CN114907287A - 一种用于治疗肾损伤的化合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种化合物Cpd‑42及其在制备治疗肾脏损伤药物中的应用。本发明的化合物Cpd‑42具有有效减轻急性肾损伤的功效，可用于肾功能的恢复，且毒副作用较低，其作用机制与Cpd‑42降低炎症损伤和程序性坏死因子水平有关。因此，化合物Cpd‑42作为急性肾损伤治疗剂具有广泛的临床应用前景。

Description

一种用于治疗肾损伤的化合物

技术领域

本发明涉及药物领域，具体涉及一种用于治疗肾损伤的药物。

背景技术

急性肾损伤(Acute Kidney Injury，AKI)是一类严重影响人类健康的损伤，AKI的损伤性大，使肾功能严重受损甚至导致患者死亡。AKI的发病率高，每年约有1330万人发生AKI，约有170万人死于急性肾损伤及其并发症。严重或反复AKI可进展为慢性肾病甚至终末期肾病。不幸的是，除了保守性治疗之外，目前尚缺乏有效和具体的治疗方法，AKI的治愈已经成为全球范围内亟待解决的公共卫生问题。因此，寻找可以减轻组织损伤、促进修复、防止进展为慢性纤维化的肾脏保护药物具有重要意义。

Cpd-42是一种新型的RIPK3抑制剂，由前体化合物TAK-632结构改造得到，过往的研究表明Cpd-42通过靶向抑制RIPK3介导的程序性坏死有效减轻全身炎症反应综合征，Cpd-42表现出有效的抗坏死作用，但其防治肾脏损伤的药理学作用尚未报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一种用于治疗肾脏损伤的化合物。

基于上述发现，本发明提出的解决上述技术问题的技术方案如下。

本发明的第一方面提供一种用于治疗肾脏损伤的化合物Cpd-42，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.01-1μM。更优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.1μM。

本发明的第二方面提供化合物Cpd-42在制备治疗肾脏损伤的药物中的应用，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

优选的，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂或胶囊。

优选的，所述药物进一步包括药学上可接受的辅料。

优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.01-1μM。更优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.1μM。

优选的，所述肾脏损伤为急性肾损伤。

优选的，所述急性肾损伤为顺铂诱导的急性肾损伤。

本发明的第三方面提供化合物Cpd-42在制备保护肾小管上皮细胞的药物中的应用，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.01-1μM。更优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.1μM。

优选的，所述肾小管上皮细胞为人肾小管上皮细胞HK2。

本发明的第四方面提供化合物Cpd-42在制备下调程序性坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3、p-MLKL水平和炎症相关蛋白p-P65水平中的一种或多种的药物中的应用，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.01-1μM。更优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.1μM。

优选的，所述应用为化合物Cpd-42在制备同时下调程序性坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3、p-MLKL水平和炎症相关蛋白p-P65水平中的药物中的应用。

本发明的第五方面提供化合物Cpd-42在制备下调炎症相关因子TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA水平中的一种或多种的药物中的应用，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.01-1μM。更优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.1μM。

优选的，所述应用为化合物Cpd-42在制备同时下调炎症相关因子TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA水平的药物中的应用。

本发明的第六方面提供化合物Cpd-42在制备降低血肌酐和/或血尿素氮含量的药物中的应用，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.01-1μM。更优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.1μM。

优选的，所述应用为化合物Cpd-42在制备同时降低血肌酐和血尿素氮含量的药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明意外发现，化合物Cpd-42具有有效减轻急性肾损伤的功效，可用于肾功能的保护，且毒副作用较低，其作用机制与Cpd-42降低炎症损伤和程序性坏死因子水平有关。因此，化合物Cpd-42作为急性肾损伤治疗剂具有广泛的临床应用前景。

附图说明

图1是未经顺铂诱导条件下化合物Cpd-42和化合物Cpd-71对肾小管上皮细胞作用(A)和化合物Cpd-42对顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤保护作用(B)的MTT图；

图2是化合物Cpd-42对顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤保护的Western Blot图；

图3是化合物Cpd-42对顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤保护的Real-time PCR图；

图4是化合物Cpd-42对顺铂诱导HK2细胞中程序性坏死相关蛋白水平的WesternBlot图；

图5是化合物Cpd-42对顺铂诱导HK2细胞中程序性坏死关键调节因子p-MLKL表达的免疫荧光图；

图6是化合物Cpd-42对顺铂诱导HK2细胞中炎症蛋白p-P65水平的Western Blot图；

图7是化合物Cpd-42对顺铂引起的炎症相关因子TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA水平Real-time PCR图；

图8是给予不同浓度的化合物Cpd-42后小鼠急性肾损伤模型中血肌酐含量值；

图9是给予不同浓度的化合物Cpd-42后小鼠急性肾损伤模型中血尿素氮含量值；

图10是化合物Cpd-42对小鼠急性肾损伤模型中程序性坏死和炎症相关蛋白表达水平的Western Blot图。

具体实施方式

下面结合实验例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实验例使用的对比化合物Cpd-71的结构式为：

如无特别说明，本申请实验例及附图中P值显著性符号定义如下：与对照组(NC)比较：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；与顺铂刺激组(Cis)比较：^#P<0.05，^##P<0.01，^###P<0.001。

实验例1、Cpd-42对体外顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤的保护作用

1、实验方法

1.1、MTT法

将人肾小管上皮细胞(HK2)接种于96孔板中，接种密度约为4000个细胞/孔。培养24h，换用无血清培养基饥饿12小时后，第一列设为对照组，第二列为模型组，不加药物，其余从左到右依次按照浓度梯度加入配制好的Cpd-42，使每孔体系为100μL，12小时后，除第一列对照组外，其余各孔均按照每孔20μM的剂量加入顺铂刺激，继续培养24h。培养结束后每孔加入5g·L^-1的MTT溶液20μL，继续培育4h。吸去培养基，每孔加入150μL的DMSO，振荡，混匀。用酶标仪在492nm处测定各孔OD值，记录结果。以细胞存活率(Cell viability)对剂量作图。

细胞存活率＝(实验组细胞OD值-空白组细胞OD值)/(对照组细胞OD值-空白组细胞OD值)×100％。

另外，参照上述方法，在未加入顺铂刺激的情况下，测定单纯加入各浓度Cpd-42和Cpd-71后的细胞存活率，考察两种药物对HK2细胞的毒性。

1.2、Western Blot

将对数生长期的HK2细胞接种于6孔板中，接种密度约为1.0×10⁵个细胞/ml，分别分为正常组(NC)、单纯加Cpd-42组(0.1μM)、模型组(顺铂20μM)、Cpd-42低剂量组(顺铂20μM+Cpd-420.01μM)、Cpd-42中剂量组(顺铂20μM+Cpd-420.05μM)、Cpd-42高剂量组(顺铂20μM+Cpd-420.1μM)和Cpd-71对照组(顺铂20μM+Cpd-710.1μM)孵育24小时用无血清培养基饥饿12小时后分别加入刺激及药物。继续培养24小时。PBS洗三遍，收集细胞，提取总蛋白，通过Western Blot法检测肾脏损伤分子KIM-1的蛋白表达并进行定量分析，每组重复5次实验。

1.3、Real-time PCR

将HK2细胞接种于12孔板中，分别分为正常组(NC)、单纯加Cpd-42组(0.1μM)、模型组(顺铂20μM)、Cpd-42低剂量组(顺铂20μM+Cpd-420.01μM)、Cpd-42中剂量组(顺铂20μM+Cpd-420.05μM)、Cpd-42高剂量组(顺铂20μM+Cpd-420.1μM)和Cpd-71对照组(顺铂20μM+Cpd-710.1μM)，接种密度约为0.5×10⁵个细胞/孔，孵育24小时，用无血清培养基饥饿12小时后分别加入刺激及药物。继续培养24小时。PBS洗三遍，收集细胞，提RNA，逆转录，扩增，每组重复5次实验。

2、实验结果

MTT实验结果如图1所示，在未经顺铂刺激的情况下，各浓度下Cpd-42组细胞存活率高于Cpd-71组(图1A，P值显著性符号定义如下：Cpd-71组与对照组(NC)比较：^$P<0.05，^$$P<0.01，^$$$P<0.001)，说明Cpd-42的毒副作用小于Cpd-71。另外，顺铂刺激的HK2细胞相对存活率值为44.5％，经过Cpd-42处理后，该细胞的相对存活率值最高为83％，上升1.86倍(图1B)。上述实验结果表明，Cpd-42对顺铂刺激的肾小管上皮细胞具有较好的保护作用。

Western Blot及定量分析结果如图2所示(以β-actin作为内参)，顺铂刺激的HK2细胞经过Cpd-42处理后，肾脏损伤分子KIM-1的蛋白表达水平明显受到抑制，且高剂量组效果最为明显；与Cpd-71对照组相比，相同剂量下Cpd-42下调KIM-1的表达水平效果更为明显，提示Cpd-42对顺铂引起肾小管上皮损伤的保护作用明显优于Cpd-71。

Real-time PCR实验结果如图3所示，顺铂刺激后模型组KIM-1的mRNA水平明显上调，这一现象在Cpd-42处理后得到改善，且相同剂量下，Cpd-42组的KIM-1水平明显低于Cpd-71对照组，提示Cpd-42比Cpd-71更显著抑制顺铂诱导的肾小管上皮细胞损伤。

实验例2、Cpd-42对体外顺铂诱导程序性坏死和炎症反应的抑制作用

1、实验方法

1.1、Western Blot

将对数生长期的HK2细胞接种于6孔板中，接种密度约为1.0×10⁵个细胞/ml，分别分为正常组(NC)、单纯加Cpd-42组(0.1μM)、模型组(顺铂20μM)、Cpd-42组(顺铂20μM+Cpd-420.1μM)和Cpd-71对照组(顺铂20μM+Cpd-710.1μM)孵育24小时用无血清培养基饥饿12小时后分别加入刺激及药物。继续培养24小时。PBS洗三遍，收集细胞，提取总蛋白，通过Western Blot法检测程序性坏死程序性坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3、程序性坏死关键调节蛋白p-MLKL以及炎症相关蛋白p-P65的表达水平并进行定量分析，每组重复5次实验。

1.2、免疫荧光法

将对数生长期的HK2细胞接种于放有玻片的6孔板中，接种密度约为1.0×10⁵个细胞/ml，分别分为正常组(NC)、单纯加Cpd-42组(0.1μM)、模型组(顺铂20μM)、Cpd-42组(顺铂20μM+Cpd-420.1μM)和Cpd-71对照组(顺铂20μM+Cpd-710.1μM)，孵育24小时，用无血清培养基饥饿12小时后分别加入刺激及药物，继续培养24小时。PBS洗三遍，加多聚甲醛固定10分钟，PBS洗三遍，滴加10％BSA封闭0.5小时，PBS洗三遍，滴加一抗，孵育24小时后洗去一抗，滴加荧光二抗，避光孵育1.5小时后洗去二抗，滴加DAPI染液避光孵育10分钟，滴加抗荧光淬灭剂，封片，荧光倒置显微镜观察，拍片每组重复5次实验。

1.3、Real-time PCR

将HK2细胞接种于12孔板中，分别分为正常组(NC)、单纯加Cpd-42组(0.1μM)、模型组(顺铂20μM)、Cpd-42组(顺铂20μM+Cpd-420.1μM)和Cpd-71对照组(顺铂20μM+Cpd-710.1μM)，接种密度约为0.5×10⁵个细胞/孔，孵育24小时，用无血清培养基饥饿12小时后分别加入刺激及药物。继续培养24小时。PBS洗三遍，收集细胞，提RNA，逆转录，扩增，每组重复5次实验。

2、实验结果

Western Blot及定量分析结果如图4所示，Cpd-42显著下调了顺铂诱导的HK2细胞中程序性坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3和程序性坏死关键调节蛋白p-MLKL表达水平。对比发现，Cpd-71下调程序性坏死相关蛋白水平的效果并不显著。

免疫荧光结果如图5所示，Cpd-42明显减少了顺铂诱导HK2细胞中p-MLKL的膜转位情况，这一结果在Cpd-71对照组中比并未明显体现，提示Cpd-42对体外顺铂诱导的程序性坏死的抑制作用效果优于Cpd-71。

Western Blot及定量分析结果如图6所示，Cpd-42明显下调了顺铂诱导HK2细胞中p-P65的蛋白水平，相同剂量下，Cpd-42组的p-P65水平明显低于Cpd-71对照组，提示Cpd-42比Cpd-71更显著下调顺铂诱导的炎症相关蛋白的表达。

Real-time PCR结果如图7所示，Cpd-42显著下调顺铂引起的炎症相关因子TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA水平(见图7)。

综上，相同剂量下，尽管Cpd-71能一定程度下调程序性坏死和炎症相关因子的表达，但与Cpd-42组相比明显较弱。以上结果共同提示，Cpd-42可显著抑制顺铂诱导的程序性坏死和炎症反应，且作用效果比Cpd-71更好。

实验例3、Cpd-42对体内顺铂诱导急性肾损伤模型中血肌酐和血尿素氮的影响

1、实验方法

将6-8周龄C57BL/6小鼠适应性培养1-2天，实验分为正常对照组(生理盐水)，单纯加药组(Cpd-42混悬液12mg/kg)，模型组(顺铂20mg/kg)，Cpd-42低剂量组(顺铂20mg/kg+Cpd-42混悬液3mg/kg)，Cpd-42中剂量组(顺铂20mg/kg+Cpd-42混悬液6mg/kg)，Cpd-42高剂量组(顺铂20mg/kg+Cpd-42混悬液12mg/kg)，Cpd-71对照组(顺铂20mg/kg+Cpd-71混悬液12mg/kg)，每组10只，其中Cpd-42和Cpd-71的混悬液由0.5％羧甲基纤维素钠溶液配制。小鼠腹腔注射20mg/kg顺铂建立急性肾损伤模型并注射低、中、高剂量的Cpd-42和高剂量Cpd-71进行药物干预，3天后麻醉状态下收取血清样本及肾组织，并根据血肌酐和尿素氮试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)说明书检测动物模型血清中肌酐和尿素氮的含量。

肌酐测定方法如下：

肌酐含量(μmol/L)＝[(测定A2-K*测定A1)-(空白A2-K*空白A1)]/[(标准A2-K*标准A1)-(空白A2-K*空白)]*标准品浓度(442μmol/L)

注：稀释因子K＝(加样量+酶溶液A体积)/(加样量+酶溶液A体积+酶溶液B体积)＝186/246

尿素氮测试方法如下：

尿素氮含量(mmol/L)＝(测定OD值-空白测定值)/(标准OD值-空白OD值)*标准浓度(10mmol/L)*样本测试前稀释倍数

2、实验结果

顺铂诱导模型组中血肌酐和尿素氮含量明显升高，肾功能恶化，而不同浓度的Cpd-42有效降低模型组血肌酐水平(见图8)和尿素氮水平(见图9)，高剂量组下调效果最为佳且下调血肌酐和尿素氮的效果明显优于Cpd-71对照组。上述实验结果进一步证实Cpd-42在急性肾损伤中的肾脏保护作用。

实验例4、Cpd-42对体内顺铂诱导急性肾损伤模型中程序性坏死蛋白和炎症反应的影响

1、实验方法(Western Blot法)

称取肾组织，按14μl/mg的质量体积比加入蛋白裂解液，充分研磨后，转移至EP管内，4℃摇床裂解30min，全程在冰上操作，后续步骤参见细胞实验Western Blot法。

实验例3的血肌酐尿素氮检测结果提示，高剂量组Cpd-42作用效果最佳，因此本实验例仅对正常对照组(生理盐水)，单纯加药组(Cpd-42混悬液12mg/kg)，模型组(顺铂20mg/kg)，Cpd-42高剂量组(顺铂20mg/kg+Cpd-42混悬液12mg/kg)和Cpd-71对照组(顺铂20mg/kg+Cpd-7112mg/kg)进行Western Blot实验分析。

2、实验结果

Western Blot实验结果显示，急性肾损伤模型中程序性坏死蛋白水平显著上升，而Cpd-42可明显降低这些蛋白的表达(见图10A)。在炎症反应相关蛋白分析中也得到了同样的验证，Cpd-42可降低顺铂引起的模型组肾脏p-P65的表达(见图10B)。此外，与相同给药剂量的对照组Cpd-71相比，Cpd-42组抑制程序性坏死和炎症蛋白的效果更好。这可能是Cpd-42保护急性肾损伤的作用机制之一。

上述实验例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实验例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于治疗肾脏损伤的化合物Cpd-42，其特征在于，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

2.化合物Cpd-42在制备治疗肾脏损伤的药物中的应用，其特征在于，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射剂、片剂、丸剂或胶囊。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物进一步包括药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肾脏损伤为急性肾损伤。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述急性肾损伤为顺铂诱导的急性肾损伤。

7.根据权利要求2-6任一项所述的应用，其特征在于，所述化合物Cpd-42的浓度为0.01-1μM；优选的，所述化合物Cpd-42的浓度为0.1μM。

8.化合物Cpd-42在制备保护肾小管上皮细胞的药物中的应用，其特征在于，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

9.化合物Cpd-42在制备下调程序性坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3、p-MLKL水平和炎症相关蛋白p-P65水平中的一种或多种的药物中的应用，其特征在于，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

10.化合物Cpd-42在制备下调炎症相关因子TNF-α、IL-6、MCP-1的mRNA水平中的一种或多种的药物中的应用，其特征在于，所述化合物Cpd-42的分子式为C₂₄H₁₈BrFN₄O₃S，化学结构式如下：

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