KR20230132511A - Cd73에 결합하는 단백질 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
CD73에 특이적으로 결합할 수 있는 단리된 항원 결합 단백질을 제공하며, 상기 항원 결합 단백질은 중쇄 가변 영역 VH 내의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 상기 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 상기 단리된 항원 결합 단백질의 제조 방법 및 용도를 더 제공한다.
Description
본 발명은 생물의학 분야에 관한 것이며, 구체적으로 CD73의 항원 결합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
NT5E로도 불리는 CD73은 분자량이 약 70Kd인 세포외 5-뉴클레아제(NT5E)이며, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI)을 통해 세포 표면에 고정되고, 주로 이합체 형식으로 존재한다. 정상적인 생리학적 상태에서, CD73은 간, 대장, 신장, 비장, 폐, 난소, 림프절 등의 조직과 같은 다양한 조직 또는 기관에서 발현될 수 있다.
다수의 전임상 연구 결과에 따르면, CD73은 다양한 종양 세포 표면에서 비정상적인 고발현을 보이며, 임상 데이터에 따르면 CD73의 고발현은 종양 환자의 예후 불량과 밀접한 관련이 있기 때문에, CD73은 다양한 종양 임상 치료 및 예후의 잠재적 표적으로 사용될 수 있다.
그러나, 현재 시중에는 인간 CD73에 대한 항체 또는 소분자 약제가 아직 나오지 않았기 때문에, CD73이 비정상적으로 발현되는 암의 치료를 위한 새로운 아이디어와 전망을 제공하기 위해 종양 CD73을 표적으로 하는 더 많은 약제의 개발이 시급하다.
본 발명은 1) CD73 또는 이의 기능적 활성 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 특성, 2) 인간 CD73 및/또는 원숭이 CD73에 특이적으로 결합할 수 있는 특성, 3) CD73의 효소 활성을 억제할 수 있는 특성, 4) 세포 표면에서 CD73의 세포내도입을 유도할 수 있는 특성, 5) Tm 및/또는 Tagg 값이 65°C 이상인 특성, 6) 비특이적 정전기적 결합이 없거나 비교적 약한 특성, 및 7) 종양의 성장을 억제할 수 있는 특성 중 하나 이상의 특성을 갖는 단리된 항원 결합 단백질을 제공한다. 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질을 코딩하는 핵산 분자, 발현 벡터, 숙주 세포 및 상기 단리된 항원 결합 단백질을 제조하는 방법을 더 제공한다. 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질은 종양과 같은 질병 및/또는 질환의 예방 및/치료에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 VH 내의 하나 이상의 CDR을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공하며, 상기 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 HCDR2를 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 HCDR1을 포함하고, 상기 HCDR1는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 경쇄 가변 영역 VL 내의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 LCDR2를 포함하고, 상기 LCDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 LCDR1을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 H-FR1을 포함하고, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단에 직접 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR1은 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 H-FR1은 서열번호 7, 서열번호 15 및 서열번호 23 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 H-FR2를 포함하고, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1과 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 H-FR2는 서열번호 8 또는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 H-FR3을 포함하고, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2와 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 H-FR3은 서열번호 9, 서열번호 17, 서열번호 24 및 서열번호 27 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 H-FR4를 포함하고, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단에 연결되고, 상기 H-FR4는 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 H-FR4는 서열번호 10 또는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 L-FR1을 포함하고, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단에 직접적 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR1은 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 L-FR1은 서열번호 11, 서열번호 19 및 서열번호 25 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 L-FR2를 포함하고, 상기 L-FR2는 상기 LCDR1과 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 L-FR2는 서열번호 12 또는 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 L-FR3을 포함하고, 상기 L-FR3은 상기 LCDR2와 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 L-FR3은 서열번호 13, 서열번호 21 및 서열번호 26 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 L-FR4를 포함하고, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단에 연결되고, 상기 L-FR4는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 L-FR4는 서열번호 14 또는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 VH를 포함하고, 상기 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 VH는 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 및 서열번호 34 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 VL을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 VL은 서열번호 29, 서열번호 31 및 서열번호 33 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 하기의 어느 하나로 구성된 군에서 선택된 VH 및 VL를 포함한다.
1) 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH, 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL,
2) 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL,
3) 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL,
4) 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL, 및
5) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체 중쇄 불변 영역은 인간 항체 중쇄 불변 영역에서 유래된다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG 중쇄 불변 영역에서 유래된다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역에서 유래된다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체 경쇄 불변 영역은 인간 IgK 불변 영역에서 유래된다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fv 단편, F（ab'）2, F（ab）2, scFv, di-scFv 및/또는/ dAb를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체로 구성된 군에서 선택된다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 CD73 또는 이의 기능적 활성 단편에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 CD73은 인간 CD73 및/또는 원숭이 CD73을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 CD73의 효소 활성을 억제할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 세포 표면에서 CD73의 세포내도입을 유도할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 Tm 및/또는 Tagg 값은 65°C 이상이다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 비특이적 흡착 효과가 없거나 비교적 약하다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 종양의 성장을 억제할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질을 포함하는 폴리펩티드 분자를 더 제공한다.
특정 실시 양태에서, 상기 폴리펩티드 분자는 융합 단백질을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질 또는 상기 폴리펩티드 분자를 코딩하는 핵산 분자를 더 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 더 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질을 포함하는 면역접합체를 더 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 핵산 분자, 상기 벡터 및/또는 상기 면역접합체를 포함하는 세포를 더 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 면역접합체 및/또는 상기 세포, 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 더 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질을 제조하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 상기 단리된 항원 결합 단백질이 발현되는 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 면역접합체, 상기 세포 및/또는 상기 약학적 조성물의 약제 제조 중의 용도를 더 제공하며, 상기 약제는 질병 및/또는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용된다.
특정 실시 양태에서, 상기 질병 및/또는 질환은 CD73에 의해 매개된다.
특정 실시 양태에서, 상기 질병 및/또는 질환은 종양을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 종양은 고형 종양 및/또는 혈액 종양을 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 질병 및/또는 질환은 유방암을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플에서 CD73을 검출하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 면역접합체, 상기 세포 및/또는 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 면역접합체, 상기 세포 및/또는 상기 약학적 조성물을 포함하는, 샘플에서 CD73을 검출하는 제제 또는 키트를 더 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 면역접합체, 상기 세포 및/또는 상기 약학적 조성물의 키트 제조 중의 용도를 더 제공하며, 상기 키트는 샘플에서 CD73의 존재 및/또는 함량을 검출하는 데 사용된다.
당업자는 하기 상세한 설명을 통해 본 발명의 기타 측면 및 이점을 용이하게 통찰할 수 있다. 하기의 상세한 설명에는 본 발명의 예시적 실시 양태만 도시 및 설명된다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 본 발명의 내용은 본 발명과 관련된 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않게 당업자가 개시된 구체적 실시 양태를 변경할 수 있게 한다. 따라서, 본 발명의 도면 및 명세서의 설명은 예시적일 뿐 제한적인 것이 아니다.
본 발명과 관련된 구체적 특징은 청구 범위에 설명된 바와 같다. 하기의 상세한 예시적 실시 양태 및 도면을 통해 본 발명과 관련된 특징 및 이점을 보다 잘 이해할 수 있다. 도면에 대한 간략한 설명은 하기와 같다.
도 1은 본 발명의 상기 항원 결합 단백질과 세포 표면 인간 CD73의 결합 활성,
도 2는 본 발명의 상기 항원 결합 단백질과 재조합 CD73의 결합 활성,
도 3은 본 발명의 상기 항원 결합 단백질의 CD73에 대한 효소 활성 억제 검출,
도 4는 본 발명의 상기 항원 결합 단백질의 CD73에 대한 효소 활성 억제 검출,
도 5는 본 발명의 상기 항원 결합 단백질에 의해 유도된 세포 표면 CD73의 세포내도입 검출,
도 6은 본 발명의 상기 항원 결합 단백질의 체내 종양에 대한 치료 효과,
도 7은 본 발명의 상기 항원 결합 단백질의 체내 종양에 대한 치료 효과이다.
도 1은 본 발명의 상기 항원 결합 단백질과 세포 표면 인간 CD73의 결합 활성,
도 2는 본 발명의 상기 항원 결합 단백질과 재조합 CD73의 결합 활성,
도 3은 본 발명의 상기 항원 결합 단백질의 CD73에 대한 효소 활성 억제 검출,
도 4는 본 발명의 상기 항원 결합 단백질의 CD73에 대한 효소 활성 억제 검출,
도 5는 본 발명의 상기 항원 결합 단백질에 의해 유도된 세포 표면 CD73의 세포내도입 검출,
도 6은 본 발명의 상기 항원 결합 단백질의 체내 종양에 대한 치료 효과,
도 7은 본 발명의 상기 항원 결합 단백질의 체내 종양에 대한 치료 효과이다.
본 발명의 실시 양태는 특정한 구체적 실시 예를 통해 하기에서 설명되며, 통상의 지식을 가진 자라면 본 명세서에 개시된 내용을 통해 본 발명의 기타 이점 및 효과를 쉽게 이해할 수 있다.
용어 정의
본 발명에서, 용어 “CD73"은 "NT5E", "분화클러스터 73", "5'-뉴클레오티다아제(5'-NT) 또는 "세포외 5'-뉴클레오티다아제"로도 불린다. 상기 용어는 "전장", "가공되지 않은 CD73 및 세포 가공으로 인해 생성된 임의의 형식의 CD73을 포괄한다. 본 발명에서, 용어 "CD73"은 전장의 야생형 CD73 및 이의 돌연변이체, 단편, 변이체, 동종형 및 상동체를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 상기 CD73은 인간 CD73을 포함할 수 있다. 예를 들어 인간 CD73에 대한 서열은 Uniprot 수탁번호 P21589를 참조할 수 있다.
본 발명에서, 용어 “단리된”은 통상적으로 자연 상태에서 인공적인 수단을 거쳐 수득된 것을 말한다. 자연계에서 특정 “단리”된 물질 또는 성분이 나타나는 경우, 그 자연 환경에 변화가 발생했거나, 또는 자연 환경에서 그 물질이 단리되었거나, 또는 두 상황이 동시에 발생했을 수 있다. 예를 들어, 어떤 살아있는 동물 체내에는 어떤 단리되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 자연적으로 존재하며, 이러한 자연 상태에서 단리된 고순도의 상동한 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 단리라고 한다. 용어 “단리된”은 인공 또는 합성 물질의 혼합을 배제하지 않고, 물질 활성에 영향을 미치지 않는 기타 불순물의 존재도 배제하지 않는다.
본 발명에서, 용어 "단리된 항원 결합 단백질"은 통상적으로 그 자연적 존재 상태를 벗어난 항원 결합 능력을 갖는 단백질을 말한다. 그 “단리된 항원 결합 단백질”은 항원 결합 부위 및 선택성을 포함할 수 있고, 항원 결합 부위는 상기 항원 결합 부위의 항원 결합을 촉진하는 배열의 프레임워크 또는 스캐폴드 부분의 채택을 허용한다. 항원 결합 단백질은 예를 들어 항체 유래의 단백질 프레임워크(FR) 또는 이식된 CDR 또는 CDR 유도체를 갖는 대체 단백질 프레임워크 영역 또는 인공 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 이러한 프레임워크는, 예를 들어 항원 결합 단백질의 3차원 구조를 안정시키기 위해 도입된 돌연변이의 항체 유래 프레임워크 및 예를 들어 생체 적합성 폴리머를 포함하는 완전 합성 프레임워크 영역을 포함하나 이에 국한되지 않는다. 예를 들어 Korndorfer 등, 2003,Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,53（1）:121-129（2003）; Roque 등, Biotechnol. Prog. 20:639-654（2004）를 참조한다. 항원 결합 단백질의 예는, 인간 항체, 인간화 항체; 키메라 항체; 재조합 항체; 단일사슬 항체; 이중 기능 항체; 삼중 기능 항체; 사중 기능 항체; Fab, Fab', Fv 단편, F（ab'）2, F（ab）2, scFv, di-scFv, dAb, IgD 항체, IgE 항체; IgM 항체; IgG1 항체; IgG2 항체; IgG3 항체; 또는 IgG4 항체 및 이의 단편을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "CDR"은 상보성 결정 영역으로도 불리며, 통상적으로 이의 서열이 매우 가변적이고 및/또는 구조적으로 정의된 루프를 형성하는 항체의 가변 도메인 내의 영역을 말한다. 통상적으로, 항체는 VH 내의 3개(HCDR1, HCDR2, HCDR3), 및 VL 내의 3개(LCDR1, LCDR2, LCDR3)인 6개의 CDR을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 중쇄만으로 구성된 자연적으로 존재하는 낙타의 항체는 경쇄가 부족한 상황에서, 이의 기능이 정상적이고 안정적이다. 예를 들어, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 （1993）; Sheriff et al, Nature Struct. Biol. 3:733-736 （1996）을 참조한다. 항체 CDR은 CCG, Kabat, Chothia, IMGT, Kabat/Chothia의 종합적 고려 등과 같은 다양한 코딩 시스템을 통해 결정될 수 있다. 이러한 코딩 시스템은 당업계에 널리 알려져 있으며, 구체적으로는 http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum을 참조한다. 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질의 아미노산 서열번호는 IMGT 넘버링을 따를 수 있다(IMGT, the international ImMunoGeneTics information system@imgt.cines.fr；http：//imgt.cines.fr；Lefranc 등, 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212；Ruiz 등, 2000 Nucleic Acids Res. 28: 219-221；Lefranc 등, 2001, Nucleic Acids Res. 29:207-209；Lefranc 등, 2003, Nucleic Acids Res. 31: 307-310；Lefranc 등, 2005, DevComp Immunol 29: 185-203). 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질의 CDR은 Kabat 넘버링 시스템에 따라 결정될 수 있다(예를 들어 Kabat EA &Wu TT（1971）Ann NY AcadSci 190:382-391 및 Kabat EAet al.,（1991）Sequences of Proteins of Immunological Interest,FifthEdition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91-3242 참조).
본 발명에서, 용어 “FR”은 통상적으로 프레임워크 영역이라 불리는 항체 가변 도메인의 보다 고도로 보존된 부위를 말한다. 통상적으로, 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역, 즉 VH 내의 4개(H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4), 및 VL 내의 4개(L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4)를 포함한다.
본 발명에서, 용어 “가변 도메인” 및 "가변 영역"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 통상적으로 항체 중쇄 및/또는 경쇄의 한 부위를 말한다. 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 "VH" 및 "VL”(또는 각각 “VH” 및 “VL로 지칭)로 지칭될 수 있다. 이러한 도메인은 일반적으로 항체의 변화가 가장 큰 부위(동일 유형의 기타 항체에 비해)이고, 항원 결합 부위를 포함한다.
본 발명에서, 용어 “가변”은 통상적으로 항체 사이 가변 도메인의 특정 세그먼트가 서열상 큰 차이가 존재할 수 있음을 말한다. 가변 도메인은 항원 결합을 매개하고 이의 특정 항원에 대한 특정 항체의 특이성을 결정한다. 그러나, 가변성은 전체 가변 도메인 범위 내에 고르게 분포되지 않는다. 오히려, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 중 고변이 영역(CDR 또는 HVR)이라고 하는 3개 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인의 보다 고도로 보존적인 부위를 프레임워크 영역(FR)이라 한다. 자연적 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 4개의 FR 영역을 포함하며, 대부분은 β-병풍 구조를 사용하고, 3개 CDR을 통해 연결되어 환형의 연결을 형성하며, 일부 경우에는 β-병풍 구조의 한 부위를 형성한다. 각 사슬 중의 CDR은 FR 영역을 통해 밀착되게 유지되고, 다른 사슬로부터의 CDR은 항체의 항원 결합 부위의 형성을 공동으로 촉진한다(Kabat et al, Sequences of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. （1991） 참조).
본 발명에서, 용어 “항체”는 통상적으로 면역글로불린 또는 이의 단편 또는 이의 유도체를 말하고, 체외나 체내에서 생성되는 것에 상관 없이 항원 결합 부위를 포함하는 모든 폴리펩티드를 포괄한다. 그 용어는 다중클론, 단일클론, 단일 특이적, 다중 특이적, 비특이적, 인간화, 단일사슬, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이 및 이식된 항체를 포함하나 이에 국한되지 않는다. 별도로 용어 “완전한”에 의해 변형되지 않는 한, “완전한 항체”에서, 본 발명의 목적을 위해, 용어 “항체”는, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb 및 항원 결합을 유지하는 기능(예를 들어, CD73에 특이적 결합)의 기타 항체 단편과 같은 항체 단편도 포함한다. 통상적으로, 이러한 단편은 반드시 항원 결합 도메인을 포함해야 한다. 기본적 4사슬 항체 단위는 두 개의 동일한 경(L)쇄 및 두 개의 동일한 중(H)쇄로 구성되는 이종 사량체 당 단백질이다. IgM 항체는 5개의 기본적 이종 사량체 단위와 J사슬로 불리는 또 다른 폴리펩티드로 구성되고, 10개의 항원 결합 부위를 포함하며, IgA 항체는 J사슬과 결합해 중합되어 다가 조합을 형성할 수 있는 2-5개의 기본 4사슬 단위를 포함한다. IgG의 경우, 4사슬 단위는 일반적으로 약150,000달톤이다. 각 L사슬은 하나의 공유 이황화 결합을 통해 H사슬과 연결되고, 두 개의 H사슬은 H사슬 동종형에 따라 결정되는 하나 이상의 이황화 결합을 통해 서로 연결된다. 각 H 및 L사슬은 규칙적인 간격을 둔 사슬 내 이황화 다리를 더 갖는다. 각 H사슬은 N-말단에서 가변 도메인(VH)을 가지며, α 및 γ사슬에 대해서는 각각 3개의 불변 도메인(CH)이 이어지고, μ 및 ε의 동종형에 대해서는 4개의 CH 도메인이 이어진다. 각 L사슬은 N-말단에서 가변 도메인(VL)을 가지며, 이의 타단에서 불변 도메인을 갖는다. VL은 VH에 해당되고, CL은 중쇄의 첫 번째 불변 도메인(CH1)에 해당된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 사이에 경계면을 형성하는 것으로 여겨진다. VH와 VL은 짝을 이루어 단일 항원 결합 부위를 형성한다. 상이한 유형의 항체 구조 및 특성의 경우는 Basic and Clinical Immunology, 8th Edition, Daniel P. Sties, Abba I. Terr and Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994의 제71페이지 및 제6장을 참조한다. 모든 척추동물 종에서 유래된 L사슬은 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기반하여 κ와 λ라고 하는 분명하게 상이한 두 가지 유형 중의 하나로 분류될 수 있다. 중쇄(CH) 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린을 상이한 유형 또는 동종형으로 나눌 수 있다. 현재 면역글로불린은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ의 중쇄로 명명되는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5가지 유형이 존재한다.
본 발명에서, 용어 “항원 결합 단편”은 통상적으로 항원(예를 들어, CD73)에 특이적으로 결합하는 특성을 갖는 하나 이상의 단편을 말한다. 본 발명에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab’, F(ab)2, Fv 단편, F(ab’)2, scFv, di-scFv 및/또는 dAb를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "Fab"는 통상적으로 항체의 항원 결합 단편을 말한다. 전술한 바와 같이, 파파인을 사용해 완전한 항체를 분해할 수 있다. 항체는 파파인에 의해 분해된 후 두 개의 상동한 항원 결합 단편, 즉 "Fab" 단편, 및 잔류된 "Fc" 단편(즉 Fc 영역, 위와 동일)을 생성한다. Fab 단편은 하나의 완전한 L사슬과 중쇄 가변 영역 및 그 H사슬(VH)의 첫 번째 불변 영역(CH1)으로 구성될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "Fab' 단편"은 통상적으로 인간 단일클론 항체의 1가 항원 결합 단편을 말하며, 그 단편은 Fab 단편보다 약간 크다. 예를 들어, Fab'단편은 모든 경쇄, 모든 중쇄 가변 영역 및 중쇄의 전부 또는 일부의 첫 번째 및 두 번째 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, Fab' 단편은 중쇄의 일부 또는 전부의 220-330개 아미노산 잔기를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "F(ab')2"는 통상적으로 펩신을 통해 완전한 항체가 분해되어 생성되는 항체 단편을 말한다. F(ab')2 단편은 이황화 결합에 의해 연결이 유지되는 두 개의 Fab 단편 및 일부 힌지 영역을 포함한다. F(ab')2 단편은 2가 항원 결합 활성을 갖고 항원을 가교할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "Fv 단편"은 통상적으로 전부 또는 일부 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역이 결여된 인간 단일클론 항체의 1가 항원 결합 단편을 말한다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 예를 들어 CDR을 포함한다. 예를 들어, Fv 단편은 중쇄 및 경쇄의 약 110개 아미노산의 전부 또는 일부 아미노 말단 가변 영역을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "scFv"는 통상적으로 경쇄를 포함하는 적어도 하나의 가변 영역 항체 단편 및 중쇄를 포함하는 적어도 하나의 가변 영역 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 말하며, 여기서 상기 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 인접하고(예를 들어 유연한 폴리펩티드 링커와 같은 합성 링커에 의해), 단일 사슬 폴리펩티드 형식으로 발현될 수 있으며, 여기서 상기 scFv는 이의 유래된 완전한 항체의 특이성을 보존한다. 별도로 명시되지 않는 한, 본 발명에서 사용된 바와 같이, scFv는 임의의 순서(예를 들어 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에 대해)로 상기 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "dAb"는 통상적으로 VH 도메인 또는 VL 도메인을 갖는 VH도메인, VL 도메인의 항원 결합 단편을 말하며, 예를 들어 Ward 등（Nature,1989Oct 12；341（6242）：544-6），Holt 등, Trends Biotechnol.,2003,21（11）：484-490을 참조하고, 및 WO 06/030220, WO 06/003388 및 DomantisLtd의 기타 개시된 특허 출원을 참조한다.
본 발명에서, 용어 "단일 클론 항체"는 통상적으로 단일 분자로 이루어진 항체 분자 제제를 말한다. 단일클론 항체는 통상적으로 단일 항원 부위에 대해 고도의 특이성을 갖는다. 또한, 일반적인 다중클론 항체 제제(일반적으로 상이한 결정인자에 대해 상이한 항체를 갖는다)와 달리, 각 단일클론 항체는 항원의 단일 결정인자에 대한 것이다. 이들의 특이성 이외에도, 단일클론 항체는 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양을 통해 합성될 수 있는 이점이 있다. 수식어 "단일클론"은 기본적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 의미하며, 임의의 특정 방법을 통해 항체가 생산되어야 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 단일클론 항체는 하이브리도마 세포에서 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법을 통해서도 제조될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "키메라 항체:는 통상적으로 가변 영역이 한 종에서 유래되고, 불변 영역이 다른 종에서 유래된 항체를 말한다. 일반적으로, 가변 영역은 설치동물과 같은 실험동물의 항체("모 항체")에서 유래하고, 불변 영역은 인간 항체에서 유래되므로, 수득된 키메라 항체는 어미(예를 들어, 마우스 유래) 항체에 비해 인간 개체에서 불량 면역반응을 일으킬 가능성이 낮다.
본 발명에서, 용어 "인간화 항체"는 통상적으로 비인간 항체(예를 들어, 마우스 항체)의 CDR 영역 이외의 아미노산 일부 또는 전부가 인간 면역글로불린에서 유래된 상응하는 아미노산에 의해 치환된 항체를 말한다. CDR 영역에서, 아미노산의 작은 추가, 결실, 삽입, 치환 또는 변형은 항체가 특정 항원에 결합하는 특성을 여전히 유지하는 한 역시 허용될 수 있다. 인간화 항체는 인간 면역글로불린 불변 영역의 적어도 한 부위를 선택적으로 포함할 수 있다. "인간화 항체"는 원래 항체와 유사한 항원 특이성을 유지한다. 비인간(예를 들어, 마우스) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린 서열로부터 유도된 키메라 항체를 최소한으로 포함할 수 있다. 특정 경우에서, 인간 면역글로불린(수용체 항체)의 CDR 영역 잔기는 원하는 특성, 친화도 및/또는 기능을 갖는 비인간 종(공여체 항체)(예를 들어, 마우스, 랫, 집토끼 또는 비인간 영장류 동물)의 CDR 영역 잔기로 치환될 수 있다. 특정 경우에서, 인간 면역글로불린의 FR 영역 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 치환될 수 있다. 또한, 인간화 항체는 수용체 항체 또는 공여체 항체에 없는 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 이들 변형은 결합 친화도와 같은 항체의 특성을 추가적으로 개선하기 위한 것일 수 있다.
용어 "완전 인간 항체"는 통상적으로 인간 면역글로불린 단백질 서열만 포함한 항체를 말한다. 만약 마우스, 마우스 세포 또는 마우스 세포로부터 유도된 하이브리도마에서 생산되는 경우, 완전 인간 항체는 마우스 당사슬을 포함할 수 있다. 유사하게는, "마우스 항체" 또는 "랫 항체"는 각각 마우스 또는 랫 면역글로불린 서열만을 포함하는 항체를 말한다. 파지 디스플레이 또는 기타 분자 생물학적 방법을 통해, 인체 내에서, 인간 면역글로불린 생식계열 세포를 갖는 유전자 변형 동물 체내에서 완전 인간 항체를 생성할 수 있다. 항체의 제조에 사용되는 예시적인 기술은 미국 특허 6,150,584, 6,458,592, 6,420,140에 개시되어 있다. 라이브러리 사용과 같은 기타 기술은 당업계에 이미 알려진 것이다.
본 발명에서, 용어 "폴리펩티브 분자" 및 "폴리펩티드", "펩티드"는 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 통상적으로 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. 용어 "융합 단백질"은 통상적으로 적어도 두 개의 공유결합으로 연결된 일부를 갖는 폴리펩티드를 말한다. 여기서 각 부위는 상이한 특성을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 그 특성은 체외 또는 체내 활성과 같은 생물학적 특성일 수 있다. 그 특성은 또한 표적 분자와의 결합, 반응의 촉매 등과 같은 단순한 화학적 또는 물리적 특성일 수도 있다. 이 두 부위는 단일 펩티드를 통해 결합되거나 또는 펩티드 링커를 통해 직접 연결될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "핵산 분자"는 통상적으로 임의의 길이로 단리된 형식의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드, 또는 이의 자연적인 환경으로부터 단리되거나 인공적으로 합성된 유사체를 말한다.
본 발명에서, 용어 “벡터”는 통상적으로 어떤 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시켜 단백질을 발현시킬 수 있는 핵산 운반체를 말한다. 벡터는 숙주 세포를 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염시켜, 이의 운반하는 유전 물질 요소를 숙주 세포 내에서 발현시켜서 발현시킨다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1 유래 인공 염색체(PAC)와 같은 인공 염색체, λ파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스 등과 같은 파지를 포함한다. 벡터로 사용되는 동물 바이러스 종류는 레트로바이러스(렌티바이러스 포함), 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스), 폭스바이러스, 배큘로바이러스, 유두종바이러스, 유두종바이러스 바이러스(예를 들어, SV40)를 포함할 수 있다. 벡터는 프로모터 서열, 전사 개시 서열, 인핸서 서열, 선택 요소 및 리포터 유전자를 포함하여 발현을 제어하는 다양한 요소를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 복제 기점을 더 포함할 수 있다. 벡터는 바이러스 입자, 리포솜 또는 단백질 외피와 같이 세포로의 진입을 돕는 성분을 더 포함할 수 있지만, 이러한 물질에 국한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 “세포”는 통상적으로 본 발명의 상기 핵산 분자 또는 본 발명의 상기 벡터를 포함해 대상체 플라스미드 또는 벡터의 수용체일 수 있거나 수용체이었던 단일 세포, 세포계 또는 세포 배양물을 말한다. 세포는 단일 세포의 후손을 포함할 수 있다. 자연적, 우발적 또는 의도적인 돌연변이로 인해, 후손은 원래의 모세포와 반드시 완전하게 동일하지 않을 수 있다(전체 DNA 보완체의 형태 또는 게놈 상). 세포는 본 발명의 상기 벡터로 체외 형질 감염된 세포를 포함할 수 있다. 세포는 세균 세포(예를 들어, 대장균), COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, CHO-K1 세포, LNCAP 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, COS-1 세포, NS0 세포와 같은 효모 세포 또는 기타 진핵 세포일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 특정 실시 양태에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포이다.
본 발명에서, 용어 “면역접합체”는 통상적으로 상기 다른 제제(예를 들어, 화학요법제, 방사성 원소, 세포증식억제제 및 세포독성제)가 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단백질과 접합하여(예를 들어, 링커 분자를 통한 공유결합） 형성되는 접합체를 말하며, 그 접합체는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 통해 표적 세포의 항원에 특이적으로 결합하여, 상기 다른 제제를 표적 세포(예를 들어, 종양 세포)로 전달할 수 있다.
본 발명에서, 용어 “약학적 조성물”은 통상적으로 질병 또는 질환의 예방/치료에 사용되는 조성물을 말한다. 상기 약학적 조성물은 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질, 본 발명의 상기 핵산 분자, 본 발명의 상기 벡터 및/또는 본 발명의 상기 세포, 및 임의로 제약상 허용되는 보조제를 포함한다. 또한, 상기 약학적 조성물은 하나 이상의(제약상 유효한) 담체, 안정화제, 부형제, 희석제, 가용화제, 계면활성제, 유화제 및/또는 방부제의 적절한 제제를 더 포함할 수 있다. 조성물의 허용 가능한 성분은 사용되는 제량 및 농도에서 바람직하게는 수용체에게 무독성이다. 본 발명의 약학적 조성물은 액체, 냉동 및 동결 건조된 조성물을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "제약상 허용되는 담체"는 통상적으로 제약적으로 허용되는 벡터, 부형제 또는 안정화제를 포함하며, 이는 사용되는 제량 및 농도에서 이에 노출되는 세포 또는 포유동물에게 무독성이다. 생리학적으로 허용되는 벡터는 예를 들어 완충제, 항산화제, 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드, 단백질, 친수성 중합체, 아미노산, 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 킬레이트제, 당 알코올, 나트륨과 같은 조염 반대 이온, 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "특이적 결합” 또는 "특이성”은 통상적으로 표적과 항체 간의 결합이 분자(생체 분자 포함)의 이종 집단에 존재하는 상황에서 표적의 존재를 결정할 수 있는 것처럼 측정 가능하고 재현 가능한 상호 작용을 말한다. 예를 들어, 표적(에피토프일 수 있다)에 특이적으로 결합되는 항체는 다른 표적물에 결합하는 것보다 더 높은 친화성, 친화도, 용이성, 및/또는 더 큰 지속 시간으로 그 표적에 결합되는 항체일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 항체는 단백질의 에피토프에 특이적으로 결합하며, 상기 에피토프는 상이한 종의 단백질 중에서 보존적이다. 특정 실시 양태에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있으나 요구되지는 않는다.
본 발명에서, 용어 “대상체”는 통상적으로 고양이, 개, 말, 돼지. 젖소, 양, 토끼, 마우스, 랫 또는 원숭이를 포함하나 이에 국한되지 않는 인간 또는 비인간 동물을 말한다.
용어 "종양"은 통상적으로 새로운 병리학적 조직의 증식을 말한다. 종양 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 본 발명에서, 상기 종양은 양성 종양 및 악성 종양을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 종양은 고형 종향 및/또는 혈액 종양을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 종양은 암을 포함할 수 있다. 본 발명에서, 상기 종양의 예는 유방암을 포함할 수 있으나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 "비특이적 정전기적 결합이 없거나 비교적 약한 결합"은 통상적으로 상기 단리된 항원 결합 단백질이 비표적 분자에 대해 거의 비특이적 흡착 효과가 없음을 말한다. 예를 들어, SPR 방법을 사용해 상기 단리된 항원 결합 단백질과 비표적 분자의 비특이적 흡착 반응을 측정하고, Buffer 영향을 공제하면, 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질의 신호 강도는 20RU보다 작거나 근접한다. 일반적으로 신호 강도가 약 20RU, 약 19RU, 약 18RU, 약 17RU, 약 16RU, 약 15RU, 약 14RU, 약 13RU, 약 12RU, 약 11RU, 약 10RU, 약 9RU, 약 8RU, 약 7RU, 약 6RU, 약 5RU, 약 4RU, 약 3RU, 약 2RU 또는 약 1RU 이하와 같이 약 20RU 이하이면 항원 결합 단백질과 비표적 분자의 상호작용이 비교적 약하고, 신호 강도가 약 20RU보다 크면 항원 결합 단백질과 비표적 분자의 상호작용이 비교적 강하고, 신호 강도가 약 100RU보다 크면 항원 결합 단백질과 비표적 분자의 상호작용이 매우 강하다고 볼 수 있다.
본 발명에서, 관련된 단백질, 폴리펩티드 및/또는 아미노산 서열은, 그 상기 단백질 또는 폴리펩티드와 상동하거나 유사한 특성을 갖는 변이체 또는 상동체의 범위를 적어도 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, 상기 변이체는, 예를 들어 상기 단백질 및/또는 상기 폴리펩티드(예를 들어, CD73 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편)의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 또는 추가된 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 상기 기능성 변이체는 적어도 1개, 예를 들어 1-30개, 1-20개 또는 1-10개, 또 다른 예를 들어 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입을 통해 아미노산 변형을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 상기 기능성 변이체는 기본적으로 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 추가) 전의 상기 단백질 또는 상기 폴리펩티드의 생물학적 특성을 유지할 수 있다. 예를 들어, 상기 기능성 변이체는 변형 전의 상기 단백질 또는 상기 폴리펩티드의 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%의 생물학적 활성(예를 들어, 항원 결합 능력)을 유지할 수 있다. 예를 들어, 상기 치환은 보존적 치환일 수 있다.
본 발명에서, 상기 상동체는 상기 단백질 및/또는 상기 폴리펩티드(예를 들어, CD73 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 단편)의 아미노산 서열과 적어도 약 85%(예를 들어, 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상)의 서열 상동성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명에서, 상기 상동성은 통상적으로 두 개 이상 서열 사이의 상사성, 유사성 또는 관련성을 말한다. 하기의 방식을 통해 “서열 상동성 백분율”을 계산할 수 있다. 정렬할 두 개의 서열을 정렬창에 정렬하고, 두 서열 중에 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I） 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 존재하는 위치의 수를 확정해서 일치하는 위치의 수를 얻고, 일치하는 위치의 수를 정렬창의 총 위치 수(즉, 창 크기)로 나눈 후, 결과를 100으로 곱하여 서열 상동성 백분율을 얻는다. 서열 상동성 백분율을 확정하기 위한 정렬은 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같이 당업계에 알려진 다양한 방식으로 구현될 수 있다. 당업자는 정렬 중인 전장 서열 범위 내 또는 표적 서열 영역 내에서 최대 정렬 구현을 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 정렬에 사용되는 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 상기 상동성은 FASTA 및 BLAST 방법을 통해서도 측정될 수 있다. FASTA 알고리즘에 대한 설명은W.R．Pearson 및 D．J．Lipman의 “생물학 서열 정렬에 사용되는 개선된 도구”, 미국 국립과학원 회보(Proc．Natl．Acad．Sci.)，85：2444-2448, 1988 및 D．J．Lipman와 W．R．Pearson의 “빠르고 민감한 단백질의 상사성 검색”, Science, 227：1435-1441, 1989를 참조할 수 있다. BLAST 알고리즘에 대한 설명은 S.Altschul, W．Gish, W．Miller, E．W．Myers 및 D．Lipman의 “기본적 국부 정렬(alignment) 검색 도구”, 분자 생물학 저널, 215：403-410, 1990을 참조할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "포함"은 통상적으로 포함, 포괄, 함유 또는 내포의 의미를 말한다. 특정 경우에서, "~이다", "~로 구성되는" 의미를 나타내기도 한다.
본 발명에서, 용어 "약"은 통상적으로 명시된 수치에서 0.5% 내지 10% 이상 또는 이하의 범위 내로 변동하는 것을 말한다. 예를 들어, 명시된 수치에서 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10% 이상 또는 이하 범위 내로 변동한다.
단리된 항원 결합 단백질
상보성 결정 영역으로도 불리는 항체의 CDR은 가변 영역의 한 부위이다. 그 영역의 아미노산 잔기는 항원 또는 항원 에피토프와 접촉될 수 있다. 항체 CDR은 CCG, Kabat, Chothia, IMGT, Kabat/Chothia의 종합적 고려 등과 같은 다양한 코딩 시스템을 통해 결정될 수 있다. 이러한 코딩 시스템은 당업계에 널리 알려져 있으며, 구체적으로는. 예를 들어 http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html#kabatnum을 참조할 수 있다. 당업자는 항체의 서열 및 구조에 따라, 상이한 코딩 시스템을 사용해 CDR 영역을 결정할 수 있다. 상이한 코딩 시스템을 사용하면, CDR 영역에 차이가 있을 수 있다. 본 발명에서, 상기 CDR은 임의의 CDR 분할 방식에 따라 분할되어 수득된 CDR 서열을 포함할 수 있고, 이의 변이체를 포함할 수도 있으며, 상기 변이체는, 예를 들어, 1개 내지 30개, 1개 내지 20개 또는 1개 내지 10개, 또 다른 예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개 또는 9개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 삽입되는 것처럼 하나 이상의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 추가된 상기 CDR 변이체를 포함한다. 또 이의 상동체를 포함하며, 상기 상동체는 상기 CDR의 아미노산 서열과 적어도 약 85%(예를 들어, 적어도 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 그 이상)의 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 CDR은 IMGT 넘버링에 의해 결정된다.
한 측면에서, 본 발명은 중쇄 가변 영역 VH 내의 하나 이상의 CDR을 포함하는 단리된 항원 결합 단백질을 제공하며, 상기 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명의 상기 항원 결합 단백질은 임의의 방식으로 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 분할하여 수득된 CDR을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 HCDR3을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 HCDR2를 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 HCDR1을 포함할 수 있고, 상기 HCDR1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 HCDR1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 경쇄 가변 영역 VL 내의 하나 이상의 CDR을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 LCDR3을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 LCDR2를 더 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 LCDR1을 더 포함할 수 있고, 상기 LCDR1은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 상기 LCDR1은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질 HCDR1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 HCDR3은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR1은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 LCDR3은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 H-FR1을 포함할 수 있고, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단과 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있고, 상기 H-FR1은 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 H-FR1은 서열번호 7, 서열번호 15 및 서열번호 23 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 H-FR2를 포함할 수 있고, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1과 상기 HCDR2 사이에 위치할 수 있고, 상기 H-FR2는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 H-FR2는 서열번호 8 또는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 H-FR3을 포함할 수 있고, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2와 상기 HCDR3 사이에 위치할 수 있고, 상기 H-FR3은 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 H-FR3은 서열번호 9, 서열번호 17, 서열번호 24 및 서열번호 27 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 H-FR4를 포함할 수 있고, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단과 연결될 수 있고, 상기 H-FR4는 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 H-FR4는 서열번호 10 또는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4를 포함할 수 있다. 상기 단리된 항원 결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 43 및 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 23, 서열번호 16, 서열번호 24 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 23, 서열번호 16, 서열번호 27 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 L-FR1을 포함할 수 있고, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단과 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있고, 상기 L-FR1은 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 L-FR1은 서열번호 11, 서열번호 19 및 서열번호 25 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 L-FR2를 포함할 수 있고, 상기 L-FR2는 상기 LCDR1과 상기 LCDR2 사이에 위치할 수 있고, 상기 L-FR2는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 L-FR2는 서열번호 12 또는 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 L-FR3을 포함할 수 있고, 상기 L-FR3은 상기 LCDR2와 상기 LCDR3 사이에 위치할 수 있고, 상기 L-FR3은 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 L-FR3은 서열번호 13, 서열번호 21 및 서열번호 26 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 L-FR4를 포함할 수 있고, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단과 연결될 수 있고, 상기 L-FR4는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 L-FR4는 서열번호 14 또는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 단리된 항원 결합 단백질의 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 25, 서열번호 20, 서열번호 26 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 VH를 포함할 수 있고, 상기 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 및 서열번호 34 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 VL을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VL은 서열번호 29, 서열번호 31 및 서열번호 33 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 상기 VH 및 VL을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 VH는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 상기 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG 중쇄 불변 영역으로부터 유래될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 항체 중쇄 불변 영역을 포함하고, 상기 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역으로부터 유래된다. 본 발명에서, 상기 항체 중쇄 불변 영역은 이의 변이체, 상동체, 유사체를 더 포괄한다. 예를 들어, 상기 인간 IgG1 중쇄 불변 영역의 CH2는 항체 ADCC knock out（KO） 효과의 L234A 및 L235A（Eu numbering） 돌연변이를 갖는다. 예를 들어, 상기 항체 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 41, 서열번호 42 및 서열번호 43 및 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 7, 서열번호 8 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 15, 서열번호 16 및 서열번호 17 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 23, 서열번호 16, 서열번호 24 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 3, 서열번호 2 및 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 H-FR1, H-FR2, H-FR3 및 H-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 23, 서열번호 16 및 서열번호 27 및 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 VH는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 VH는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 VH는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 VH는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 항체 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 상기 항체 경쇄 불변 영역은 인간 Igκ 불변 영역으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 6, 서열번호 5 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 6, 서열번호 5 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 45, 서열번호 46, 서열번호 47 및 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 6, 서열번호 5 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 6, 서열번호 5 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 순차적으로 서열번호 6, 서열번호 5 및 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 L-FR1, L-FR2, L-FR3 및 L-FR4는 각각 순차적으로 서열번호 25, 서열번호 20, 서열번호 26 및 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 VL은 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 VL은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 VL은 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 단리된 항원 결합 단백질의 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 VH, VL, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 29으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 VH는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 VL은 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fv 단편, F（ab'）2, F（ab）2, scFv, di-scFv 및/또는 dAb를 포함한다.
특정 실시 양태에서, 상기 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및/또는 완전 인간 항체를 포함한다.
예를 들어, 상기 키메라 항체의 VH는 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 키메라 항체의 VL은 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 인간화 항체의 VH는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 인간화 항체의 VL은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 인간화 항체의 VH는 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 인간화 항체의 VL은 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 인간화 항체의 VH는 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 인간화 항체의 VL은 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 인간화 항체의 VH는 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 상기 인간화 항체의 VL은 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질은 이와 하나 이상의 보존적 서열 변형을 갖는 중쇄 및/또는 경쇄 서열을 포함할 수 있는 것에 유의해야 한다. 이른바 “보존적 서열 변형”은 항체 결합 특성에 분명한 영향을 미치거나 변경시키지 않는 아미노산 변형을 말한다. 이러한 보존적 변형에는 아미노산 치환, 추가 및 결실이 포함된다. 점 돌연변이 및 PCR 매개 돌연변이와 같이 당업계에 이미 알려진 표준 기술을 통해, 변형을 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질 내로 도입할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기를 사용해 치환되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 그룹은 당업계에 널리 알려져 있다. 이러한 아미노산 잔기 그룹은 염기성 측쇄(예를 들어, 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 전하를 띠지 않는 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 타이로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β-분지 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질의 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 그룹의 다른 아미노산 잔기를 사용해 치환될 수 있다. 당업자라면 일부 보존적 서열 변형이 항원 결합성을 사라지지 않게 함을 알 수 있으며, 구체적으로는 예를 들어, Brummell et al., （1993） Biochem 32:1180-8; de Wildt et al., （1997） Prot. Eng. 10:835-41; Komissarov et al., （1997） J. Biol. Chem. 272:26864-26870; Hall et al., （1992） J. Immunol. 149:1605-12; Kelley and O'Connell （1993） Biochem.32:6862-35; Adib-Conquy et al., （1998） Int. Immunol.10:341-6 and Beers et al., （2000） Clin. Can. Res. 6:2835-43을 참조할 수 있다.
본 발명의 상기 CD73 항원 결합 단백질은 당업계에 널리 알려진 다양한 측정을 통해 인식, 스크리닝 또는 특성화될 수 있다.
예를 들어, 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA), 면역 블롯팅(예를 들어, 웨스턴 블롯), 유세포 분석(예를 들어, FAGS), 면역 조직화학, 면역 형광 등과 같이 공개된 방법을 통해 본 발명의 항원 결합 단백질 또는 융합 단백질의 항원 결합 활성을 검정할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 CD73 또는 이의 기능적 활성 단편에 특이적으로 결합할 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 Biacore를 통해 친화도가 스크리닝된다. 상기 단리된 항원 결합 단백질은 3Х10-9M 이하의 KD로 CD73 단백질에 결합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 상기 항원 결합 단백질은 약 3Х10-9M 이하, 약 2Х10-9M 이하, 약 1Х10-9M 이하, 약 7Х10-10M 이하, 약 6Х10-10M 이하, 약 5Х10-10M 이하, 약 4Х10-10M 이하, 약 3Х10-10M 이하, 약 2Х10-10M 이하, 약 1Х10-10M 이하, 약 9Х10-11M 이하, 약 5Х10-11M 이하, 약 2Х10-11M 이하의 KD로 CD73에 결합될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명은 또한 항원 결합 단백질과 항원의 결합 활성의 측정에 FACS 방법의 사용도 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 상기 항원 결합 단백질은 0.3μg/mL 이하, 약 0.2μg/mL 이하, 약 0.1μg/mL 이하, 약 0.09μg/mL 이하, 약 0.08μg/mL 이하, 약 0.07μg/mL 이하, 약 0.06μg/mL 이하, 약 0.05μg/mL 이하, 약 0.04μg/mL 이하, 약 0.03μg/mL 이하, 약 0.02μg/mL 이하 또는 약 0.01μg/mL 이하의 EC50 값으로 세포 표면의 인간 CD73에 결합될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 상기 항원 결합 단백질은 0.4μg/mL 이하, 0.3μg/mL 이하, 약 0.2μg/mL 이하, 약 0.1μg/mL 이하, 약 0.09μg/mL 이하, 약 0.08μg/mL 이하, 약 0.07μg/mL 이하, 약 0.06μg/mL 이하, 약 0.05μg/mL 이하, 약 0.04μg/mL 이하, 약 0.03μg/mL 이하, 약 0.02μg/mL 이하 또는 약 0.01μg/mL 이하의 EC50 값으로 중쇄 CD73 단백질에 결합될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 CD73에 결합될 수 있다. 특정 경우에서, 본 발명의 상기 항원 결합 단백질은 또한 원숭이의 CD73과 교차 반응될 수 있다. 예를 들어, FACS를 통해 검출된다. 본 발명에서, "교차 반응"은 통상적으로 다른 종의 상동 단백질과 반응하는 항체의 특성을 말한다.
특정 실시 양태에서, 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질은 마우스 및/또는 랫의 CD73에 결합되지 않는다.
예를 들어, ELISA 방법을 통해 역가를 검출할 수 있다. 예를 들어, FACS 검출을 사용해 상기 단리된 항원 결합 단백질의 결합 활성 또는 기능적 활성을 검출할 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질에 대한 친화도를 검출할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 CD73의 효소 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 재조합 CD73에 대해 효소 활성 억제 효과를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 인간 CD73에 대해 효소 활성 억제 효과를 가질 수 있다. 본 발명의 상기 효소 활성은 당업계의 통상적인 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 상기 효소 활성의 검출은 CD73 항원 결합 단백질을 재조합 CD73 단백질과 균일하게 혼합하고 AMP 및 ATP를 첨가하며, CellTiter-Glo® 기질을 CellTiter-Glo® 완충액에 첨가하여 균일하게 혼합하고 실온 반응으로 평형화한 후, 전체 파장 검출을 수행한다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 약 0.1μg/Ml 이하, 약 0.09μg/mL 이하, 약 0.08μg/mL 이하, 약 0.07μg/mL 이하, 약 0.06μg/mL 이하, 약 0.05μg/mL 이하, 약 0.04μg/mL 이하, 약 0.03μg/mL 이하, 약 0.02μg/mL 이하, 약 0.01μg/mL 이하의 EC50 값으로 재조합 CD73 단백질의 효소 활성을 억제할 수 있다. 예를 들어, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 약 0.2μg/mL 이하, 약 0.1μg/mL 이하, 약 0.09μg/mL 이하, 약 0.08μg/mL 이하, 약 0.07μg/mL 이하, 약 0.06μg/mL 이하, 약 0.05μg/mL 이하, 약 0.04μg/mL 이하, 약 0.03μg/mL 이하, 약 0.02μg/mL 이하, 약 0.01μg/mL 이하의 EC50 값으로 세포막에서 CD73 단백질의 효소 활성을 억제할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 세포 표면 CD73의 세포내도입을 유도할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 형광 라벨링 방법을 통해 단백질의 세포내도입 상황을 판단할 수 있다. 예를 들어, 유세포 분석 기술을 사용해 세포의 형광 강도를 검출해 세포 표면 CD73의 세포내도입을 유도하는 상기 항원 결합 단백질의 효율을 얻을 수 있다. 특정 경우에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 약 50% 이상의 효율로 CD73의 세포내도입을 유도할 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 열안정성을 가질 수 있다. 예를 들어, 단백질 안정성 분석기를 사용해 본 발명의 항원 결합 단백질의 용융온도(Tm) 및/또는 응집온도(Tagg)를 검출할 수 있으며, 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질의 Tm 값은 약 65℃ 이상, 약 66℃ 이상, 약 67℃ 이상, 약 68℃ 이상, 약 69℃ 이상, 약 69.4℃ 이상, 약 70℃ 이상 또는 약 70.2℃ 이상이다. 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질의 Tagg 값은 약 65℃ 이상, 약 66℃ 이상, 약 66.4℃ 이상, 약 67℃ 이상, 약 68℃ 이상, 약 69℃ 이상, 약 70℃ 이상, 약 71℃ 이상, 약 72℃ 이상, 약 73℃ 이상, 약 74℃ 이상, 약 74.1℃ 이상, 약 75℃ 이상 또는 약 75.6℃ 이상이다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 비특이적 흡착 효과가 없거나 비교적 약할 수 있다. 예를 들어, SPR 방법을 사용해 상기 단리된 항원 결합 단백질과 비표적 분자의 비특이적 흡착 효과를 측정하고, Buffer 영향을 공제하면, 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질의 신호 강도는 20RU보다 작거나 근접한다. 일반적으로 신호 강도는 약 20RU, 약 19RU, 약 18RU, 약 17RU, 약 16RU, 약 15RU, 약 14RU, 약 13RU, 약 12RU, 약 11RU, 약 10RU, 약 9RU, 약 8RU, 약 7RU, 약 6RU, 약 5RU, 약 4RU, 약 3RU, 약 2RU 또는 약 1RU 이하로 볼 수 있다.
본 발명에서, 상기 단리된 항원 결합 단백질은 종양 성장을 억제하는 효과를 가질 수 있다.
폴리펩티드 분자, 핵산 분자, 벡터, 면역접합체, 세포 및 약학적 조성물
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질을 포함할 수 있는 폴리펩티드를 제공한다.
특정 실시 양태에서, 상기 폴리펩티드 분자는 융합 단백질을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질 또는 본 발명의 상기 폴리펩티드 분자를 코딩할 수 있는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, (i) 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭과 같은 시험관 내 증폭에 의한 생성, (ii) 클론 재조합에 의한 생성, (iii) 제한 효소 및 겔 전기영동에 의한 분리와 같은 정제, 또는 (iv) 화학적 합성과 같은 합성을 통한 방법을 통해 생성 또는 합성될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 핵산 분자를 포함할 수 있는 벡터를 제공한다. 또한, 상기 벡터는, 적절한 숙주 세포 내 및 적절한 조건 하에서 그 벡터를 선택하도록 허용하는 마커 유전자와 같은 다른 유전자를 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 코딩 영역이 적절한 숙주 내에서 정확하게 발현되도록 허용하는 발현 조절인자를 더 포함할 수 있다. 이러한 조절인자는 프로모터, 리보솜 결합 부위, 인핸서 및 유전자 전사 또는 Mrna 번역을 조절하는 다른 조절인자 등을 포함할 수 있는 것 같이 당업자에게 잘 알려진 것이다. 상기 벡터는 숙주 세포를 형질 전환, 형질 도입 또는 형질 감염시킴으로써, 이의 운반하는 유전 물질 요소를 숙주 세포 내에서 발현시켜서 발현시킨다. 상기 벡터는 폴리스미드, 코스미드, 바이러스, 파지 또는 예를 들어 유전공학에서 일반적으로 사용되는 기타 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 벡터는 발현 벡터이다. 또한, 상기 벡터는 바이러스 입자, 리포솜 또는 단백질 외피와 같이 세포로의 진입을 돕는 성분을 더 포함할 수 있지만, 이러한 물질에 국한되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질을 포함할 수 있는 면역접합체를 더 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질 또는 이의 단편을 화학요법제, 독소, 면역요법제, 이미징 프로브, 분광기 프로브 등과 같은 또 다른 제제에 연결시킬 수 있다. 그 연결은 하나 이상의 공유결합, 또는 비공유 상호작용을 통해 이루어질 수 있고, 킬레이트화 작용을 포함할 수 있다. 면역접합체를 형성하기 위해 다양한 링커(상기 링커는 당업계에 공개된 것일 수 있다)를 사용할 수 있다. 또한, 면역접합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 의해 발현될 수 있는 융합 단백질 형식으로 면역접합체가 제공될 수 있다. 상기 면역접합체는 또한 항체-약물접합체(ADC)를 포함할 수 있다. 적합한 약물은 세포 독소, 알킬화제, DNA 마이너 그루브 결합분자, DNA 삽입제, DNA 가교제, 히스톤 탈아세틸 효소 억제제, 핵수송 단백질 억제제, 단백질 분해효소 억제제, 국소이성질화효소I 또는 II형의 억제제, 열충격단백질 억제제, 티로신 키나아제 억제제, 항생제 및 항유사 분열제를 포함할 수 있다. ADC에서, 항체 및 치료제는 링커를 통해 가교될 수 있고, 그 링커는 펩티드 링커, 이황화 링커 또는 히드라존 링커와 같이 절단될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 핵산 분자, 본 발명의 상기 벡터 및/또는 본 발명의 상기 면역접합체를 포함할 수 있는 세포를 제공한다. 특정 실시 양태에서, 각 종의 또는 각 숙주 세포는 하나 이상의 본 발명의 상기 핵산 분자 또는 벡터를 포함한다. 특정 실시 양태에서, 각 종의 또는 각 숙주 세포는 복수 개(예를 들어, 2개 이상) 또는 복수 종(예를 들어, 2종 이상)의 본 발명의 상기 핵산 분자 또는 벡터를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 상기 벡터를 식물에서 유래된 세포, 진균 또는 효모 세포 등의 진핵 세포와 같은 상기 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 세포는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균), 효모 세포 또는 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, CHO-K1 세포, LNCAP 세포, HeLa 세포, 293T 세포, COS-1 세포, SP2/0 세포, NS0 세포 또는 골수종 세포와 같은 기타 진핵 세포이다. 본 발명의 상기 벡터는 전기천공, lipofectine 형질 감염, lipofectamine 형질 감염 등과 같이 당업계에 공개된 방법을 통해 상기 숙주 세포 내로 도입될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질, 본 발명의 상기 폴리펩티드 분자, 본 발명의 상기 면역접합체, 본 발명의 상기 핵산 분자, 본 발명의 상기 벡터 및/또는 본 발명의 상기 세포, 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있는 약학적 조성물을 더 제공한다.
본 발명에서, 상기 약학적 조성물은 하나 이상의(제약상 유효한) 보조제, 안정제, 부형제, 희석제, 가용화제, 계면활성제, 유화제 및/또는 방부제의 적절한 제제를 더 포함할 수 있다. 조성물의 허용 가능한 성분은 사용되는 제량 및 농도에서 바람직하게는 수용체에게 무독성이다. 본 발명의 약학적 조성물은 액체, 냉동 및 동결 건조된 조성물을 포함하나 이에 국한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 약학적 조성물은 하나 이상의 활성 화합물을 더 포함할 수 있으며, 통상적으로 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상호보완적인 활성을 갖는 활성 화합물이다. 이러한 약제의 유형 및 유효량은 예를 들어 제제에 존재하는 길항제의 양과 유형, 및 대상체의 임상적 매개변수에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에서, 상기 제약상 허용되는 담체는 약제 투여와 양립될 수 있는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함할 수 있고, 일반적으로 안전하고 무독성이다.
본 발명에서, 상기 약학적 조성물은 비경구, 경피, 강내. 동맥내, 척추 강내 및/또는 비강내 투여 또는 조직에 대한 직접 주사를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물은 주입 또는 주사를 통해 환자 또는 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 약학적 조성물의 투여는 정맥내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 진피내 투여와 같은 다양한 방식을 통해 수행될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 상기 약학적 조성물은 중단되지 않고 투여될 수 있다. 상기 중단되지 않는(또는 연속) 투여는 Wo2015/036583에 개시된 바와 같이, 환자가 착용하는 소형 펌프 시스템을 통해 환자 체내로 유입되는 치료제를 측정할 수 있다.
제조 방법
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 항원 결합 단백질의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은, 상기 항원 결합 단백질을 발현시키는 조건 하에, 본 발명의 상기 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적절한 배지, 적절한 온도 및 배양 시간 등을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업자라면 알 수 있는 것이다.
단일클론 항체의 제조에 적합한 임의의 방법은 모두 본 발명의 항원 결합 단백질의 제조에 사용될 수 있다. 예를 들어, 연결되거나 자연적으로 존재하는 CD73 또는 이의 단편으로 동물을 면역화할 수 있다. 보조제, 면역 자극제, 반복적 추가 면역 접종을 포함하는 적절한 면역 접종 방법을 사용할 수 있고, 하나 이상의 접근 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 하이브리도마 제조 방법을 사용해 이미 면역화된 마우스의 비장 세포를 수득하여 SP2/0 골수종 세포와 융합시키고, HAT를 통해 하이브리도마 세포주를 스크리닝할 수 있다.
임의의 적합한 형태의 CD73은 모두 CD73에 대해 특이적인 비인간 항체를 생성하고, 상기 항체의 생물학적 활성을 스크리닝하는 데 사용되는 면역원(항원)으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 유도 면역원은 천연 동종이량체, 또는 단일/다중 에피토프를 함유한 펩티드를 포함하는 전장의 성숙한 인간 CD73일 수 있다. 면역원은 단독으로 사용되거나, 또는 당업계에 공개된 하나 이상의 면역원성 증강제와 조합하여 사용할 수 있다.
키메라 인간화 항체는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE를 포함하는 어느 한 종류의 면역글로불린에서 선택될 수 있다. 본 발명에서, 항체는 IgG 항체이고, IgG1 서브타입이 사용될 수 있다. 하기 실시 예에 기재된 생물학적 검정을 사용해 항체를 스크리닝함으로써 필요한 불변 도메인 서열의 최적화를 구현함에 따라, 필요한 생물학적 활성을 생성할 수 있다. 마찬가지로, 어느 한 유형의 경쇄는 모두 본 명세서의 화합물 및 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물 및 방법에 κ 사슬 또는 이의 변이체를 사용할 수 있다.
방법 및 용도
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 면역접합체, 상기 세포 및/또는 상기 약학적 조성물의 약제 제조 중의 용도를 제공하며, 상기 약제는 질병 및/또는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 질병 및/또는 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 면역접합체, 상기 세포 및/또는 상기 약학적 조성물을 필요한 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 사용은 정맥내, 종양내, 복강내, 피하, 근육내, 국소 또는 진피내 투여와 같은 다양한 방식으로 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 면역접합체, 상기 세포 및/또는 상기 약학적 조성물은 질병 및/또는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 질병 및/또는 질환은 CD73 매개 질병 및/또는 질환일 수 있다.
본 발명에서, 상기 질병 및/또는 질환은 종양을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 종양은 고형 종양 및/또는 혈액 종양을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 질병 및/또는 질환은 유방암을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플에서 CD73을 검출하는 방법을 더 제공하며, 상기 방법은 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 세포, 상기 면역접합체 및/또는 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에서, 상기 샘플에서 CD73을 검출하는 방법은 생체 외 방법일 수 있다. 본 발명에서, 상기 샘플에서 CD73을 검출하는 방법은 비치료적 목적일 수 있다. 본 발명에서, 상기 샘플에서 CD73을 검출하는 방법은 진단 방법이 아니다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 면역접합체, 상기 세포 및/또는 상기 약학적 조성물을 포함하는, 샘플에서 CD73을 검출하는 제제 또는 키트를 더 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 단리된 항원 결합 단백질, 상기 폴리펩티드 분자, 상기 핵산 분자, 상기 벡터, 상기 면역접합체, 상기 세포 및/또는 상기 약학적 조성물의 키트 제조 중의 용도를 더 제공하며, 상기 키트는 샘플에서 CD73의 존재 및/또는 함량을 검출하는 데 사용된다.
어떤 이론에도 제한되지 않는 하기의 실시 예는 본 발명의 항원 결합 단백질, 제조 방법 및 용도 등의 설명을 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시 예
실시 예 1. 항-인간 CD73의 뮤린 항원 결합 단백질의 제조 방법
1.1. 뮤린 항원 결합 단백질을 생산하는 하이브리도마 세포의 제조.
뮤린 단일클론 항원 결합 단백질을 제조하는 방법은 Kohler 및 Milstein이 1975년 발명한 하이브리도마 제조 기술(Nature, 1975, 256：495-497)을 사용한다. 먼저 인간 CD73 His 태그 단백질(Met 1-Lys 547)을 면역 항원으로 사용하여 한 부위는 프로인드 보조제, Freund's Adjuvant, Complete （Sigma cat no.F5881, 별칭 : FCA） 및 Freund's Adjuvant, Incomplete(Sigma cat no.F5506, 별칭 ： FICA)를 사용해 면역화하고, 다른 부위는 Quick Antibody - Mouse 5w(바이오드래곤 cat no.KX0210041) 보조제를 사용해 여러 마리의 BALB/c, CD1 마우스에 대해 각각 다점 피하 면역화를 수행한다. 3차 면역 후 혈청을 취해 ELISA 방법으로 역가를 검출하고, FACS로 결합 활성 및 기능적 활성을 검출한다. 최종적으로 가장 우수한 마우스를 선별하고 비장 세포와 SP2/0 골수종 세포를 취해 융합시킨다. 하이브리도마 세포주를 HAT 스크리닝 후, 세포 배양 상청액을 취해 FACS 검출 방법으로 인간 CD73, 원숭이 CD73에 특이적으로 결합하는 단일클론 하이브리도마 세포주를 스크리닝한 후, 다시 CD73 효소 활성을 억제하는 단일클론 세포주를 스크리닝하고, 선별된 단일클론 세포주에 대해 친화도(Biacore)를 스크리닝하여 최종적으로 인간 CD73 항원 결합 단백질을 발현하는 단일클론 하이브리도마 세포주를 수득해 서열을 분석하며, 이의 기능적 활성 및 친화도 결과는 표 1과 같다.
표 1. 하이브리도마 스크리닝 데이터 목록
고처리량 스크리닝을 거쳐 최종적으로 수득된 단일클론 하이브리도마 세포주는 높은 친화도를 갖고, 인간 및 원숭이에 대해 모두 결합 활성을 가질 수 있으며, 동시에 CD73의 효소 활성에 대해 차단 기능을 갖는다.
실시 예 2. 항-CD73 항원 결합 단백질 가변 영역 유전자 시퀀싱 및 각 항원 결합 단백질의 제조
2.1. 하이브리도마 세포에서 항원 결합 단백질의 가변 영역 유전자 시퀀싱 및 클로닝
TAKARA의 5'RACE 기술 원리를 기반으로 하이브리도마 세포주 124A9에 의해 발현되는 마우스 항원 결합 단백질 가변 영역의 Cdna 서열을 클로닝한다. 간단하게 말하면, SMARTer 5'RACE 합성 키트(TAKARA，#634859)를 설명서에 따라 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 유전자 특이성 cDNA를 합성한다. PCR 프라이머로 cDNA 서열의 5' 및 3' 말단을 변형하며, 상기 프라이머는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA에서 각각 적절한 리더 서열을 추가하도록 설계되므로, 수득된 PCR 산물은 심리스 클로닝 방법을 통해 종래의 재조합 항원 결합 단백질이 발현하는 중쇄 벡터 pHB-Fc 및 경쇄 벡터 pHB-Cκ에 클로닝될 수 있다. pHB-Fc 발현 벡터는 인간 IgG1 중쇄 불변 영역 유전자 서열을 포함하며, 여기서 CH2는 항원 결합 단백질 ADCC 녹아웃(knock out，KO) 효과의 L234A 및 L235A(Eu numbering) 돌연변이를 가지며, pHB-Cκ벡터에는 인간 κ 경쇄 불변 영역 유전자 서열이 포함된다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 PCR 증폭 산물을 In-fusion 클로닝 제제(TAKARA, #639650)를 통해 발현 벡터에 클로닝하고, E.coli DH5α 대장균 수용성 세포(YEASTERN 바이오테크, #FYE607-80VL)로 형질전환한다. 단일클론 콜로니를 선별해 Sanger 및 NGS 시퀀싱을 수행하고, 분석을 거쳐 항원 결합 단백질 가변 영역 서열을 얻는다. 여기서 124A9에 의해 발현되는 CD73 항원 결합 단백질 가변 영역 서열은 하기와 같다.
124A9 VH 서열번호 28
QVQLQQPGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLDWIGMIHPNSGSTYYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYGSDYEWYFDVWGTGTTVTVSS
124A9 VL 서열번호 29
DIVMTQSQKFMSTSVGDRVSITCKASQNVRTAVVWYQQNPGQSPKALIYLASNRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHSEDLADYFCLQHWNYPYTFGGGTKLEIK
여기서, 밑줄 친 부분은 CDRs이다(IMGT 정의, 각 CDR 목록은 하기와 같다).
표 2. 뮤린 CD73 항원 결합 단백질 CDR 서열
2.2. 항원 결합 단백질의 발현
실시 예 2.1에서 수득된 발현 벡터를 대장균에 의해 증폭시키고, 내독소 제거 플라스미드 추출 키트(텐건 바이오테크(베이징) 유한회사 #DP117)로 충분한 양의 플라스미드를 제조하여 항원 결합 단백질의 일시적 형질감염 발현에 사용한다. 발현에 사용되는 숙주 세포는 CHO-S 세포(써모 피셔 사이언티픽, #R80007)이다. 제조를 통해 수득된 두 개의 중쇄 벡터를 각각 경쇄 벡터와 함께 폴리에테르이미드(PEI，Polysciences, # 24765-1)와 혼합하여 리포솜 복합체를 형성한 후, CHO-S 세포를 형질감염시키고, 인큐베이터에 넣어 5-7 동안 배양한다. 세포 배양 상청액을 원심분리하여 수집하고, Protein A 친화성 크로마토그래피 컬럼으로 정제하여 인간-마우스 항원 결합 단백질(124A9에 의해 발현되는 항원 결합 단백질 번호 900567)을 수득한다.
2.3. 항원 결합 단백질 900725-900728의 제조
항원 결합 단백질의 인간화는 ED 모델링 방법을 사용한다. 먼저 뮤린 항원 결합 단백질에 대해 3차원 구조를 모델링하여 최적 구조 모델을 선정한다. 구체적으로는 각각 Discovery Studio 및 Schrφdinger Antibody Modeling을 사용하고, 상동성 모델링 방법으로 5개 내지 10개의 구조 최적해를 선정하며, Loop 영역은 일반적으로 상동성 모델링 방법을 사용해 모델을 구축한다. CDR 아미노산 서열 정렬 결과가 50% Identity 미만인 경우, 처음부터 다시 모델링 방법을 사용해 CDR3 구조 모델을 구축한다. PDB BLAST를 사용해 가장 근접한 10개의 항체 결정 구조 모델(구조 분해능 2.5옹스트롱 이상)을 검색하고, 자동 모델링 모델을 비교하여 최적의 구조 모델을 선정한다. 그후 항원 결합 단백질의 가변 영역 서열을 NCBI IgBlast 데이터베이스에서 가용 서열과 비교하고, 동정 및 분석을 통해 최종적으로 CDR 이식 중쇄 및 경쇄 구축에 적합한 인간 유래 프레임워크 영역(FR 영역)을 결정한다.
변형 시, 인간 항체 FR 영역의 보존된 아미노산 잔기 및 항체 FR 영역의 중요한 아미노산 잔기에 따라 변형 부위가 설계되고, 본 발명의 항원 결합 단백질 900567의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에 대해 각각 인간화 돌연변이 설계를 수행하며, 설계된 인간화 서열은 항체 구조의 안정성에 영향을 미치지 않고, 항원 결합 단백질과 항원의 결합에 영향을 미치지 않고, 글리코실화 반응, 인산화 반응 등의 단백질 변형 부위를 도입하지 않고, 산화, 아미노화 등의 경향이 있는 부위를 도입하지 않고, 구조적 안정성 강화 등의 요구사항을 충족해야 한다. 이 900567 뮤린 항원 결합 단백질 서열에 대한 분석을 거쳐 총 3개의 인간화 중쇄 서열 및 3개의 인간화 경쇄 서열을 설계하고, 인간화 점 돌연변이 항원 결합 단백질 발현 플라스미드를 각각 CHO-S 세포를 통해 발현시키고, 정제한 후 인간화 항원 결합 단백질을 수득한다. ELISA, Biacore 및 유세포 분석 기술 등의 검출 방법을 사용해 인간화 항원 결합 단백질의 수용체 결합 능력, 기능 억제 활성 및 비특이적 결합 활성, 열안정성 등의 지표를 스크리닝하여 성능이 우수한 4개의 인간화 CD73 항원 결합 단백질을 수득한다. 수득된 인간화 항-CD73 항원 결합 단백질의 단백질 번호 및 해당되는 VH 및 VL 서열은 하기와 같다.
900725 및 900726 VH 서열번호 30
QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSGSTYYNEKFKGRATLTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYGSDYEWYFDVWGQGTTVTVSS
900725 및 900727 VL 서열번호 31
DIQMTQSPSSMSASVGDRVTITCKASQNVRTAVVWYQQKPGKAPKALIYLASNRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCLQHWNYPYTFGQGTKLEIK
900727 VH 서열번호 32
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSGSTYYAQKFQGRVTITVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYGSDYEWYFDVWGQGTTVTVSS
900726 및 900728 VL 서열번호 33
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQNVRTAVVWYQQKPGKAPKALIYLASNRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLQHWNYPYTFGQGTKLEIK
900728 VH 서열번호 34
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWIHWVRQAPGQGLEWIGMIHPNSGSTYYNEKFQGRVTMTVDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYYGSDYEWYFDVWGQGTTVTVSS
여기서, 밑줄 친 부분은 CDRs(IMGT 정의)이고, 900725, 900726, 900727 및 900728은 각각 4개의 항-CD73 인간화 항원 결합 단백질 번호이다..
실시 예 3. 항-CD73 항원 결합 단백질의 인간 CD73을 발현하는 세포에 대한 결합 활성 검출
항원 결합 단백질 900567, 900584, 900725, 900726, 900727 및 900728의 인간 CD73을 발현하는 세포(CHOK1-huCD73-3F4, 화보 바이오팜)에 대한 결합 활성을 검출하며, 여기서, 900584는 스크리닝된 CD73을 표적화하는 항원 결합 단백질이고, 900584의 VH의 아미노산 서열은 서열번호 35으로 표시되고, 900584의 VL의 아미노산 서열은 서열번호 36으로 표시된다.
모든 항원 결합 단백질은 모두 1%BSA를 함유한 PBS 용액(1%BSA/PBS)을 사용해 30μg/ml로 희석한 후, 다시 11개 구배로 3배 희석한다. 웰당 20μL를 96웰 U형 플레이트에 첨가하고, 동시에 음성 대조 그룹을 설정한다(1%BSA/PBS만 첨가). 대수 성장기 동안 인간 CD73을 발현하는 세포(CHOK1-huCD73-3F4, 화보 바이오팜) 현탁액을 취하여 원심분리해서(1000rpmХ5min) 배양액을 버리고, 1%BSA/PBS로 세포 밀도 1Х106/mL까지 재현탁한다. 웰당 20μL(2Х104개 세포)를 항-CD73 항원 결합 단백질이 있는 96웰 U형 플레이트에 첨가하여 상온에서 30min 동안 반응시킨다. 반응된 96웰 U형 플레이트를 1%BSA/PBS로 재현탁하고, 원심분리해서(300gХ3min) 상층액을 버리며, 이렇게 1회 세척하고, 1:200 희석된 PE-염소 항-인간-Fc（Jackson ImmunoResearch，#109-115-098）를 첨가하여 빛을 차단한 상온에서 15min 동안 반응시킨다. 반응된 96웰 U형 플레이트를 1%BSA/PBS로 재현탁하고, 원심분리해서(300gХ3min) 상층액을 버리며, 이렇게 3회 세척한다. 최종적으로 웰당 100μL의 1%BSA/PBS로 재현탁하고, 유세포 분석기(BD，#CantoⅡ)를 사용해 PE 채널의 형광 강도를 검출한다.
900567의 결합 활성 결과는 도 1 및 표 3을 참조하고, 900567, 900725, 900726 및 900728의 결합 활성 결과는 표 4를 참조한다. 결과에 따르면, 900567은 인간 CD73을 발현하는 세포(CHOK1-huCD73-3F4, 화보 바이오팜)에 대해 우수한 친화도를 갖고, 900725 및 900728은 인간 CD73을 발현하는 세포(CHOK1-huCD73-3F4, 화보 바이오팜)에 대한 친화도가 900567과 비슷한 것으로 나타났다.
표 3. 900567, 900584의 세포 표면 인간 CD73에 대한 결합 활성
표 4. 900567, 900725-900728의 세포 표면 인간 CD73에 대한 결합 활성
실시 예 4. 항-CD73 항원 결합 단백질의 재조합 CD73 단백질에 대한 결합 활성 검출
항-CD73 항원 결합 단백질 900567, 900725, 900726, 900727, 900728의 재조합 CD73 단백질(ACRO，# CD3-H52H7-100μg)에 대한 결합 활성을 검출한다.
ELISA 웰 플레이트를 2ug/ml의 CD73 단백질(ACRO，# CD3-H52H7-100μg) 30ul 용액으로 코팅하고, 섭씨 4도에서 밤새 둔다. 그후 PBST로 3회 세척하고, 5%의 MILK/PBS로 실온에서 1시간 동안 차단한 후 PBST로 3회 세척한다. 900567, 900725, 900726, 900727 및 900728을 모두 1%BSA를 함유한 PBS 용액(1%BSA/PBS)으로 10μg/ml까지 희석한 후, 다시 7개 구배로 4배 희석한다. 그후 희석된 항원 결합 단백질 용액을 ELISA 웰 플레이트에 웰당 30ul 첨가하고, 실온에서 30min 동안 배양한다. 배양이 완료된 후 PBST로 3회 세척한 후, Anti-human-IgG-Fc-HRP를 첨가하여 실온에서 50min 동안 배양하고, 배양이 완료된 후 BST로 3회 세척한다. TMB 용액을 첨가한 후, 2M HCl로 반응을 중지시키고 OD450 판독값을 검출한다.
900567, 900725, 900726, 900727, 900728의 재조합 CD73 단백질(ACRO，# CD3-H52H7-100μg)에 대한 결합 활성은 표 5 및 도 2와 같으며, 결과에 따르면 본 발명의 상기 항원 결합 단백질의 재조합 CD73 단백질에 대한 결합 친화도는 비슷한 것으로 나타났다.
표 5. 900567, 900725-900728의 재조합 CD73 단백질에 대한 결합 활성
실시 예 5. 항-CD73 항원 결합 단백질의 CD73 효소 활성 억제에 대한 효과 검출
본 발명의 상기 항원 결합 단백질을 PBS 용액으로 30μg/ml까지 희석한 후, 다시 6개 구배로 5배 희석한다. 대수 성장기 동안 인간 CD73을 발현하는 세포(CHOK1-huCD73-3F4, 화보 바이오팜) 현탁액을 취해 배지로 4X105/ml 세포 현탁액으로 제조하며, 웰당 100ul(약 40000개 세포)를 96웰 U형 플레이트에 첨가하고, 1500rpmХ5min으로 원심분리하여 상청액을 버린다. 그후 연속 희석된 항체로 세포를 재현탁하고, 웰당 100ul를 첨가하여 균일하게 혼합한 후, 37℃에서 20min 동안 배양한다. 배양 종료 후 1500rpm으로 5min 동안 원심분리하여 상청액을 버리고, 200ul/well PBS로 1회 세척한 후, 100ul/well 180uM AMP으로 재현탁하고, 37℃에서 60min 동안 배양한다. 배양이 종료된 후, 1500rpmХ5min로 원심분리하여 50ul/well 상청액을 취해 96웰 블랙 플레이트로 옮긴 후, 다시 50ul/well로 준비된 ATP를 첨가하여 균일하게 혼합하고, 37℃에서 15min 동안 반응시킨다. 마지막으로 CellTiter-Glo® Substrate를 CellTiter-Glo® buffer에 첨가하여 균일하게 혼합하고 실온으로 평형화한 후, 검출할 웰에 100ul/well로 첨가하고, 실온에서 10min 동안 반응시킨 후, 전체 파장에서 검출한다. 효소 활성의 백분율은 하기에 따라 평가한다. 잔여 CD73의 활성 :（CHOK1-huCD73-3F4 세포+Ab+ATP+AMP）-（ATP+AMP）/（ CHOK1-huCD73-3F4 세포+ATP+AMP）-（ATP+AMP）*100.
CD73의 세포(CHOK1-huCD73-3F4, 화보 바이오팜) 효소 활성 억제에 대한 900567, 900584의 효과는 도 3 및 표 6과 같다. 900567, 900725, 900728 및 MedImmune회사 유래 Oleclumab 양성 대조군 항체(Oleclumab의 중쇄 서열은 서열번호 39로 표시되고, 경쇄 서열은 서열번호 40으로 표시되며, 본 발명에서, 번호는 900759이다)의 효과는 도 4 및 표 7과 같으며, 결과에 따르면 인간화 항체 900725, 900728과 키메라 항체 900567의 세포막 상 CD73 효소 활성 억제에 대한 효과는 기본적으로 동일한 것으로 나타났다.
표 6. 900567, 900584의 세포막 상 CD73 효소 활성에 대한 억제
표 7. 900759, 900567 및 인간화 항체 900725, 900728의 세포막 상 CD73 효소 활성에 대한 억제
실시 예 6. 항-CD73 항원 결합 단백질의 인간 CD73 단백질에 대한 결합 친화도 검출
900567, 900725, 900726, 900727, 900728의 인간 CD73 단백질(제조업체 : ACRO Biosystems, 제품번호 : CD3-H52H7)에 대한 결합 동역학 실험은 Biacore(GE, 모델 T200)를 사용해 검출하며, 실험 완충액은 HBS-EP+（pH7.4）, protein A 칩(제조업체 : GE, 제품번호 : 29-1275-56)이다.
샘플 챔버와 유로 온도를 25℃로 설정하면, protein A 칩이 각각 키메라 항체 또는 인간화 항체를 리간드로 포획하여 약 100RU를 고정한다. 인간 CD73 단백질을 실험 완충액으로 50nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.12 nM, 1.57 nM의 일련의 농도로 희석하여 분석물질로 사용하고, 실험 완충액을 0농도 대조군으로 사용해 30μL/min 유속에서 120s 동안 결합, 600s 동안 해리시킨다. 10mM Glycine pH 1.5를 50μL/min 유속에서 60s 재생하여 다중 순환 동역학을 검출한다. 1:1 결합 모델을 사용하고, Fit local 모드를 선택하여 결합속도 상수(ka), 해리속도 상수(kd) 및 해리평형속도 상수(KD)를 피팅한다. 피팅 결과는 표 8과 같으며, 결과에 따르면 본 발명의 상기 항원 결합 단백질은 모두 인간 CD73 단백질에 결합하고, 인간 CD73 단백질에 결합하는 대부분의 항원 결합 단백질의 친화도는 뚜렷한 차이가 없는 것으로 나타났다.
표 8. 항-CD73 항원 결합 단백질 900567과 이의 인간화 항체의 인간 CD73 단백질에 대한 결합 친화도 검출
실시 예 7. 항-CD73 항원 결합 단백질의 다른 종(인간, 마우스, 랫, 원숭이) CD73 단백질에 대한 결합 친화도 검출
900567, 900725, 900726, 900727 및 900728의 Human(인간) CD73 단백질(제조업체 : ACRO Biosystems, 제품번호 : CD3-H52H7), Mouse(마우스) CD73/NT5E (제조업체 : ACRO Biosystems, 제품번호 : CD3-M52H9), Rat(랫) CD73(제조업체 : Novoprotein, 제품번호 : CB16) 및 Cynomolgus(원숭이) CD73(제조업체 : Novoprotein, 제품번호 : CI21)에 대한 결합 동역학 실험은 Biacore(GE, 모델 T200)를 사용해 검출하며, 실험 완충액은 HBS-EP+（pH7.4）, protein A칩(제조업체 : GE, 제품번호 : 29-1275-56)이다.
샘플 챔버와 유로 온도를 25℃로 설정하면, Protein A칩이 각각 항원 결합 단백질을 리간드로 포획하여 약 100RU를 고정한다. Human CD73 단백질/Cynomolgus CD73/Rat CD73/Mouse CD73을 각각 실험 완충액으로 50Nm, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.12 nM, 1.57 nM 일련의 농도로 희석하여 분석물질로 사용하고, 실험 완충액을 0농도 대조군으로 사용해 30μL/min 유속에서 120s 동안 결합, 600s 동안 해리시킨다. 10mM Glycine pH 1.5를 50μL/min 유속에서 60s 재생하여 다중 순환 동역학을 검출한다. 1:1 결합 모델을 사용하고, Fit local 모드를 선택하여 결합속도 상수(ka), 해리속도 상수(kd) 및 해리평형속도 상수(KD)를 피팅한다. 피팅 결과는 표 9와 같으며, 결과에 따르면 본 발명의 상기 항원 결합 단백질은 모두 인간 CD73, 원숭이 CD73(제조업체 : Novoprotein, 제품번호 : CI21)에 결합할 수 있고, 인간, 원숭이 CD73 단백질에 결합하는 대부분의 항원 결합 단백질의 결합 친화도는 뚜렷한 차이가 없으며, 동시에 모든 항원 결합 단백질이 모두 마우스(제조업체 : ACRO Biosystems, 제품번호 : CD3-M52H9) 및 랫(제조업체 : Novoprotein, 제품번호 : CB16)의 CD73 단백질에는 결합되지 않는 것으로 나타났다.
표 9. 항-CD73 항원 결합 단백질 900567과 이의 인간화 항원 결합 단백질의 마우스 CD73 단백질에 대한 결합 친화도 검출
실시 예 8. 항-CD73 항원 결합 단백질이 세포 표면에서 CD73 세포내도입을 유도하는 특성의 검출
본 실시 예는 본 발명의 상기 항원 결합 단백질이 CD73의 효소 활성을 차단하고 세포 표면에서 CD73의 내재화를 유도하는 이중 작용 매커니즘을 가지고 있음을 나타낸다. 구체적 조작은 하기와 같다. CD73 시리즈의 항원 결합 단백질을 PBS 용액으로 1μg/ml로 희석하고，각 농도를 2웰에 반복한다. 대수 성장기 내의 Calu6 세포를 취해 세포를 2Х105/ml 세포 현탁액으로 제조하고, 웰당 100μL(약 20000개 세포)를 96웰 U형 플레이트에 첨가하여 300gХ3min 동안 원심분리해 상청액을 버린다. 다시 희석된 항원 결합 단백질로 세포를 100μL /well로 재현탁하고, 균일하게 혼합한 후, 4℃에서 30min 동안 배양한다. 배양이 종료되면, 300gХ3min로 원심분리해 상청액을 버리고, 1%BSA로 재현탁한 후, 절반은 37℃로 배양하고 다른 절반은 4℃에 배양하며, 배양 시간은 5h이다. 배양이 종료되면, 해당 시간의 웰을 취해 300gХ3min로 원심분리해 상청액을 버리고, PE anti-huIgG Fc(1:200)를 첨가해 50μL/웰로 균일하게 혼합하여 4℃에서 30min 동안 반응시킨다. 배양이 종료되면 300gХ3min으로 2회 세척하고, 유세포 분석으로 형광 강도를 검출한다.
CD73 항원 결합 단백질이 세포 표면에서 CD73 세포내도입을 유도하는 검출 결과는 표 10 및 도 5와 같으며, 결과에 따르면 항-CD73 항원 결합 단백질 900567, 900725 및 900728은 모두 세포 표면에서 CD73 수용체의 세포내도입을 유도할 수 있는 것으로 나타났다.
표 10. 항-CD73 항원 결합 단백질의 세포 표면 CD73 세포내도입 유도 효율
실시 예 9. 항-CD73 항원 결합 단백질의 열안정성 검출
항-CD73 항원 결합 단백질의 열안정성 실험 단계는 하기와 같다. 단백질 안정성 분석기(UNcle,UNCHAINED LABS,US)를 사용해 항-CD73 항원 결합 단백질 900567, 900725, 900726, 900727 및 900728의 용융온도(Tm), 응집온도(Tagg)를 검출하며, Tm 및 Tagg의 가열 범위는 25℃에서 95℃이고, 가열 속도는 0.3℃이다.
항-CD73 항원 결합 단백질의 열안정성 검출 결과는 표 11과 같으며, 결과에 따르면 항-CD73 항원 결합 단백질 900567, 900725, 900726, 900727 및 900728의 열안정성 데이터 Tm 및 Tagg 값은 모두 65℃ 이상이고, 900725, 900726 및 900728의 3개 인간화 단백질의 열안정성이 우수한 것으로 나타났다.
표 11. 항-CD73 항원 결합 단백질의 열안정성 데이터 Tm, Tagg 값 검출
실시 예 10. 항-CD73 항원 결합 단백질의 비특이적 흡착 효과의 검출
SPR 방법을 사용해 항원 결합 단백질의 비표적 분자에 대한 비특이적 흡착 효과를 측정한다.
장비 :
제제 재료:
시리즈 센서 칩CM5(GE，#BR-1005-30)를 실온에 두고 20～30min 동안 평형화시키고, Biacore 8K(GE) 장비에 넣는다. 아민 커플링 키트(GE，#BR-1000-50)를 사용해 계란 유래 라이소자임 용액(Sigma，#L3790) 및 대두 유래 트립신 억제제 1-S형(Sigma，#T-2327)을 각각 CM5 칩에 고정한다. 주입 완충액은 HBS-EP（1X）(GE，#BR-1006-69)이고, 4개 평형화 주기를 설정한다. 평형 완충액으로 다중클론 토끼 항-리소자임(ABcam，Ab391), 트립신 억제제에 대한 항체(LifeSpan Biosciences，#LS-C76609), 키메라 항체 및 인간화 항체를 1000Nm로 희석하고, 유속 5μL/min, 주입 채널 1, 2 및 3, Flow Cell 1 및 2를 설정한다. 결합 시간은 10min이고, 해리 시간은 15min이다. 유속 50μL/min으로 재생하고, 먼저 0.85% 인산 용액(ProteOn，176-2260)으로 60s 동안 재생한 후, 다시 50mM 수산화나트륨 용액으로 30s 동안 재생한다.
카르복시메킬 덱스트란(Carboxymethyl Dextran)의 PI는 3.5이고, 트립신 억제제의 PI는 4.5이고, 라이소자임의 PI는 11.3으로, PH 7.4의 HBS-EP 완충액에서 카르복시메틸 덱스트란과 트립신 억제제는 비교적 강한 음전하를 갖고, 라이소자임은 비교적 강한 양전하를 갖는다. 검출 결과는 표 12와 같으며, 900567, 900725, 900726, 900727 및 900728의 신호 강도는 모두 20U보다 작거나 근접하기 때문에, 비특이적 정전기 결합 작용이 없는 것으로 간주될 수 있다.
표 12. 샘플의 비특이적 결합량 비교
참고 : 일반적으로 완충액의 영향을 공제한 후, 응답 값이 20RU 미만이면 상호작용이 비교적 약한 것으로 간주되어 무시될 수 있다. 20RU 이상이면 뚜렷한 상호작용이 있는 것으로 간주된다. 100RU 이상이면 상호작용이 매우 강한 것으로 간주된다.
실시 예 11. 항-CD73 항원 결합 단백질의 종양 체내 치료 효과 검출
(1) CD73 인간화 마우스를 이용해 MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 동물 모델을 구축하고 시험 대상 항체의 효능을 테스트한다. 먼저, MDA-MB-231(ATCC라이브러리) 세포(2E6개) 100μL를 CD73 인간화 마우스에 접종하여 CD73 인간화 마우스 MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 동물 모델을 구축하며, 종양 형성 마우스는 마우스의 부피 및 체중에 따라 그룹당 6마리씩 4개의 실험군으로 고르게 분배하고, 매주 2회 총 6회 복강내 투여한다. 구체적 투여 방법은 하기 표를 참조한다. 여기서 900759는 MedImmune 회사 유래 Oleclumab(MEDI 9447) 항체이고, 음성 대조군 900201은 TNP 표적화 항체이고, 900201의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 1로 표시되고, 경쇄 아미노산 서열은 서열번호 52로 표시된다. 결과에 따르면, 본 발명의 상기 항원 결합 단백질 900725, 900728 및 양성 대조군 900759 항체는 모두 MDA-MB-231 삼중 음성 유방암의 성장을 효과적으로 억제할 수 있고 효과가 상당하나, 음성 대조군 항체 900201은 종양의 성장을 억제할 수 없는 것으로 나타났다.
표 13. 투여 방법
(2) NPG 마우스를 사용하여 MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 동물 모델을 구축하고 시험 대상 항체의 효능을 테스트한다. 본 실험에 사용되는 인간 유방암 세포 MDA-MB-231은 10% FBS가 첨가된 L-15 배양기로 CO2가 없는 37℃ 인큐베이터에서 배양된다. 세포를 연속 10세대까지 배양하기 전, 약 5.0Х106 MDA-MB-231 세포를 100μL PBS에 현탁하고, 동일한 부피의 Matrigel과 균일하게 혼합한 후, 피하주사를 통해 NPG 인간화 마우스의 등 우측 겨드랑이 부근에 접종하며, 접종 부피는 약 200μL이다. 접종 전에 2-5% 이소플루란으로 마우스를 마취시킨다. 접종 당일 1.0Х107 PBMC(100μL)를 꼬리 정맥 주사하고, 종양이 평균 약 50-80 mm3로 성장하면, 18마리의 종양 보유 마우스를 종양의 부피와 체중에 따라 무작위로 6마리씩 3개 그룹으로 나눈다. 그룹화 당일 투여하며, 구체적인 투여 방법은 하기 표를 참조한다. 여기서, 900201은 음성 대조군 항체로 CD73 항원에 결합되지 않는다. Oleclumab는 아스트라제네카가 개발해 현재 임상 2상을 진행 중인 항-CD73 단일클론 항체이다. Oleclumab의 중쇄(HC) 아미노산 서열은 서열번호 53으로 표시되고, Oleclumab의 경쇄(LC) 아미노산 서열은 서열번호 54로 표시된다.
결과는 표 14 및 도 6과 같으며, oleclumab 및 900725는 MDA-MB-231 삼중 음성 유방암의 성장을 뚜렷하게 억제할 수 있고, 900725의 종양 억제 효과가 양성 대조군 oleculumab보다 우수하나, 음성 대조군 항체 900201은 종양의 성장을 억제할 수 없는 것으로 나타났다.
표 14. 투여 방법
실시 예 12. 항-CD73 항원 결합 단백질의 췌장암 체내 치료 효과 검출
NPG 마우스를 사용하여 BxPC-3 췌장암 동물 모델을 구축하고 시험 대상 항체의 효능을 테스트한다. 본 실험에 사용되는 인간 췌장암 세포 BxPC-3는 10% FBS가 첨가된RPMI-1640 배양기로 5% CO2가 포함된 37℃ 인큐베이터에서 배양된다. 세포를 연속 10세대까지 배양하기 전, 약 1Х107 BxPC-3 세포를 포함하는 PBS 100μL와 동일한 부피의 Matrigel을 균일하게 혼합한 후, 피하주사를 통해 18마리 NPG 마우스의 등 우측 겨드랑이 부근에 접종하며, 접종 부피는 약 200 μL이다. 접종 전에 2-5% 이소플루란으로 마우스를 마취시킨다. 접종 당일 1.0Х107 PBMC(100 μL)를 꼬리 정맥 주사하고, 종양이 평균 약 50-80mm3로 성장하면, 18마리의 종양 보유 마우스를 종양의 부피 및 체중에 따라 무작위로 6마리씩 3개 그룹으로 나눈다. 그룹화 당일 투여하며, 구체적 투여 방법은 하기 표 15를 참조한다. 여기서, 900543은 음성 대조군 항체로(900543은 900201의 ADCC 녹아웃 유형이고, 이의 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 55로 표시된다) CD73 항원에 결합되지 않는다. Oleclumab는 아스트라제네카가 개발해 현재 임상 2상을 진행 중인 항-CD73 단일클론 항체이다.
결과는 도 7과 같으며, oleclumab 및 900725는 BxPC-3 췌장암의 성장을 뚜렷하게 억제할 수 있고, 900725의 종양 성장 억제 효과가 양성 대조군 oleclumab보다 우수하나, 음성 대조군 항체 900543은 종양의 성장을 억제할 수 없는 것으로 나타났다.
표 15. 투여 방법
본 발명에 언급된 모든 논문은 모두 각 논문이 개별적으로 참고용으로 인용되는 것처럼 본 발명에 참고용으로 인용된다. 또한, 본 발명의 상기 개시된 내용을 읽은 후, 당업자는 본 발명을 다양하게 변경 또는 수정할 수 있으며, 이러한 등가의 형식은 모두 본 발명의 청구범위에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
Claims (67)
- 중쇄 가변 영역 VH 내의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 상기 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질.
- 제1항에 있어서,
HCDR3을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제2항 중 어느 한 항에 있어서,
HCDR2를 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
HCDR1을 포함하고, 상기 HCDR1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
경쇄 가변 영역 VL 내의 하나 이상의 CDR을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
LCDR3을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
LCDR2를 포함하고, 상기 LCDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
LCDR1을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
H-FR1을 포함하고, 상기 H-FR1의 C-말단은 상기 HCDR1의 N-말단과 직접적 또는 간접적으로 연결되고, 상기 H-FR1은 서열번호 41로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제9항에 있어서,
상기 H-FR1은 서열번호 7, 서열번호 15 및 서열번호 23 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제4항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
H-FR2를 포함하고, 상기 H-FR2는 상기 HCDR1과 상기 HCDR2 사이에 위치하고, 상기 H-FR2는 서열번호 42로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제11항에 있어서,
상기 H-FR2는 서열번호 8 또는 서열번호 16으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제3항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
H-FR3을 포함하고, 상기 H-FR3은 상기 HCDR2와 상기 HCDR3 사이에 위치하고, 상기 H-FR3은 서열번호 43으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제13항에 있어서,
상기 H-FR3은 서열번호 9, 서열번호 17, 서열번호 27 및 서열번호 27 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
H-FR4를 포함하고, 상기 H-FR4의 N-말단은 상기 HCDR3의 C-말단과 연결되고, 상기 H-FR4는 서열번호 44로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제15항에 있어서,
상기 H-FR4는 서열번호 10 또는 서열번호 18로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
L-FR1을 포함하고, 상기 L-FR1의 C-말단은 상기 LCDR1의 N-말단과 직접적 또는 간접적으로 연결되고, 상기 L-FR1은 서열번호 45로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제17항에 있어서,
상기 L-FR1은 서열번호 11, 서열번호 19 및 서열번호 25 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제8항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
L-FR2를 포함하고, 상기 L-FR2는 상기 LCDR1과 상기 LCDR2 사이에 위치하고, 상기 L-FR2는 서열번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제19항에 있어서,
상기 L-FR2는 서열번호 12 또는 서열번호 20으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제7항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
L-FR3을 포함하고, 상기 L-FR3은 상기 LCDR2와 상기 LCDR3 사이에 위치하고, 상기 L-FR3은 서열번호 47로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제21항에 있어서,
상기 L-FR3은 서열번호 13, 서열번호 21 및 서열번호 26 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제6항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
L-FR4를 포함하고, 상기 L-FR4의 N-말단은 상기 LCDR3의 C-말단과 연결되고, 상기 L-FR4는 서열번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제23항에 있어서,
상기 L-FR4는 서열번호 14 또는 서열번호 22로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하며, 상기 HCDR1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 LCDR1은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하며, 상기 HCDR1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR2는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 HCDR3은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR1은 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR2는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 LCDR3은 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
VH를 포함하고, 상기 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제28항에 있어서,
상기 VH는 서열번호 28, 서열번호 30, 서열번호 32 및 서열번호 34 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
VL을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제30항에 있어서,
상기 VL은 서열번호 29, 서열번호 31 및 서열번호 33 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
VH 및 VL을 포함하며, 상기 VH는 서열번호 49로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VL은 서열번호 50으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
하기의 어느 하나로 구성된 군에서 선택된 VH 및 VL를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질.
1) 서열번호 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH, 서열번호 29로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL,
2) 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL,
3) 서열번호 30으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL,
4) 서열번호 32로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH, 서열번호 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL, 및
5) 서열번호 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VH, 서열번호 33으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 상기 VL. - 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 중쇄 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제34항에 있어서,
상기 항체 중쇄 불변 영역은 인간 항체 중쇄 불변 영역에서 유래되는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제34항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG 중쇄 불변 영역에서 유래되는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG1 중쇄 불변 영역에서 유래되는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 중쇄 불변 영역은 서열번호 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 경쇄 불변 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제39항에 있어서,
상기 항체 경쇄 불변 영역은 인간 Igκ 불변 영역에서 유래되는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제39항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체 경쇄 불변 영역은 서열번호 38로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제42항에 있어서,
상기 항원 결합 단편은 Fab, Fab', Fv 단편, F（ab'）2, F（ab）2, scFv, di-scFv 및/또는 dAb를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제42항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 항체는 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 완전 인간 항체로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
CD73 또는 이의 기능적 활성 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제45항에 있어서,
상기 CD73은 인간 CD73 및/또는 원숭이 CD73을 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
CD73의 효소 활성을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
세포 표면에서 CD73의 세포내도입을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
용융온도(Tm) 및/또는 응집온도(Tagg)가 65℃이상인 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
비특이적 흡착 효과가 없거나 비교적 약한 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
종양의 성장을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 단리된 항원 결합 단백질. - 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 상기 단리된 항원 결합 단백질을 포함하는 폴리펩티드 분자.
- 제52항에 있어서,
융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드 분자. - 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 상기 단리된 항원 결합 단백질 또는 제52항 내지 제53항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩티드 분자를 코딩하는 핵산 분자.
- 제54항의 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 상기 단리된 항원 결합 단백질을 포함하는 면역접합체.
- 제54항의 상기 핵산 분자, 제55항의 상기 벡터 및/또는 제56항의 상기 면역접합체를 포함하는 세포.
- 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 상기 단리된 항원 결합 단백질, 제52항 내지 제53항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩티드 분자, 제54항의 상기 핵산 분자, 제55항의 상기 벡터, 제56항의 상기 면역접합체 및/또는 제57항의 상기 세포, 및 임의로 제약상 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제51중 어느 한 항의 상기 단리된 항원 결합 단백질의 제조 방법으로,
상기 방법은 상기 단리된 항원 결합 단백질이 발현되는 조건 하에 제57항의 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 질병 및/또는 질환의 예방 및/또는 치료용 약제 제조에 있어서 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항의 상기 단리된 항원 결합 단백질, 제52항 내지 제53항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩티드 분자, 제54항의 상기 핵산 분자, 제55항의 상기 벡터, 제56항의 상기 면역접합체, 제57항의 상기 세포 및/또는 제58항의 상기 약학적 조성물의 용도.
- 제60항에 있어서,
상기 질병 및/또는 질환은 CD73에 의해 매개되는 것을 특징으로 하는 용도. - 제60항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 질병 및/또는 질환은 종양을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도. - 제62항에 있어서,
상기 종양은 고형 종양 및/또는 혈액 종양을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도. - 제60항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 질병 및/또는 질환은 유방암을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도. - 샘플에서 CD73을 검출하는 방법으로,
상기 방법은 제1항 내지 제51항 어느 한 항의 상기 단리된 항원 결합 단백질, 제52항 내지 제53항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩티드 분자, 제54항의 상기 핵산 분자, 제55항의 상기 벡터, 제56항의 상기 면역접합체, 제57항의 상기 세포 및/또는 제58항의 상기 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제51항 어느 한 항의 상기 단리된 항원 결합 단백질, 제52항 내지 제53항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩티드 분자, 제54항의 상기 핵산 분자, 제55항의 상기 벡터, 제56항의 상기 면역접합체, 제57항의 상기 세포 및/또는 제58항의 상기 약학적 조성물을 포함하는, 샘플에서 CD73을 검출하는 제제 또는 키트.
- 샘플에서 CD73의 존재 및/또는 함량을 검출하는 데 사용되는 키트 제조에 있어서 제1항 내지 제51항 어느 한 항의 상기 단리된 항원 결합 단백질, 제52항 내지 제53항 중 어느 한 항의 상기 폴리펩티드 분자, 제54항의 상기 핵산 분자, 제55항의 상기 벡터, 제56항의 상기 면역접합체, 제57항의 상기 세포 및/또는 제58항의 상기 약학적 조성물의 용도.
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