CN116284405A - 靶向cd150蛋白的纳米抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种能够特异性识别CD150的纳米抗体或抗原结合片段。该抗体或抗原结合片段选自下列至少之一的重链可变区CDR序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1～3。该抗体免疫源性低，能够特异性的靶向结合CD150，通过阻断CD150与其配体的作用，从而逆转免疫细胞的功能耗竭进而达到杀伤肿瘤细胞的效果。

Description

靶向CD150蛋白的纳米抗体及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种靶向CD150蛋白的纳米抗体及其应用，更具体地，本发明涉及一种抗体或抗原结合片段、重组蛋白、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物、制药用途以及检测CD150的试剂盒。
背景技术
恶性肿瘤作为一种严重威胁人类的生命健康的疾病。目前已有的恶性肿瘤治疗手段，包括手术切除、放疗、化疗、小分子靶向疗法、免疫检查点疗法、细胞及基因疗法等仅能够在部分恶性肿瘤患者中发挥有限的作用，恶性肿瘤仍是困扰人类生命健康的难题。肿瘤病人的治疗中手术切除一般只适用于早期患者，且有恢复难和并发症的风险。更晚期的治疗放疗和化疗有一定的效果但是也存在毒性和耐药性等缺点。免疫疗法中常见免疫检查点疗法，通过抑制免疫检查点去逆转肿瘤逃逸的机制从而达到杀伤肿瘤进行治疗的效果。基于上述原因，开发针对特定靶点的免疫检查点抗体是有必要的。
传统单克隆抗体由2条糖基化重链和2条非糖基化轻链组成，具有分子量大，生产工艺复杂，不易加工改造等局限性。相对于传统的抗体，驼类体内存在一种仅由2条重链组成的抗体，命名为重链抗体，其抗体可变区仅由2个相同的重链可变区组成，该抗体被称为单域抗体。单域抗体蛋白直径小于10纳米，因此又被称为纳米抗体。羊驼单域抗体称为VHH。单域抗体比传统的scFv或Fab具有居多优势，其分子量小、穿透性强、稳定性及可溶性更高，其发挥功能不依赖糖基化修饰等。与传统抗体相比，单域抗体通常具有一个扩展的CDR3，可以形成一个凸出的表面结构来识别抗原表位，因此可以利用其帮助识别传统抗体难以识别的隐藏抗原表位。
CD150是一种单链I型跨膜磷酸腺蛋白，分子量范围为70kDa至95kDa。CD150的核心蛋白的分子量约为42kDa。在细胞质尾部具有两个基于免疫感受器酪氨酸的开关基序(ITSM)。在恶性细胞的表面，CD150可作为麻疹病毒(MV)介导的溶瘤的靶标，并可能作为基于抗体的治疗的靶标。在肿瘤的发展过程中CD150在B细胞上高表达，与CD8T细胞相互作用使得T细胞耗竭限制了对肿瘤的杀伤作用。
因此，本领域亟需开发一种针对CD150的纳米抗体用以克服常规肿瘤药物治疗中存在的副作用大以及继发性耐药弊端。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种抗CD150的纳米抗体，该抗CD150的纳米抗体与CD150具有较高的结合活性，通过阻断CD150与其配体的作用，从而逆转T细胞、B细胞和NK细胞的功能耗竭进而达到杀伤肿瘤细胞的效果。
在本发明的的第一方面，本发明提出了一种抗体或抗原结合片段。根据本发明的实施例，所述抗体含有选自下列至少之一的重链可变区CDR序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1～3。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段可以与CD150结合，阻断CD150与其配体的作用，从而逆转T细胞的功能耗竭进而达到杀伤肿瘤细胞的效果，并且所述抗体或其抗原结合片段特异性高，可以避免继发性耐药问题的发生。
GRAFSDYAVG(SEQ ID NO:1)。
EFVATISWSGFSTY(SEQ ID NO:2)。
ADRNGTSFPYIRRDEYDY(SEQ ID NO:3)。
根据本发明的实施例，上述抗体或抗原结合片段还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列所示或与SEQ ID NO:1、2和3具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段进一步含有重链框架区序列，所述重链框架区序列的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、羊驼源抗体或其突变体的至少之一。
需要说明的是，本申请中的“抗体或其抗原结合片段”还可以具有人源化修饰。
在本文中，术语“人源化修饰”是指能够使得抗体或抗原结合片段的免疫原性降低的氨基酸的改变，包括氨基酸的突变、插入、缺失、化学基团的赘合等等。
示例性地，人源化修饰通常是采用框架移植法及蛋白表面氨基酸人源化的方法完成的。
根据本发明实施例的上述人源化抗体的免疫源性降低，抗体能够特异性的靶向结合CD150，阻断CD150和CD150抗体的结合。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链可变区。
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRAFSDYAVGWFRQAPGREREFVATISWSGFSTYYADSVK GRFTISRDNAEKTVTLQMNSLKPEDTAVYYCAADRNGTSFPYIRRDEYDYWGQGTQVT(SEQ ID NO:4)。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段进一步含有重链恒定区，所述重链恒定区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一。
根据本发明的实施例，所述重链恒定区来自于羊驼源抗体。发明人发现，采用羊驼单域抗体适用性更广、排异性更低。
根据本发明的实施例，所述抗体或抗原结合片段包括单抗或多抗。
根据本发明的实施例，所述单抗包括Fab抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一。
根据本发明的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRAFSDYAVGWFRQAPGREREFVATISWSGFSTYYADSVK GRFTISRDNAEKTVTLQMNSLKPEDTAVYYCAADRNGTSFPYIRRDEYDYWGQGTQVT(SEQ ID NO:5)。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种重组蛋白。根据本发明的实施例，所述重组蛋白包括本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段。本发明实施例的重组蛋白能够靶向结合CD150，且具有较高的CD150结合活性，可用于检测CD150，还用于阻断CD150与其抗体结合，阻断信号转导过程，进而抑制肿瘤增殖。
根据本发明的实施例，上述重组蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述重组蛋白进一步包括选自生物活性蛋白或其片段、生物活性多肽或其片段中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述生物活性蛋白或其片段包括选自蛋白标签、蛋白毒素或其片段、肿瘤坏死因子或其片段、干扰素或其片段、生物反应调节物或其片段和Fc片段中的至少之一。
在本文中，“蛋白标签”通常是指与目标蛋白(抗体或抗原结合片段)一起融合表达的一种多肽或者蛋白，其可用于目标蛋白的表达、检测、失踪或纯化等。包括但不限于His标签(又称His-Tag，序列为HHHHHH)、Flag标签(又称Flag-Tag，序列为DYKDDDDK)、GST标签(又称GST-Tag、谷胱甘肽巯基转移酶标签)、MBP标签(又称MBP-Tag、麦芽糖结合蛋白标签)、SUMO标签和C-Myc标签等。
在本文中，“毒素”通常是指对宿主有毒物质，包括蛋白毒素和非蛋白毒素。其中，蛋白毒素包括但不限于相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素和白喉毒素等。在本发明中，蛋白毒素优选为具有酶活性的蛋白毒素。
在本文中，“肿瘤坏死因子”通常是指能使多种肿瘤发生出血性坏死的物质，包括但不限于TNF-α和TNF-β。
在本文中，“干扰素”通常是指一种具有直接杀伤或抑制病毒的糖蛋白。包括但不限于IFN-α、INF-β和IFN-γ。
在本文中，“生物反应调节物”通常是指一类通过免疫系统直接或间接增强机体的抗肿瘤效应的蛋白物质。包括但不限于淋巴因子、IL-2、IL-6、IL-10和GM-CSF等。
在本文中，“Fc片段”通常是指来自IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM的Fc区，包括CH2、CH3区和任选地铰链区。优选的，IgG、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM来源于鼠源、人源、灵长目源或羊驼源。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种核酸分子。根据本发明的实施例，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段或本发明第二方面所述的重组蛋白。根据本发明实施例的核酸分子所编码前述的抗体或抗原结合片段、重组蛋白。
根据本发明的实施例，所述核酸分子为DNA。
需要说明的是，对于本发明中所提及的核酸分子，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。另外，本申请中的核酸序列包括DNA形式或RNA形式，公开其中一种，意味着另一种也被公开。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带本发明第三方面所述的核酸分子。在将上述核酸分子连接到载体上时，可以将所述核酸分子与载体上的控制元件直接或者间接相连，只要这些控制元件能够控制所述核酸分子的翻译和表达等即可。当然这些控制元件可以直接来自于载体本身，也可以是外源性的，即，并非来自于载体本身。当然，所述核酸分子与控制元件进行可操作地连接即可。本文中“可操作地连接”是指将外源基因连接到载体上，使得载体内的控制元件，例如转录控制序列和翻译控制序列等等，能够发挥其预期的调节外源基因的转录和翻译的功能。常用的载体例如可以为质粒、噬菌体等等。根据本发明的一些具体实施例的表达载体导入合适的受体细胞后，可在调控系统的介导下，有效实现前述的抗体或抗原结合片段、重组蛋白的表达，进而实现抗体或抗原结合片段、重组蛋白的体外大量制备。
根据本发明的实施例，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体。
根据本发明的实施例，所述表达载体为质粒表达载体。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞携带本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的表达载体或表达本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段或本发明第二方面所述的重组蛋白。利用该重组细胞在适合条件下，能够在细胞内有效地表达前述的抗体或抗原结合片段、重组蛋白。
需要说明的是，本申请说明书中所述的“适合条件”，是指适合本发明所述抗体或抗原结合片段、重组蛋白或前述的多特异性抗体表达的条件。本领域技术人员容易理解的是，适合所述抗体或抗原结合片段、重组蛋白表达的条件包括但不限于合适的转化或转染方式、合适的转化或转染条件、健康的宿主细胞状态、合适的宿主细胞密度、适宜的细胞培养环境、适宜的细胞培养时间。“适合条件”不受特别限制，本领域技术人员可根据实验室的具体环境，优化最适的所述抗体或抗原结合片段、重组蛋白表达的条件。
根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过将本发明第四方面所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为真核细胞。
根据本发明的实施例，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段、本发明第二方面所述的重组蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体或本发明第五方面所述的重组细胞。本发明的药物组合物能够结合CD150，阻断CD150与其受体进行结合，可有效治疗或者预防肿瘤增殖。
根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药学上可接受的载体或辅料。
需要说明的是“药学上可接受的载体”可以包括生理学上相容的任何和所有溶剂等等。具体实例可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖等以及它们的组合物中的一种或多种。有许多情况下，药物组合物中包括等渗剂，例如氯化钠等。当然药学上可接受的载体还可包括微量的辅助物质，例如缓冲剂，用来延长抗体的保存限期或效力。
例如，本发明的抗体或抗原结合片段可掺入适用于胃肠外施用(例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)的药物组合物中。这些药物组合物可以被制备成各种形式。例如液体、半固体和固体剂型等，包括但不限于液体溶液(例如，注射溶液和输注溶液)脂质体。典型的药物组合物为注射溶液或输注溶液形式。所述抗体可通过静脉输注或注射、或者肌肉内或皮下注射来施用。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段、本发明第二方面所述的重组蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体、本发明第五方面所述的重组细胞或本发明第六方面所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肿瘤。
根据本发明的实施例，所述肿瘤包括：肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、皮肤癌、前列腺癌、肾癌、子宫内膜癌、子宫颈癌、甲状腺癌和血液系统肿瘤。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段、本发明第二方面所述的重组蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体或本发明第五方面所述的重组细胞。本发明提供的试剂盒中的抗体或抗原结合片段能够与CD150有效结合，此外，在合适条件下，所述核酸分子、表达载体或重组细胞均能够表达所述抗体或抗原结合片段，进一步地，包含上述物质的试剂盒能够与CD150进行有效结合，可用于有效检测CD150。所述试剂盒可用于科学研究，如定性或定量检测生物样本中的CD150，也可以用于对个体状态进行判断，如获得所述个体的CD150水平后，判断其CD150水平是否过高于或低于正常水平，所述生物样本可以为细胞、组织、血液等。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种本发明第一方面所述的抗体或抗原结合片段、本发明第二方面所述的重组蛋白、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的表达载体或本发明第五方面所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD150。
根据本发明的实施例，本发明提供的试剂盒，可以用于免疫印迹、免疫沉淀等涉及到利用CD150抗原和抗体特异性结合性能，来检测的试剂盒等。这些试剂盒可包含下列中的任意一种或多种：拮抗剂、抗CD150抗体或者药物参照材料；蛋白纯化柱；免疫球蛋白亲和纯化缓冲剂；细胞的测定稀释剂；说明书或者文献等。抗CD150抗体可被用于不同类型的诊断测试，例如可以在体外或者体内检测各种各样的疾病或者药物、毒素或者其他蛋白等的存在。例如可以通过对受试者的血清或者血液进行检测，用来测试相关疾病。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例1的CD150免疫原的表达，纯化，鉴定；
图2是根据本发明实施例1的CD150蛋白免疫羊驼技术流程；
图3是根据本发明实施例1的单克隆噬菌体ELISA结果；
图4是根据本发明实施例1的纳米抗体Fc融合蛋白(A)SDS-PAGE凝胶电泳图；
图5是根据本发明实施例1的采用凝胶过滤层析表征所述纳米抗体Fc融合蛋白与TD1之间结合的结果图；
图6是根据本发明实施例1的采用ELISA表征所述纳米抗体Fc融合蛋白与CD150之间结合的结果图；
图7是根据本发明实施例1的采用BLI表征所述纳米抗体与TD1之间的亲和力；
图8是根据本发明实施例2的抗CD150抗体抑制小鼠肿瘤增殖。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“抗体”通常是指可识别一种或多种抗原表位的抗体，包括但不限于单抗、多抗、多聚体抗体和CDR移植抗体。
在本文中，术语“CDR移植抗体”和“改型化抗体”均是指将一个物种单抗的CDR移植至另一物种抗体可变区。例如，可将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，以便替代人源抗体CDR，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性。需要说明的是，本申请中的多抗和单抗均可为CDR移植抗体。
在本文中，术语“单抗”是指仅可识别一种特定抗原表位的抗体。其中，常见的单抗为包括两条分子量较轻的轻链和两条分子量较重的重链，重链(H链)和轻链(L链)由二硫键连接形成一个四肽链分子，该重链或轻链的氨基端(N端)氨基酸序列变化很大，称为可变区(V区)，该重链或轻链的羧基端(C端)相对稳定，变化很小，称为恒定区(C区)；L链和H链的V区分别称为VL和VH。单抗还可以为小分子抗体，小分子抗体主要包括：Fab抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体与最小识别单位。
在本文中，术语“Fab抗体”通常是指仅含Fab分子的抗体，其由重链的VH和CH1以及完整的轻链构成，轻链和重链之间通过一个二硫键连接。
在本文中，术语“Fv抗体”通常是指仅由轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)通过非共价键连接而成的抗体，是抗体分了保留完整抗原结合部位的最小功能片段。
在本文中，术语“单域抗体”、“纳米抗体”和“VHH抗体”可互换使用，其最初被描述为“重链抗体”(即“缺乏轻链的抗体”)的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(Hamers-CastermanC,AtarhouchT,Muyldermans S,Robinson G,Hamers C,Songa EB,Bendahman N,HamersR.:“Naturallyoccurring antibodies devoid of light chains”；Nature 363,446-448(1993))，只包含重链可变区(VH)和常规的CH2与CH3区，其通过重链可变区与抗原特异性结合。
在本文中，术语“单链抗体”通常是指由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过连接肽连接而成的抗体。
在本文中，术语“最小识别单位”和“MRU”均是指仅由一个CDR组成的抗体，其分子量十分小仅占完全抗体的1％左右。
在本文中，术语“多抗”是指可识别多种抗原表位的抗体，例如可识别两种抗原表位的抗体(简称双抗)、三种抗原表位的抗体或者四种抗原表位的抗体，其为广义理解，具体结构不受限制，可识别多种抗原表位即可。
在本文中，术语“免疫原性”是指能引起免疫应答的性能，即抗原能刺激特定的免疫细胞，使免疫细胞活化、增殖、分化，最终产生免疫效应物质抗体和致敏淋巴细胞的特性。
在本文中，术语“片段”是指目标蛋白或多肽，以及具有N-末端(N端)或C-末端(C端)截短、和/或内部删除的目标蛋白或多肽。
在本文中，术语“同一性”、“同源性”或“相似性”均用于描述相对于参考序列的氨基酸序列或核酸序列时，采用通过常规的方法进行确定两个氨基酸序列或核酸序列之间的相同氨基酸或核苷酸的百分比，例如参见，Ausubel等，编著(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，第19章(Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York)；和ALIGN程序(Dayhoff(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure5：Suppl.3(National Biomedical Research Foundation，Washington，D.C.)。关于比对序列和测定序列同一性有很多算法，包括，Needleman等(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源性比对算法；Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法；Pearson等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444的相似性搜索方法；Smith-Waterman算法(Meth.Mol.Biol.70：173-187(1997)；和BLASTP，BLASTN，和BLASTX算法(参见Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。利用这些算法的计算机程序也是可获得的，并且包括但不限于：ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或者WU-BLAST-2(Altschul等，Meth.Enzym.，266：460-480(1996))；或者GAP，BESTFIT，BLAST Altschul等，上文，FASTA，和TFASTA，在Genetics Computing Group(GCG)包，8版，Madison，Wisconsin，USA中可获得；和Intelligenetics，Mountain View，California提供的PC/Gene程序中的CLUSTAL。
在本文中，术语“至少80％同一性”指与各参考序列至少为80％，可为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性。
在本文中，术语“表达载体”通常是指能够插入在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述表达载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述表达载体还包括具有多种上述功能的载体。所述表达载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述表达载体的合适的宿主细胞，所述表达载体可以产生期望的表达产物。
在本文中，术语“重组细胞”通常是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞。其中，术语“宿主细胞”是指可导入重组表达载体的原核细胞或真核细胞。本文所用术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的各种技术将核酸(例如载体)引入细胞。合适的宿主细胞可以用本发明的DNA序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。可用于本发明的合适宿主细胞的例子包括永生化杂交瘤细胞、NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、Cap细胞(人羊水来源的细胞)和CoS细胞。
在本文中，术语“药物组合物”通常是指单位剂量形式，并且可以通过制药领域中熟知的方法的任何一种进行制备。所有的方法包括使活性成分与构成一种或多种附属成分的载体相结合的步骤。通常，通过均匀并充分地使活性化合物与液体载体、细碎固体载体或这两者相结合，制备组合物。
在本文中，术语“抗原结合片段”是指保持特异性结合抗原能力的抗体片段。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：靶向CD150抗体制备
1、表达载体构建
从公司合成的CD150全长基因中PCR扩增CD150胞外段编码序列，将序列片段与PTT5-hfc重组质粒在SaI l和X-BaI l处酶切后进行连接，连接产物转化DH5α大肠杆菌，涂板生长过夜，并对筛选得到的菌株进行PCR检测，将PCR鉴定阳性的克隆进行DNA测序，测序结果表明载体ptt5-CD150-hFc构建成功。
2、免疫原表达，纯化与鉴定
首先用pei 2:1转染ptt5-CD150-hFc到293f细胞中，120rpm，37℃，5％ CO2培养细胞4天，4000g，20min离心取细胞上清。用Protein A蛋白纯化柱去纯化带hFc片段的CD150蛋白，用0.1M的乙酸洗脱蛋白用p H＝8.0的Tris-HCL去中和酸性，得到带Human Fc的CD150蛋白。其次，用TEV酶4度过夜酶切去除hfc片段，用10KD超滤管浓缩蛋白，加入PBS去清洗蛋白，将纯化的CD150蛋白进行SDS-PAGE验证，最后用superdex 75的分子筛过蛋白确定蛋白的大小和状态。得到CD150的蛋白。结果如图1所示，表明获得纯化后CD150h蛋白，并确定蛋白是单体。
3、CD150蛋白免疫羊驼
利用重组表达的CD150蛋白免疫羊驼，免疫过程如图2所示。本发明实施例共进行四次免疫，其中前两次为皮下注射，后两次为肌肉注射。皮下注射间隔时间为14天，肌肉注射间隔时间为14天。最后一次肌肉注射后14天，通过颈静脉采集羊驼外周血。本发明实施例中羊驼每次免疫CD150蛋白剂量均为200μg。
4、纳米抗体筛选
a.将抽取的羊驼血液缓慢加至等体积Ficol溶液上层，离心速率由6降2，400g，25℃，离心20min，取中间淋巴细胞层，经DMEM培养基洗涤后，离心收集细胞沉淀。利用RNA抽提试剂盒提取总RNA，并反转录为cDNA。
b.以cDNA为模板，以特异性引物扩增VHH序列，
正向引物为F1：
5’-GCTGCACAGCCTGCTATGGCACAGKTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGG-3’；
反向引物为R1：
5-GAGTTTTTGTTCGGCTGCTGCTGAGGAGACGGTGACCTGGGTCCCC-3’。
以0.5μL cDNA为模板，采用2条引物扩增VHH(羊驼单域抗体)片段，DNA聚合酶为primerstar2X MAX酶，体系为50μL，退火温度55℃，跑胶鉴定后直接采用PCR胶回收试剂盒回收。
以pR2噬菌粒为模板，特异性引物扩增pR2噬菌粒，
正向引物为F2：
5’-AGCAGCCGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAG-3’；
反向引物为R2：
5’-CCATAGCAGGCTGTGCAGCATAGAAAGGTACCACTAAAGGAATTGC-3’。
以10ng pR2质粒为模板，采用如下引物进行PCR扩增，DNA聚合酶为primerstar 2XMAX，退火温度为53℃，共需扩增2个50μL体系。采用PCR回收试剂回收，加入50μL的ddH2O洗脱。
利用无缝克隆连接pR2噬菌粒和VHH片段，其摩尔比为1：4。将连接产物电转化至TG1感受态细胞中，37℃、200rpm培养1h，分别取0.2μL和0.02μL(稀释法)菌液涂布10cm固体平板，培养13h后计数菌落数目，并计算所构建抗体文库大小。将剩余的菌液经离心后涂布至150mm固体平板，37℃培养13h，而后刮取菌苔，液氮速冻后于-80℃储存，此为纳米抗体文库。
c.活化冻存的抗体库细菌，加入KM13辅助噬菌体，以辅助M13噬菌体生长和繁殖。取细菌培养上清，测量噬菌体滴度，此为扩增后的噬菌体。以0.1mg/mL浓度包被CD150抗原至免疫板，加入1X1011pfu酶以上扩增的噬菌体，室温孵育1h。利用胰酶洗脱与CD150抗原特异性结合的噬菌体，并将其侵染TG1细菌。分别取50μL和5μL侵染的菌液涂布固体平板，记录菌落总数。
d.从以上平板中随机挑取95个单菌落，活化过夜。加入KM13辅助噬菌体，离心收集裂解后的上清，此为单克隆噬菌体。以1μg/mL浓度包被CD150抗原至96孔免疫板，每孔分别加入以上制备的单克隆噬菌体溶液，室温孵育1h。利用HRP-anti M13抗体捕获与CD150抗原结合的噬菌体，并用TMB底物显色5min，以1M H2SO4溶液终止反应。采用酶标仪记录OD450数值，结果如图3所示，表明ELISA结果证实对照组未包被CD150，实验组包被了CD150蛋白。
e.挑取OD450值大于1的孔进行测序分析。
f.对分析所测得抗体序列，排除重复的克隆后，共得到1条纳米抗体序列。
5、表达纯化所得CD150纳米抗体及其Fc融合蛋白
将本发明中的纳米抗体序列构建到带信号肽的哺乳动物表达载体pTT5中，使其与人IgG1 Fc融合表达，Fc片段表达在C末端，并可用TEV酶酶切获得纳米抗体。将重组质粒转染HEK 293F细胞，收集培养上清，经Protein A亲和层析柱纯化纳米抗体Fc融合蛋白。如图4所示，最终获得了高纯度的纳米抗体Fc融合蛋白。
本申请实施例所述CD150抗原核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示：
ATGGCAAGCTACGGAACAGGTGGGCGCATGATGAACTGCCCAAAGATTCTCCGGCAGTTGGGAAGCAAAGTGCTGCTGCCCCTGACATATGAAAGGATAAATAAGAGCATGAACAAAAGCATCCACATTGTCGTCACAATGGCAAAATCACTGGAGAACAGTGTCGAGAACAAAATAGTGTCTCTTGATCCATCCGAAGCAGGCCCTCCACGTTATCTAGGAGATCGCTACAAGTTTTATCTGGAGAATCTCACCCTGGGGATACGGGAAAGCAGGAAGGAGGATGAGGGATGGTACCTTATGACCCTGGAGAAAAATGTTTCAGTTCAGCGCTTTTGCCTGCAGTTGAGGCTTTATGAGCAGGTCTCCACTCCAGAAATTAAAGTTTTAAACAAGACCCAGGAGAACGGGACCTGCACCTTGATACTGGGCTGCACAGTGGAGAAGGGGGACCATGTGGCTTACAGCTGGAGTGAAAAGGCGGGCACCCACCCACTGAACCCAGCCAACAGCTCCCACCTCCTGTCCCTCACCCTCGGCCCCCAGCATGCTGACAATATCTACATCTGCACCGTGAGCAACCCTATCAGCAACAATTCCCAGACCTTCAGCCCGTGGCCCGGATGCAGGACAGACCCCTCAGAAACAAAACCATGGGCAGTGTATGCTGGGCTGTTAGGGGGTGTCATCATGATTCTCATCATGGTGGTAATACTACAGTTGAGAAGAAGAGCCACCTTGACTACTACCAACCAATACTGGAGTCAAAATGTCCTGACCCAAGACCAGGAGAGATGCCCCGGCTGCCTTCCCATGGTAAAACGAACCATTACCAGACAACAGTGGAAAAAAAAAGCCTTACGATCTATGCCCAAGTCCAGAAACCAGGTCCTCTTCAGAAGAAACTTGACTCCTTCCCAGCTCAGGACCCTTGCACCACCATATATGTTGCTGCCACAGAGCCTGTCCCAGAGTCTGTCCAGGAAACAAATTCCATCACAGTCTATGCTAGTG(SEQ ID NO:6)。
6、表征CD150纳米抗体
a.采用凝胶过滤层析表征所述纳米抗体Fc融合蛋白与CD150的结合情况。将纳米抗体Fc融合蛋白和CD150蛋白以摩尔比2：1混匀，上孵育1h，而后上样至Superdex 75凝胶过滤层析柱，记录280nm处吸光度变化情况，并绘制层析图谱。与此同时，设置纳米抗体Fc融合蛋白对照和CD150蛋白对照。结果如图5所示，证实CD150蛋白与抗体结合。
b.采用非竞争性ELISA表征所述纳米抗体Fc融合蛋白与SARS-CoV-2RBD的结合情况：将浓度为10μg/mL的CD150蛋白包被于免疫板中，依次添加1：4梯度稀释的纳米抗体Fc融合蛋白，室温孵1h。而后，加入HRP anti-IgG1 Fc抗体在加入显色液和终止液测OD450的吸光值。结果如图6所示，获得抗体EC50＝33.29ng/ml，表明获得抗体效价较高。
c.采用BLI表征纳米抗体与CD150的亲和力。为了表征纳米抗体与CD150的亲和力，首先用生物素标记CD150，得到生物素化的CD150蛋白(biotin-CD150)。而后，将其固化在SA生物传感器上，设置不同的纳米抗体Fc融合蛋白浓度梯度，检测biotin-CD150与纳米抗体Fc融合蛋白的亲和力。结果如图7所示，表明抗体与抗原的亲和力较强。
实施例2：抗CD150抗体在小鼠中抑制肝癌增殖
根据本发明的实施例，对本申请抗CD150抗体进行肝癌小鼠模型进行验证。具体步骤如下所示：
人源化小鼠治疗，采用的本申请的CD150阻断抗体进行治疗。对照组中加入相同剂量的IgG作为对照。取NSG小鼠(免疫缺陷小鼠模型)12只，用2.5％异氟烷将小鼠麻醉，然后用小鼠固定器将小鼠固定住，将小鼠尾巴捋直清晰可以看到左右两测的尾静脉，将1×107的PBMC细胞尾静脉回输进小鼠体内，一次回输的总体积在100ul左右。第6天随机将小鼠分为两组6VS.6，用HEPG2(肝癌细胞)进行皮下荷瘤，每只小鼠的皮下荷瘤细胞量为5×106，总体积为100ul。从第13天开始进行腹腔给药治疗，治疗组加入10mg/kg抗体治疗，对照组用等量的IgG，总体积为100ul。每次治疗间隔三天共治疗5次。从第16天开始测量肿瘤体积间隔两天测一次。当小鼠的肿瘤体积超过1000mm时视为死亡不再统计后续数据。在给药后可以明显看到肿瘤的生长速度降低(图8)，表明抗CD150抗体具有阻断CD150的功能从而达到治疗肿瘤的目的。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (11)

1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，包括选自下列至少之一的重链可变区CDR序列或与其具有至少80％同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO:1～3。
2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括：
分别如SEQ ID NO:1、2和3的氨基酸序列所示或与SEQ ID NO:1、2和3具有至少80％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；
任选地，所述抗体或抗原结合片段进一步含有重链框架区序列，所述重链框架区序列的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体、羊驼源抗体或其突变体的至少之一；
任选地，所述抗体或抗原结合片段具有如SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的重链可变区；
任选地，所述抗体或抗原结合片段进一步含有重链恒定区，所述重链恒定区的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体、灵长目源抗体或其突变体的至少之一；
优选地，所述重链恒定区来自于羊驼源抗体。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段包括单抗或多抗；
任选地，所述单抗包括Fab抗体、Fv抗体、单链抗体、单域抗体以及最小识别单位的至少之一；
任选地，所述抗体具有如SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
4.一种重组蛋白，其特征在于，包括：权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段；
任选地，进一步包括选自生物活性蛋白或其片段、生物活性多肽或其片段中的至少之一；
任选地，所述生物活性蛋白或其片段包括选自蛋白标签、蛋白毒素或其片段、肿瘤坏死因子或其片段、干扰素或其片段、生物反应调节物或其片段和Fc片段中的至少之一。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求8～10任一项所述的重组蛋白；
任选地，所述核酸分子为DNA。
6.一种表达载体，其特征在于，携带权利要求5所述的核酸分子；
任选地，所述表达载体为真核表达载体或原核表达载体；
优选地，所述表达载体为质粒表达载体。
7.一种重组细胞，其特征在于，包括：
携带权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的表达载体；或，
表达权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段或权利要求4所述的重组蛋白；
任选地，所述重组细胞是通过将权利要求6所述的表达载体引入至宿主细胞中而获得的；
任选地，所述重组细胞为真核细胞；
任选地，所述重组细胞为哺乳动物细胞。
8.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求4所述的重组蛋白、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的重组细胞；
任选地，进一步包括药学上可接受的载体或辅料。
9.权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求4所述的重组蛋白、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的重组细胞或权利要求8所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或者预防肿瘤；
任选地，所述肿瘤包括：肺癌、胃癌、结直肠癌、肝癌、乳腺癌、食管癌、甲状腺癌。
10.一种试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求4所述的重组蛋白、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的重组细胞。
11.权利要求1～3任一项所述的抗体或抗原结合片段、权利要求4所述的重组蛋白、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体或权利要求7所述的重组细胞在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测CD150。
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