA的过程如下：
步骤a、收集脑组织样本：切取40mg左右正常大鼠脑NAc核团组织，浸泡在2.5mL的无核酸酶的离心管中，若不立即使用则应存放在-80℃超低温冰箱中保存；
步骤b、裂解组织：把步骤a中的组织从-80℃冰箱中取出置于冰上解冻，在2.5ml离心管中加入1mL Trizol试剂，用电动匀浆器将脑组织充分研磨成匀浆液，15～30℃孵育5分钟，使核酸蛋白复合体完全解离；
步骤c、三氯甲烷提取：加入200μL三氯甲烷，手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟；12000rpm，4℃离心15分钟，离心后混合液将分为下层的红色酚氯仿相，中间层和上层的无色的水相；RNA全部被分配于水相中；水相的体积大约是匀浆时加入的TRIReagent试剂的60％；
步骤d、异丙醇沉淀：将水相转移到新离心管中，加入与步骤c中上层水相等体积的异丙醇，摇晃混匀，混匀后15到30℃孵育10分钟后，12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，得RNA沉淀；
步骤e、乙醇洗涤并沉淀：弃上清，并加入质量分数为75％的乙醇1mL清洗沉淀，4℃下，7500rpm离心5分钟，弃上清，室温放置10分钟晾干后，加入15μL无核酸酶的水来溶解沉淀，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟，即为组织中的总RNA提取液，获得的RNA溶液保存于-70℃；
步骤f、检测RNA浓度：使用NanoDrop2000检测样本RNA的浓度和OD值，OD260/280值介于1.8-2.1之间，可进行后续试验；
步骤g、3’末端去乙酰化处理：按照表1配置去乙酰化反应液，涡旋混合后，37℃孵育40分钟，随后依次加入19μL Deacylation Stop Buffer，涡旋混合，室温孵育5分钟，终止去乙酰化反应；
步骤h、去除3’-cP与添加5’-P：将步骤f的反应液置于冰上，依次加入表2中的试剂，涡旋混合后37℃孵育40分钟，70℃孵育5分钟以终止反应；随后重新抽提RNA；
步骤i、去甲基化处理：按照表3配置去甲基化反应液，随后在37℃水浴锅中孵育2小时以进行去甲基化反应，然后加入40μL Nuclease-free Water与10μLDemethylationStop Buffer(5×)，终止去甲基化反应，随后重新抽提RNA；
步骤j、连接3′接头：在200μL无核酸酶的PCR管中依次加入表4试剂，在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后将PCR管移至冰上，添加表5试剂后在热循环仪中25℃孵育1小时；
步骤k、反转录引物杂交：将步骤j的PCR管中加入Nuclease-free Water2.3μL以及Reverse Transcription Primer0.5μL，组成总体积12.8μL体系；在热循环仪中依次75℃孵育5分钟，37℃孵育15分钟，25℃孵育15分钟；
步骤l、连接5′接头：在20μL无酶水中重悬5’接头，在单独的无核酸酶的200μL PCR管中加入0.6NμL的5’接头，(N为实验所处理的样本数目)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后立即在冰上冷却；向步骤k中的PCR管中依次加入表6反应物，充分混合，热循环仪25℃孵育1小时；
步骤m、将上述步骤l预处理的RNA特异性逆转录：在在无核酸酶的200μL PCR管加入表7逆转录反应物，热循环仪50℃孵育1小时，然后立即在冰上冷却，反应产物可直接用于PCR扩增反应。如果未打算立即进行PCR扩增，热循环仪70℃孵育15分钟以终止RT反应；然后将样本置于-20℃冰箱保存；
而步骤(3)中实时定量PCR反应条件如下：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))；为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10秒；60℃，60秒；95℃，15秒)；并从60℃缓慢加热到95℃；
本发明还提供一种tsRNA分子标记物在制备甲基苯丙胺成瘾辅助诊断试剂盒中的应用。该试剂盒包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、荧光试剂、PCR缓冲液、焦碳酸二乙酯(DEPC)水。
与现有技术相比，本发明的优点在于在甲基苯丙胺成瘾大鼠脑组织中的特异性表达下调的tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2可作为甲基苯丙胺成瘾诊断的新型分子标记物，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行甲基苯丙胺成瘾诊断，通过使用TRIzol、异丙醇等试剂，采用混匀离心等方法，能提取出浓度、纯度较好的RNA，仅需收集40mg左右的甲基苯丙胺自身给药大鼠脑组织即可检测tsRNA，成为甲基苯丙胺成瘾诊断、治疗疗效判断的有效工具，具有良好的临床应用前景，而采取的实时定量PCR仪器是一种常见仪器，SYBR Green荧光染料法并不需要另行设计探针即可同时检测目的tsRNA和外参基因，具有经济、方便等特点，本发明提供的方法，对进一步研究甲基苯丙胺成瘾相关tsRNA的生物学功能具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例一中甲基苯丙胺自身给药大鼠脑组织tsRNA下一代测序结果图；
图2为本发明实施例二中正常大鼠脑组织和甲基苯丙胺成瘾大鼠脑组织中tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2和U6的扩增曲线图；
图3为本发明实施例三中tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2在甲基苯丙胺成瘾组织中显著低表达；
图4为本发明实施例三中tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的ROC曲线。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例一
检测tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2在甲基苯丙胺成瘾大鼠脑组织和正常大鼠脑组织中的表达情况：
测序检测：采用美国Arraystar公司的tsRNA测序试剂采用下一代测序方法检测甲基苯丙胺成瘾大鼠脑组织和正常大鼠脑组织中tsRNA的水平。
结果分析：结果如图1所示，通过分析甲基苯丙胺成瘾大鼠脑组织和正常大鼠脑组织获得表达显著下调的tsRNA衍生片段的分子标记物，tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2在甲基苯丙胺成瘾大鼠脑组织和正常大鼠脑组织差异达2.13倍，如图1箭头所示，提示tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2可能作为甲基苯丙胺成瘾特异的新型生物标记分子。
实施例二
采集正常大鼠脑组织作为正常对照组，按照如下步骤进行tsRNA的检测，包括以下步骤：
步骤a、收集脑组织样本：切取40mg左右正常大鼠脑NAc核团组织，浸泡在2.5mL的无核酸酶的离心管中，若不立即使用则应存放在-80℃超低温冰箱中保存；
步骤b、裂解组织：把步骤a中的组织从-80℃冰箱中取出置于冰上解冻，在2.5ml离心管中加入1mL Trizol试剂，用电动匀浆器将脑组织充分研磨成匀浆液，15～30℃孵育5分钟，使核酸蛋白复合体完全解离；
步骤c、三氯甲烷提取：加入200μL三氯甲烷，手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟；12000rpm，4℃离心15分钟，离心后混合液将分为下层的红色酚氯仿相，中间层和上层的无色的水相；RNA全部被分配于水相中；水相的体积大约是匀浆时加入的TRIReagent试剂的60％；
步骤d、异丙醇沉淀：将水相转移到新离心管中，加入与步骤c中上层水相等体积的异丙醇，摇晃混匀，混匀后15到30℃孵育10分钟后，12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，得RNA沉淀；
步骤e、乙醇洗涤并沉淀：弃上清，并加入质量分数为75％的乙醇1mL清洗沉淀，4℃下，7500rpm离心5分钟，弃上清，室温放置10分钟晾干后，加入15μL无核酸酶的水来溶解沉淀，先加入无RNA酶的水用枪反复吹打几次，然后55到60℃孵育10分钟，即为组织中的总RNA提取液，获得的RNA溶液保存于-70℃；
步骤f、检测RNA浓度：使用NanoDrop2000检测样本RNA的浓度和OD值，OD260/280值介于1.8-2.1之间，可进行后续试验。
步骤g、3’末端去乙酰化处理：按照表1配置去乙酰化反应液，涡旋混合后，37℃孵育40分钟，随后依次加入19μL Deacylation Stop Buffer，涡旋混合，室温孵育5分钟，终止去乙酰化反应；
步骤h、去除3’-cP与添加5’-P：将步骤f的反应液置于冰上，依次加入表2中的试剂，涡旋混合后37℃孵育40分钟，70℃孵育5分钟以终止反应；随后重新抽提RNA；
步骤i、去甲基化处理：按照表3配置去甲基化反应液，随后在37℃水浴锅中孵育2小时以进行去甲基化反应，然后加入40μL Nuclease-free Water与10μLDemethylationStop Buffer(5×)，终止去甲基化反应，随后重新抽提RNA；
步骤j、连接3′接头：在200μL无核酸酶的PCR管中依次加入表4试剂，在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后将PCR管移至冰上，添加表5试剂后在热循环仪中25℃孵育1小时；
步骤k、反转录引物杂交：将步骤j的PCR管中加入Nuclease-free Water2.3μL以及Reverse Transcription Primer0.5μL，组成总体积12.8μL体系；在热循环仪中依次75℃孵育5分钟，37℃孵育15分钟，25℃孵育15分钟；
步骤l、连接5′接头：在20μL无酶水中重悬5’接头，在单独的无核酸酶的200μLPCR管中加入0.6NμL的5’接头，(N为实验所处理的样本数目)在热循环仪中70℃孵育2分钟，然后立即在冰上冷却；向步骤k中的PCR管中依次加入表6反应物，充分混合，热循环仪25℃孵育1小时；
步骤m、将上述步骤l预处理的RNA特异性逆转录：在在无核酸酶的200μL PCR管加入表7逆转录反应物，热循环仪50℃孵育1小时，然后立即在冰上冷却，反应产物可直接用于PCR扩增反应，如果未打算立即进行PCR扩增，热循环仪70℃孵育15分钟以终止RT反应；然后将样本置于-20℃冰箱保存；
步骤n、荧光染料法qRT-PCR检测：将上述步骤m获得的逆转录产物按照表8的配比加入反应体系中，并按照表9的程序设定进行PCR参数；
所用的tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的特异性扩增上下游引物为：
F1:5’GATCGCATGGGTGGTTCAGT 3'；
R1:5’CTCTTCCGATCTAGGCGAGAAT 3’；
所用的外参基因U6的特异性扩增上下游引物为：
F2：5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT 3’；
R2：5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT 3’。
表1.去乙酰化反应液
Figure SMS_2
表2.去除3’-cP与添加5’-P反应液
Figure SMS_3
表3.去甲基化反应液
Figure SMS_4
表4.连接3′接头反应液1
Figure SMS_5
表5.连接3′接头反应液2
Figure SMS_6
表6.连接5′接头反应液
Figure SMS_7
表7.特异性逆转录反应体系
Figure SMS_8
表8.荧光染料法定量PCR反应体系
Figure SMS_9
表9.PCR参数
Figure SMS_10
Figure SMS_11
从图2可以看出，正常大鼠和甲基苯丙胺成瘾大鼠组织中tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2和U6均得到有效扩增，并可以得到组织样本中U6和tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2表达水平的扩增曲线，其中，从U6的扩增曲线可以得到所检测的甲基苯丙胺成瘾大鼠组织和正常大鼠组织标本的Cq值分别为16.51和16.53，tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的扩增曲线可以得到所检测的甲基苯丙胺成瘾大鼠组织和正常大鼠组织标本的Cq值分别为20.19和18.54，可以得出甲基苯丙胺成瘾大鼠组织和正常大鼠组织标本中tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2表达量的对比，与实施例一中的基因测序的结果是一致的。
同时利用同一标本中U6和tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的Cq值，根据计算公式ΔCq＝Cq(tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2)-Cq(U6)计算出该tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的ΔCq值，根据ΔCq值的大小就可以判断该tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的相对表达水平；ΔCq值越小，其对应tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的表达水平越高，而ΔCq值越大，其对应tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的表达水平越低；
从图2可得出正常组织的ΔCq＝2.01；甲基苯丙胺成瘾大鼠组织的ΔCq＝3.69，明显大于正常组织的ΔCq值，说明tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2在甲基苯丙胺成瘾大鼠组织中是低表达的。
实施例三
应用tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2生物标志物进行甲基苯丙胺成瘾检测的方法
1、建立甲基苯丙胺大鼠自身给药模型；
2、甲基苯丙胺成瘾大鼠组织中RNA的提取(提取方法如同实施例二)；
3、特异性逆转录和荧光染料法qRT-PCR检测如同按照实施例二中的“特异性逆转录和荧光染料法qRT-PCR检测”进行操作；
4、以tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2作为甲基苯丙胺成瘾检测的生物标志物，分析18例甲基苯丙胺成瘾大鼠组织和16例正常大鼠组织中tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的表达水平。甲基苯丙胺成瘾大鼠tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的ΔCq明显高于正常组，P<0.0001，证明其tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的表达水平明显低于正常组，如图3所示。tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2作为甲基苯丙胺成瘾标志物的截断值为2.572，当样本中的tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2生物标志物的PCR相对定量值ΔCq小于或等于2.572时，则认为是非甲基苯丙胺成瘾样本；大于2.572时，则认为是甲基苯丙胺成瘾样本。
5、检测18例甲基苯丙胺成瘾大鼠组织和16例正常大鼠组织tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2水平，制作ROC曲线，如图4所示，AUC值为0.9965，P<0.0001。表10为tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2为生物标志物进行甲基苯丙胺成瘾诊断的结果，可得出tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2作为甲基苯丙胺成瘾标记物的灵敏度为94.44％，特异度为100％。
表10.tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2为生物标志物进行甲基苯丙胺成瘾诊断的结果
Figure SMS_12
实施例四检测试剂盒及应用
本实施例中的用于甲基苯丙胺成瘾检测的tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2生物标志物检测试剂盒，除含有常规实时定量PCR试剂之外，还包括外参的检测引物和tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的检测引物。其中，常规实时定量PCR试剂包括Taq酶、dNTP试剂、荧光试剂、PCR缓冲液、DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水(RNase free water)。利用上述检测试剂盒进行检测时，其具体的操作方法可参照实施例二的操作方法进行样本的检测和甲基苯丙胺成瘾的判断。
应用本实施例中的检测试剂盒可以简单、快速、便利地进行tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2生物标志物的检测，以判断甲基苯丙胺成瘾情况，作为甲基苯丙胺成瘾的辅助诊断方法具有重要的价值。

Claims (2)

1.一种检测组织中tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2表达的引物在制备甲基苯丙胺成瘾辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于：该tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述tRF-1_32-Gly-GCC-2-M2在甲基苯丙胺成瘾大鼠组织中的特异性表达下调：
所述引物为：
F1：5’GATCGCATGGGTGGTTCAGT 3'；
R1：5’CTCTTCCGATCTAGGCGAGAAT 3’。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述试剂盒还包括有外参基因U6的特异性扩增上下游引物：
F2：5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT 3’
R2：5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT 3’。
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