CN116271033A - 一种以sqle基因或蛋白为靶点治疗克唑替尼肝脏毒性的药物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种以SQLE基因或蛋白为靶点治疗克唑替尼肝脏毒性的药物，属于医药技术领域。所述药物通过下调SQLE基因的表达或SQLE蛋白的累积逆转克唑替尼肝脏毒性。本发明通过下调SQLE可以有效逆转克唑替尼引起的肝实质细胞凋亡，揭示了SQLE基因是克唑替尼导致肝脏损伤的关键基因，为干预克唑替尼引起的肝毒性提供了新的预防和治疗靶标。本发明提出SQLE可以通过自噬通路发生降解，为目前寻找药物引起肝毒性的干预策略提供了新的方向，一定程度上解决临床上可用干预药物少、机制单一的现状。干预药物通过下调SQLE逆转克唑替尼肝脏毒性，扩大了克唑替尼临床应用价值。

Description

一种以SQLE基因或蛋白为靶点治疗克唑替尼肝脏毒性的药物

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及SQLE基因或SQLE蛋白为靶点在制备治疗克唑替尼肝脏毒性药物中的应用。

背景技术

克唑替尼(Crizotinib，PF-02341066)是一种口服的竞争性酪氨酸激酶抑制剂，其靶点包括重组的ALK、异常扩增的c-MET以及重组的ROS1，于2011年被美国FDA批准用于治疗EML4-ALK融合基因突变的局部晚期的非小细胞肺癌以及ROS1阳性进展的晚期非小细胞肺癌的治疗。

尽管在临床应用中克唑替尼展现出良好的抗肿瘤疗效，但其带来严重的肝脏毒性也越来越引起人们的重视。根据FDA的报告显示，在服用克唑替尼用于治疗后，患者的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)升高五倍以上的发生率分别为11.2％和5.7％，甚至有2名患者因严重的肝脏毒性而死亡。目前针对其肝脏毒性的干预策略为停药或减药，但也有临床报道显示，一位62岁的女性患者在给予克唑替尼后24天出现明显的急性肝衰竭症状，即使采取了停药策略并辅以辅助治疗，病人仍在40天时死亡(van Geel RM,et al.,Crizotinib-induced fatal fulminant liver failure.Lung Cancer,2016.93:p.17-9.)。

因此，为克唑替尼诱发的肝脏毒性提供新的预防和治疗靶点是目前较为迫切的需求。

角鲨烯环氧酶(SQLE)在胆固醇合成途径中催化鲨烯碳碳双键的环氧化作用后产生2，3-氧鲨烯，被认为是固醇生物合成的限速酶。有报道显示，SQLE可以作为非酒精性脂肪肝病治疗的新型有效靶点，其靶向治疗可为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)带来显著的益处，同时该蛋白也可以作为血清标志物筛查辅助诊断NASH。但目前SQLE蛋白与克唑替尼肝脏毒性之间的关系尚无文献报道，有待进一步研究。

自噬激活剂可以通过激活自噬降解途径，减少药物作用下功能蛋白异常的累积，从而减轻药物对细胞的杀伤作用。有研究报道，自噬激活剂对肝实质细胞凋亡等存在一定保护作用(Chen Y,et al.Dihydromyricetin protects against liver ischemia/reperfusion induced apoptosis via activation of FOXO3a-mediatedautophagy.Oncotarget,2016Nov 22；7(47):76508-76522)。

但目前尚无自噬激活剂治疗SQLE相关疾病或损伤的报道。

发明内容

本发明的目的在于通过探究与克唑替尼诱发肝脏毒性相关的基因/蛋白，以此作为预防和治疗克唑替尼肝脏毒性的作用靶点，筛选用于治疗克唑替尼肝脏毒性副反应的药物，解决克唑替尼用药存在的肝脏毒副作用，扩大克唑替尼的临床应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了以SQLE基因或SQLE蛋白为靶点在制备治疗克唑替尼肝脏毒性药物中的应用，所述药物下调SQLE基因表达或SQLE蛋白累积。所述SQLE基因的核苷酸序列如SEQID No.1所示，所述SQLE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明研究发现，克唑替尼可抑制肝实质细胞中SQLE蛋白的降解，导致SQLE蛋白在肝实质细胞中累积，且克唑替尼作用与过表达SQLE均会加重肝实质细胞的凋亡，提示SQLE蛋白的累积是克唑替尼诱发肝脏毒性的关键原因，SQLE可能是预防或治疗克唑替尼诱发肝脏毒性的潜在靶点。因此，可将抑制SQLE基因/蛋白的表达作为干预克唑替尼肝脏毒性的手段。

本发明研究中采用RNA干扰技术使得肝实质细胞中SQLE下调表达，进而逆转克唑替尼引起的肝实质细胞凋亡，具体表现为使用siRNA后，克唑替尼引起肝实质细胞的凋亡减少，凋亡相关蛋白cleaved-PARP显著下调。因此，本发明为干预克唑替尼引起的肝毒性提供了新的治疗靶点。针对SQLE基因开发相应的敲低该基因表达的药物制剂，所述药物通过下调SQLE基因的表达实现治疗克唑替尼引起肝毒性副反应的目的。

优选的，所述药物包含靶向SQLE基因的siRNA。针对SQLE基因的siRNA能够抑制SQLE的表达，进而逆转克唑替尼诱发的肝脏毒性。

具体的，所述siRNA的核苷酸序列为：5’-AACAUGAUAACCACCCGGCTT-3’。

本发明还提供了SQLE基因或SQLE蛋白作为靶点在筛选治疗克唑替尼肝脏毒性药物中的应用。

具体的，利用细胞或动物模型筛选促进SQLE降解的药物，通过测定SQLE蛋白表达水平来评判待测药物活性。

本发明研究发现，合用自噬激活剂可以显著下调由克唑替尼引起的SQLE累积并逆转克唑替尼引起的肝实质细胞的凋亡。因此，本发明提供了自噬激活剂在干预克唑替尼引起的肝毒性方面的新用途。所述药物通过降低SQLE蛋白的累积实现治疗克唑替尼引起肝毒性副反应的目的。

本发明的另一个目的是提供自噬激活剂在制备治疗SQLE蛋白异常表达引起的疾病或损伤的药物中的应用。

本发明经研究证明，自噬激活剂可显著降低克唑替尼引起的肝实质细胞中SQLE蛋白的累积，表明自噬通路可作为调控SQLE蛋白降解的关键通路。因此，自噬激活剂可用于治疗因SQLE蛋白异常表达引起的疾病或损伤。

进一步的，所述疾病或损伤为SQLE蛋白累积引起的肝脏疾病。

更进一步的，所述疾病或损伤为克唑替尼诱发的肝脏毒性反应。所述自噬激活剂通过与克唑替尼联合用药可下调克唑替尼引起的SQLE蛋白累积。

所述自噬激活剂包括但不限于：雷帕霉素、二甲双胍或其药学上可接受的盐。

进一步的，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

所述药物的制剂形式可以为口服固体制剂、口服液体制剂、注射液、冻干粉针剂、大输液剂型、贴剂、软膏剂、凝胶剂、软胶囊剂或栓剂。

本发明还提供了一种抗肿瘤联合用药物组合物，包括克唑替尼作为活性成分的第一制剂，以及自噬激活剂作为活性成分的第二制剂。

所述药物组合物用于治疗非小细胞肺癌的联合用药，尤其是用于制备治疗EML4-ALK融合基因突变的局部晚期的非小细胞肺癌或ROS1阳性进展的晚期非小细胞肺癌的药物。

本发明具备的有益效果：

(1)本发明提供了SQLE基因或SQLE蛋白作为靶点在制备治疗克唑替尼肝脏毒性药物中的应用，具体的，本发明提供了靶向SQLE基因的siRNA或靶向SQLE蛋白的自噬激活剂作为逆转克唑替尼肝脏毒性药物，所述药物通过下调SQLE基因的表达或SQLE蛋白的累积逆转克唑替尼肝脏毒性。

(2)本发明研究发现下调SQLE可以有效逆转克唑替尼引起的肝实质细胞凋亡，揭示了SQLE基因是克唑替尼导致肝脏损伤的关键基因，为干预克唑替尼引起的肝毒性提供了新的预防和治疗靶标。在临床上，靶向SQLE的siRNA分子可以在治疗和干预克唑替尼引起肝毒性中发挥重要作用。

(3)本发明首次提出了SQLE可以通过自噬通路发生降解，为目前寻找药物引起肝毒性的干预策略提供了新的方向，一定程度上解决临床上可用干预药物少、机制单一的现状。

附图说明

图1为克唑替尼和SQLE过表达质粒对SQLE蛋白和肝实质细胞HL-7702的影响，其中A为克唑替尼不同作用浓度下的影响，B为克唑替尼不同作用时间下的影响，C为SQLE过表达质粒的影响。

图2为SQLE基因特异的siRNA对克唑替尼导致肝实质细胞HL-7702凋亡的影响。

图3为克唑替尼对小鼠肝脏SQLE转录的影响和合用蛋白合成抑制剂放线菌素对SQLE蛋白水平的影响，其中A为转录水平，B为蛋白水平。

图4为合用自噬激活剂、抑制剂对SQLE蛋白表达水平的影响，其中A为合用氯喹，B为合用雷帕霉素。

图5为合用自噬激活剂二甲双胍对SQLE蛋白表达水平的影响。

图6为合用自噬激活剂对克唑替尼导致肝实质细胞HL-7702凋亡的影响，其中A为合用雷帕霉素，B为合用盐酸二甲双胍。

图7为合用盐酸二甲双胍对克唑替尼诱导小鼠体重增长缓慢以及肝重/体重比值升高的影响，其中A为体重增长，B为肝重/体重比值。

图8为合用盐酸二甲双胍对克唑替尼诱导小鼠肝脏损伤的影响。

图9为合用盐酸二甲双胍对克唑替尼诱导小鼠转氨酶上调的影响，其中A为ALT，B为AST。

图10为合用盐酸二甲双胍对克唑替尼诱导小鼠肝脏SQLE蛋白累积的影响，其中A为western blot结果，B为定量分析结果。

图11为肝脏切片免疫组织化学染色法检测合用盐酸二甲双胍对SQLE蛋白累积的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。以下实施例仅用于说明本发明，不用来限制本发明的适用范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

C57BL/6J小鼠购买自北京维通利华实验动物技术有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购买自上海国药集团；人正常肝实质细胞株HL-7702购自广州吉妮欧生物科技有限公司；SQLE抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；β-Actin抗体购自杭州戴格生物技术有限公司；cleaved-PARP抗体购自杭州华安生物技术有限公司；氯喹购自上海陶素生化科技有限公司；雷帕霉素购自上海陶素生化科技有限公司；siRNA购自上海吉玛制药有限公司，negative control(NC)正义链序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；siSQLE正义链为5’-AACAUGAUAACCACCCGGCTT-3’；转染试剂

购自Polyplus Transfection公司。

克唑替尼，CAS号为877399-52-5，化学名为3-[(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙氧基]-5-[1-(哌啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]吡啶-2-胺，分子式为C₂₁H₂₂Cl₂FN₅O，分子量为450.34，购买自上海陶素生化科技有限公司。结构式如下：

盐酸二甲双胍，CAS号为1115-70-4，分子式为C₄H₁₂ClN₅，分子量为165.62，购买自上海陶素生化科技有限公司。结构式如下：

实施例1

将人正常肝实质细胞HL-7702以8万/孔的密度种于12孔板中，给予不同浓度的克唑替尼(0、1.5、3和4.5μM)作用24h或3μM克唑替尼作用不同时间(0、6、12和24h)，收取细胞，提取蛋白并定量。

将人正常肝实质细胞HL-7702以15万/孔的密度种于12孔板中，过夜贴壁稳定后，将SQLE过表达质粒(原始载体：pCDNA3.0-3'FLAG，SQLE编码序列的Gene ID:6713)以及阴性对照vector，通过jetPRIME转染试剂将其导入HL-7702细胞中，24h后收取细胞，提取蛋白并定量。

用western blot进行蛋白水平检测，结果如图1所示。与对照组相比，随着作用浓度和时间增加，克唑替尼会显著上调小鼠肝脏中cleaved-PARP、SQLE蛋白水平，提示克唑替尼会引起细胞凋亡和SQLE蛋白累积(图1A、B)。在细胞内过表达SQLE后，细胞凋亡蛋白cleaved-PARP水平显著增加(图1C)，提示SQLE可能是克唑替尼引起细胞凋亡的关键蛋白。

实施例2

将人正常肝实质细胞HL-7702以8万/孔的密度种于12孔板中，过夜贴壁稳定后，将靶向SQLE的siRNA(正义链为5’-AACAUGAUAACCACCCGGCTT-3’)以及阴性对照NC(正义链为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’)，利用jetPRIME转染试剂将其导入HL-7702细胞中，表达稳定后，给予3μM克唑替尼作用24h后收取细胞，提取蛋白并定量，随后用western blot进行蛋白水平检测。

结果如图2所示，敲低SQLE后再给予克唑替尼可以逆转药物引起的SQLE蛋白水平上升，同时细胞凋亡蛋白cleaved-PARP水平有所下降，说明靶向SQLE的siRNA可以通过逆转克唑替尼引起的SQLE蛋白累积从而减少细胞的凋亡。

实施例3

12只雄性C57BL/6J小鼠，随机分成2组，分别为对照组和克唑替尼组，每组6只，以灌胃的方式给药。克唑替尼给予的剂量为100mg/kg/day，对照组用0.4％的CMC-Na代替，连续给药6周后。剖取肝脏，将部分肝脏组织裂解、破碎，取裂解液充分裂解后，考察小鼠肝脏组织中SQLE转录水平。

将人正常肝实质细胞HL-7702以15万/孔的密度种于12孔板中，过夜贴壁稳定后，同一时间给予3μM克唑替尼，6h后换液，并给予10μg/mL蛋白合成抑制剂放线菌酮作用不同时间(0、0.5、1、2、4和6h)，收取细胞，提取蛋白并定量，随后用western blot进行蛋白水平检测。

结果如图3所示，小鼠肝脏中SQLE转录水平没有显著差异(图3A)，在蛋白合成抑制剂放线菌酮的作用下，发现克唑替尼可延长SQLE的半衰期(图3B)，提示克唑替尼可以抑制SQLE的降解。

实施例4

将人正常肝实质细胞HL-7702以15万/孔的密度种于12孔板中，过夜贴壁稳定后，设置6个组，分别为对照组、克唑替尼组、氯喹组、克唑替尼+氯喹组、雷帕霉素组、克唑替尼+雷帕霉素组。作用24h后收取细胞，提取蛋白并定量，随后用western blot进行蛋白水平检测。

结果如图4所示，氯喹对溶酶体功能的阻断加重克唑替尼诱导的SQLE蛋白累积(图4A)，而自噬激活剂雷帕霉素可以下调克唑替尼导致的SQLE蛋白累积(图4B)。

实施例5

将人正常肝实质细胞HL-7702以15万/孔的密度种于12孔板中，过夜贴壁稳定后，设置4个组，分别为对照组、克唑替尼组、盐酸二甲双胍组、克唑替尼+盐酸二甲双胍组。作用24h后收取细胞，提取蛋白并定量，随后用western blot进行蛋白水平检测。

结果如图5所示，盐酸二甲双胍可以下调克唑替尼导致的SQLE蛋白累积。

如图6所示，克唑替尼引起肝实质细胞凋亡在合用自噬激活剂雷帕霉素(图6A)和盐酸二甲双胍(图6B)后被显著逆转。

实施例6

一、20只雄性C57BL/6J小鼠，随机分成4组，分别为对照组、克唑替尼组、盐酸二甲双胍组、克唑替尼+盐酸二甲双胍合用组，每组5只，以灌胃的方式给药。克唑替尼给予的剂量为100mg/kg/day，盐酸二甲双胍剂量为200mg/kg/day，对照组用0.4％的CMC-Na代替，连续给药6周。

使用眼眶采血方式收集血样，检测血清中肝脏损伤的生化标记物ALT和AST的水平。

剖取肝脏，称重，考察小鼠脏器系数，并对肝脏组织进行包埋、切片、HE染色。

结果如图7所示，对照组、克唑替尼组、盐酸二甲双胍组和合用组的体重增长量(gain of weight)分别为7.44±0.33％、4.24±0.82％、7.62±0.38％和6.06±0.59％(图7A)。

肝脏的脏器系数(LW/BW)分别为4.30±0.19％、5.27±0.20％、3.97±0.32％和4.63±0.14％(图7B)。

以上数据表明合用盐酸二甲双胍后由克唑替尼引起的小鼠体重增长缓慢以及脏器系数上调得到显著逆转。

结果如图8所示，对肝脏组织切片进行HE染色，单用克唑替尼引起的免疫细胞浸润，细胞空泡样变性损伤在合用盐酸二甲双胍后都得到了明显的改善。

结果如图9所示，对照组、克唑替尼组、盐酸二甲双胍组和合用组的肝功能标志物ALT分别为31.8±2.08、58.2±9.79、36.6±7.97和33.12±2.49U/L；AST分别为113.16±15.34、173.64±18.07、127.92±19.75和135.72±16.37U/L，说明克唑替尼可引起小鼠肝脏功能损伤，并且克唑替尼诱导的小鼠肝脏功能损伤在合用盐酸二甲双胍后得到明显逆转。

二、取4个组别小鼠部分肝脏组织，提取蛋白并定量，随后采用western blot的方法检测给药后SQLE蛋白的表达水平，并使用Image J软件对western blot结果进行定量分析。

结果如图10所示，与对照组相比，克唑替尼会显著上调小鼠肝脏中SQLE蛋白水平，而合用盐酸二甲双胍可以逆转克唑替尼引起的SQLE蛋白累积。

对肝脏切片进行免疫组织化学染色，检测SQLE蛋白水平的变化。克唑替尼引起的SQLE水平增加在合用盐酸二甲双胍后被显著逆转。结果参见图11。

Claims (10)

1.以SQLE基因或SQLE蛋白为靶点在制备治疗克唑替尼肝脏毒性药物中的应用，其特征在于，所述药物下调SQLE基因表达或SQLE蛋白累积，所述SQLE基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述SQLE蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包含靶向SQLE基因的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列为：5’-AACAUGAUAACCACCCGGCTT-3’。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包含自噬激活剂。

4.自噬激活剂在制备治疗SQLE蛋白异常表达引起的疾病或损伤的药物中的应用，其特征在于，所述自噬激活剂降低SQLE蛋白的累积。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述疾病或损伤为SQLE蛋白累积引起的肝脏疾病。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述疾病或损伤为克唑替尼诱发的肝脏毒性反应。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述自噬激活剂为雷帕霉素、二甲双胍或其药学上可接受的盐。

8.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

9.一种抗肿瘤联合用药物组合物，其特征在于，包括克唑替尼作为活性成分的第一制剂，以及自噬激活剂作为活性成分的第二制剂。

10.如权利要求9所述的药物组合物在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。

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