CN115109849A - Nurr1基因在诊断和治疗骨关节炎中的应用 - Google Patents

Nurr1基因在诊断和治疗骨关节炎中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了Nurr1基因在诊断和治疗骨关节炎中的应用。本发明提供了Nurr1在制备诊断骨关节炎的产品中的应用以及一种诊断骨关节炎的产品，还提供了Nurr1在制备治疗骨关节炎的药物组合物中的应用及一种治疗骨关节炎的药物组合物，同时本发明还提供了一种调控Nurr1的方法。

Description

Nurr1基因在诊断和治疗骨关节炎中的应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及Nurr1基因在诊断和治疗骨关节炎中的应用。
背景技术
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以关节软骨退行性病变和继发性骨质增生为特性的慢性关节疾病。多见于中老年人，女性多于男性。多发于负重较大的膝关节、髋关节、腰骶部脊柱关节(Lumbosacral joint)及第一跖趾关节(First MIP joints)等部位，以及手部的远端指间关节(DIP joints)、近端指间关节(PIP joints)。该病亦称为骨关节病、退行性关节炎、增生行关节炎、退化性关节炎、骨性关节炎等。
目前，对OA的诊断主要依靠临床症状、影像学资料和关节镜检查等，其中，后两者对于明确关节部位组织病理变化情况有很大价值。影像学中X线的改变是评价OA进展的常用方法，但它仍具有一定的局限性，其特异性和敏感性较差。通过病理标本研究发现，即使在X线表现正常时，关节软骨也可能已严重受累；一旦患者出现X线改变，疾病往往已经处于进展期，关节的正常功能和患者的生活质量已经受到严重的、不可逆的影响。磁共振成像(MRI)对软组织分辨率高，可从任意面成像及多参数、多序列成像，能直接显示软骨的改变情况，有助于OA的早期诊断，但由于价格昂贵，难以用于大范围的疾病评估和普查。此外，关节镜是评价关节软骨受损的最佳手段，被认为是诊断关节软骨受损的金标准，可以直接观察透明软骨的肿胀及破溃情况。但是由于检查的有创性，且不能显示软骨深层和软骨下骨质的改变，其临床应用也受到限制。因此，探究有效、廉价并且微创的检查手段来检测亚临床的OA和监测病变的进展，对早期诊断和有效防治OA有着重要的意义。
并且，由于对OA的病因学尚缺乏根本性的认识，医学界对其根治仍然缺乏行之有效的药物手段，关节置换手术往往成为患者最终必须选择的治疗方式。为了走出OA治疗方面的困境，阐明OA的病因学机理并在其基础上探索治疗OA的有效方案，成为了医学界有待突破的研究方向。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种诊断和治疗骨关节炎的方法，公开了Nurr1与骨关节炎的关系，并验证了Nurr1抑制剂Eugenol在治疗骨关节炎中的作用。
本发明的第一方面提供了一种诊断骨关节炎的产品，所述产品包括能够检测Nurr1表达水平的试剂。
进一步，所述产品还包括芯片、试剂盒或核酸膜条。
进一步，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测Nurr1基因转录水平的针对Nurr1基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括Nurr1蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测Nurr1基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测Nurr1蛋白表达水平的试剂或芯片。
进一步，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法、质谱法检测Nurr1基因或蛋白表达水平的试剂。
进一步，所述试剂盒中包括处理样品的仪器或试剂，所述样品包括：细胞、组织、血液、尿液、唾液、精液或粘液。
进一步，所述样品选自组织。
进一步，所述组织包括组织切片。
本发明的第二方面提供了检测Nurr1基因及其表达产物的试剂在制备诊断骨关节炎的产品中的应用。
进一步，所述试剂选自特异性识别Nurr1基因的寡核苷酸探针、特异性扩增Nurr1基因的引物或特异性结合Nurr1基因编码的蛋白的结合剂。
本发明的第三方面提供了一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物包括Nurr1基因和/或其表达产物的抑制剂。
进一步，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
本发明的第四方面提供了Nurr1基因及其表达产物在制备治疗骨关节炎的产品中的应用。
进一步，所述产品包括Nurr1的抑制剂。
进一步，所述抑制剂可以降低Nurr1的表达水平。
进一步，所述抑制剂包括化合物、特异性中和Nurr1的抗体、干扰RNA。
进一步，所述化合物是酚类化合物。
进一步，所述酚类化合物是Eugenol。
本发明的第五方面提供了一种筛选治疗骨关节炎的候选药物的方法，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有Nurr1基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中Nurr1基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质降低Nurr1基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗骨关节炎的候选药物。
本发明的第六方面提供了Nurr1基因及其表达产物在筛选治疗骨关节炎的候选药物的应用。
进一步，筛选候选药物的方法如下：用待筛选物质处理表达或含有Nurr1基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中Nurr1基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质降低Nurr1基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗骨关节炎的候选药物。
本发明的第七方面提供了一种调控Nurr1基因的方法，所述方法包括施用酚类化合物。
进一步，所述方法是体外调控。
进一步，所述酚类化合物是Eugenol。
本发明的第八方面提供了Eugenol在制备调控Nurr1的产品中的应用。
进一步，Eugenol下调Nurr1的表达水平。
进一步，Eugenol下调骨关节炎中Nurr1的表达水平。
进一步，所述调控为体外调控。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了Nurr1在骨关节炎中呈现显著性差异，通过检测Nurr1的表达水平，可以实现骨关节炎的诊断；通过改变Nurr1的表达水平，可以治疗骨关节炎。
本发明首次发现了酚类化合物Eugenol可以通过下调Nurr1的表达水平，进而实现骨关节炎的治疗。
附图说明
图1是实验动物分组与实验步骤图；
图2是小鼠左侧胫骨平台软骨下骨的Micro-CT图，其中，2A是左侧胫骨平台软骨下骨的矢状面Micro-CT影像图，2B是骨密度参数图，2C是相对骨体积参数图，2D是骨小梁厚度参数图，2E是结构模型指数图，2F是骨小梁分离度参数图；
图3是HE、番红固绿染色和OARSI评分图，其中，3A是HE和番红固绿染色图，3B是OARSI评分图；
图4是小鼠血清软骨退变标志物表达图，其中，4A是CTX-II表达图，4B是COMP表达图，4C是PIINT表达图；
图5是ADAMTS和MMP13的蛋白表达图；
图6是软骨细胞凋亡图，其中，6A是细胞凋亡荧光图，6B是细胞凋亡百分率图；
图7是Nurr1表达图。
具体实施方式
本发明通过广泛而深入的研究，发现了Nurr1基因在骨关节炎中差异表达，进一步研究发现，Eugenol通过调控Nurr1基因来治疗骨关节炎。
本发明提供了一种诊断骨关节炎的产品，所述产品包括能够检测Nurr1表达水平的试剂，所述产品还包括芯片、试剂盒或核酸膜条。
Nurr1包括野生型、突变型或其片段。该术语涵盖全长，未加工的Nurr1，以及源自细胞中加工的任何形式的Nurr1。该术语涵盖Nurr1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如Nurr1基因，人的Nurr1以及来自任何其它脊椎动物来源，包括哺乳动物，诸如灵长动物和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)的Nurr1。作为一种优选的实施方案，在本发明中，Nurr1为人的基因，(基因ID:4929)。
在本发明中，术语“基因的表达水平”或“基因表达水平”是指细胞中mRNA以及前mRNA新生转录物、转录物加工中间体、成熟mRNA和降解物的水平或由所述基因编码的蛋白质的水平。
在本发明中，术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定mRNA的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物mRNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。“差异表达的”还可以包括与第二种样品或样品群中蛋白质表达量或水平比较，对样品或样品群中本发明生物标志物编码的蛋白质的测定。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定RNA的量和/或蛋白质的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。
术语“基因表达产物”或“基因产物”是由特定基因的表达产生的分子。基因表达产物包含例如多肽、适体、干扰RNA、信使核糖核酸(mRNA)、rRNA、tRNA、非编码RNA(ncRNA)。
在本发明中，芯片包括基因芯片、蛋白质芯片；所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括用于检测Nurr1基因转录水平的针对Nurr1基因的寡核苷酸探针；所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的Nurr1蛋白的特异性抗体；所述基因芯片可用于检测包括人Nurr1基因在内的多个基因(例如，与骨关节炎相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括人Nurr1蛋白在内的多个蛋白质(例如与骨关节炎相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与骨关节炎的标志物同时检测，可大大提高骨关节炎诊断的准确率。
在本发明中，术语“试剂盒”是指在用于对核苷酸进行测序和/或分离核苷酸序列和/或基于来自样品或细胞的表达核苷酸序列的存在、不存在和/或量来诊断患有疾病或感染的受试者的系统的情况下提供的一组组件。在一些实施方案中，术语“试剂盒”是指在用于对核苷酸进行测序和/或分离核苷酸序列和/或基于样品或细胞中的表达核苷酸序列的空间位置来诊断患有疾病或感染的受试者的系统的情况下提供的一组组件。这类系统可包括例如允许在一个或多个细胞(例如，在适当容器中的寡核苷酸、编码酶的寡核苷酸，细胞外基质组分等)和/或支持物质(例如，缓冲液、培养基、细胞、用于进行测定的书面说明等)中储存、确认或从一个位置向另一位置递送表达基因的系统。例如，在一些实施方案中，试剂盒包括含有相关反应试剂和/或支持物质的一个或多个外壳(例如，盒)。术语“片段化试剂盒”是指包含两个或更多个单独容器的诊断测定，每个容器含有总试剂盒组分的子部分。容器可一起或分开地递送至预期的接受者。例如，第一容器可含有用于细胞培养测定的固体支持物或聚苯乙烯板，而第二容器可含有细胞，如对照细胞。作为另一实例，试剂盒可包括第一容器和第二容器，所述第一容器包含具有对本文公开的一种或多种生物标志物具有亲和力的一种或多种配体的固体支持物，如芯片或载玻片，所述第二容器包含检测和/或定量样品中脂质修饰的寡核苷酸的量所必需的任何一种或多种试剂。术语“片段化试剂盒”旨在涵盖含有根据Federal Food,Drug,and Cosmetic Act第520(e)条规定的分析物特异性试剂(ASR)的试剂盒，但不限于此。任何包含两个或多个单独容器的递送系统都包含在术语“碎片化试剂盒”中，每个容器包含总试剂盒组分的子部分。相比之下，“组合试剂盒”是指在单个容器中(例如，在容纳每种所需组分的单个盒中)含有所有组分的递送系统。术语“试剂盒”包括片段化的和组合的试剂盒两者。
在本发明中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒；基因检测试剂盒包括用于检测Nurr1基因转录水平的试剂；蛋白免疫检测试剂盒包括Nurr1蛋白的特异性抗体。
在本发明中，所述试剂盒还包括处理样品的仪器或试剂。
本发明的样品包括但不限于：细胞、组织、血液、尿液、唾液、精液或粘液。
在本发明的优选实施方案中，所述样品选自组织。
在本发明的优选实施方案中，所述组织包括组织切片。
在本发明中，术语“组织”是指一起进行某些特殊功能的一组或一层特化细胞。
在本发明中，术语“组织切片”是指已从受试者获得，固定，切片并且安装到平面(例如显微镜载玻片)上的一片组织。
本发明提供了检测Nurr1基因及其表达产物的试剂在制备诊断骨关节炎的产品中的应用，所述试剂包括但不限于特异性识别Nurr1基因的寡核苷酸探针、特异性扩增Nurr1基因的引物或特异性结合Nurr1基因编码的蛋白的结合剂。
在本发明中，针对Nurr1基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
在本发明中，“引物”指能够与核酸杂交并允许互补核酸的聚合作用(一般通过提供游离的3’-OH基团)的单链多核苷酸。所述引物能够实现靶序列的特异性扩增。“特异性扩增”是指与非靶序列相比，引物组以统计上显著的水平更多地扩增靶序列。
在本发明中，术语“结合剂”指特异性结合靶的天然存在的或非天然存在的分子。特异性结合剂的实例包括但不限于蛋白、肽、核酸、碳水化合物和脂质。在某些实施方案中，特异性结合剂是抗体。
在本发明中，特异性结合Nurr1基因编码的蛋白的结合剂例如蛋白质Nurr1的受体、结合蛋白质Nurr1的凝集素、针对蛋白质Nurr1的抗体、针对蛋白质Nurr1的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。特异性结合剂的具体例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。
本发明中所述的芯片、试剂盒或膜条可用于检测包括Nurr1基因在内的多个基因及其表达产物(例如，与骨关节炎相关的多个基因)的表达水平。将骨关节炎的多个标志物同时进行检测，可大大提高骨关节炎诊断的准确率。
本发明提供了Nurr1在制备治疗骨关节炎的药物组合物中的应用以及治疗骨关节炎的药物组合物，所述药物组合物包括Nurr1的抑制剂。所述抑制剂是指任何可减少Nurr1蛋白的活性、降低Nurr1基因或蛋白的稳定性、下调Nurr1蛋白的表达、减少Nurr1蛋白有效作用时间或抑制Nurr1基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调Nurr1有用的物质，从而可用于预防或治疗骨关节炎。例如所述的抑制剂包括核酸抑制剂，蛋白抑制剂。
在本发明中，术语“抑制剂”是指分子或物质或化合物或组合物或药剂或任何组合，其能够抑制和/或降低所述靶分子的活性或表达水平。术语“抑制剂”包含竞争性、非竞争性、功能和化学拮抗剂。术语“部分抑制剂”意味着分子或物质或化合物或组合物或药剂或其任何组合，其能够通过尤其是非竞争性机制不完全地阻断激动剂的作用。
在本发明的一些实施方案中，所述抑制剂包括化合物、特异性中和Nurr1的抗体，干扰RNA。
本发明中抑制剂指酚类化合物，是一类包含直接键于芳族烃基团的羟基的化合物。酚类化合物的实例包括但不限于苯酚，烷基酚如甲酚等，和/或其他苯酚取代化合物。
在本发明的具体实施方案中，所述酚类化合物是指Eugenol，即丁香酚，指从丁香油、肉豆蔻、肉桂、罗勒和月桂叶中提取的透明的浅黄色精炼油，其由约72％至90％的提取自丁香的精炼油(作为主要成分)组成。
在本发明的一些实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。本发明的药物还可与其他治疗骨关节炎的药物联用，多种药物联合使用可以大大提到治疗的成功率。
本发明中Nurr1的抑制剂可以通过脂质体给予，所述脂质体的作用是将药物靶向于特定的组织，以及增加药物的半衰期。脂质体包括乳化剂、起泡剂、液态脂质、固态脂质、不溶性单层、磷脂分散剂、表面活性剂等。所述的脂质体中还可以包括能与靶向的细胞中的受体分子结合或其他治疗性或免疫原性组合物。本发明的药物还可与其他治疗骨关节炎的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分(例如，Nurr1的抑制剂)同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它治疗性化合物。主要成分(如Nurr1抑制剂)的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。
在本发明中，“干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。以细胞为基础的RNAi筛选在功能基因学研究方面具有许多优势，主要表现在大多数细胞类型都能使用RNAi方法，并且相对较容易下调或沉默任何目的基因的表达。
本发明进一步提供了一种筛选治疗骨关节炎的候选药物的方法，所述方法包括用待筛选物质处理表达或含有Nurr1基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中Nurr1基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质抑制Nurr1基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗骨关节炎的候选药物。
所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)。
在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选药物进一步测试其抑制骨关节炎的效果，若测试化合物对骨关节炎有显著的抑制效果，则说明该候选药物为治疗骨关节炎的候选药物。
在本发明中，“药物”与“药物组合物”可以互换使用。
下面结合具体实施例进一步阐述此发明。应理解的是，在此描述的特定实施方式通过举例的方式来表示，并不作为对本发明的限制。在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例1.Eugenol对膝盖前交叉韧带切除术(ACLT)的骨关节炎小鼠模型的治疗效果研究
1.1实验材料
丁香酚(Eugenol)购自于上海陶素生化科技有限公司，小鼠购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，为C57B6N小鼠，6周龄、雄性。
1.2.实验方法
1.2.1膝盖前交叉韧带切除术(Anterior cruciate ligament transection，ACLT)的骨关节炎小鼠模型的构建
小鼠用右美托咪啶(0.25mg/kg)和氯胺酮(25mg/kg)肌内注射麻醉，常规备皮消毒左侧膝关节，取髌旁内侧切口显露膝关节，显露髌骨后将髌骨向外侧脱位，尽量屈曲膝关节显露前交叉韧带(anterior cruciate ligament transection，ACLT)，在直视下切断前交叉韧带，彻底止血，将髌骨复位，1号丝线逐层闭合关节腔。假手术组仅切开缝合左侧膝关节，未切断前十字韧带。
1.2.2Eugenol对骨关节炎ACLT小鼠模型的治疗效果研究
小鼠经2周适应环境后，随机分为5组，每组5只：1)正常组，未腹腔注射；2)假手术组，未腹腔注射；3)ACLT模型组，腹腔注射溶剂；4)小剂量ACLT模型组，ACLT后腹腔注射丁香酚(5mg/kg)；5)大剂量ACLT模型组，ACLT后腹腔注射丁香酚(10mg/kg)，分组及实验步骤见图1。
造模两周后，腹腔给与Eugenol，分为溶剂组、5mg/kg低剂量组和10mg/kg高剂量组，1次/周，给药6周。
1.2.3micro-CT、HE和番红O-固绿染色并给予OARSI评分
给药6周后，取左侧膝关节标本，剔除周围组织，将标本经保湿处理后置于Micro-CT(SkyScan1172，Belgium)仪器中进行扫描，获得标本的横断面图。将标本的完整膝关节骨组织作为感兴趣区域(Region of interest，ROI)，采用CTan(V1.14.4)软件完成图像二值化(阈值80-255)后并进行分析。采用CTVol(v.2.2)软件显示三维图像。
用生理盐水冲洗经4％多聚甲醛固定的膝关节标本3次，将其置于EDTA溶液中脱钙，完全脱钙后，用乙醇脱水，石蜡包埋。5μm切片，常规脱蜡至水后，行苏木精-伊红(HE)染色和番红O-固绿染色。
光镜下观察组织的病理学改变，并按照OARSI软骨组织学评分标准进行评分。
1.2.4ELISA检测CTX-II等的表达
给药6周后，小鼠血清分别行软骨退变标志物CTX-II、COMP和PIINT的ELISA(维百奥(北京)生物科技有限公司)检测。
1.3实验结果
结果显示，一定浓度以内的Eugenol对小鼠体重无明显影响，ACLT可引发小鼠胫骨平台关节软骨和软骨下骨的破坏，而Eugenol可有效保护软骨和软骨下骨；同时Eugenol可降低ACLT导致的小鼠膝关节血清中CTX-II等分解代谢信号分子的表达，说明Eugenol可以抑制软骨退变(图2-图4)，表明了Eugenol对骨关节炎ACLT小鼠模型具有显著的治疗效果(#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001)。
实施例2Eugenol通过Nurr1基因抑制MMP-13和ADAMTS4的表达
2.1实验材料
人原代软骨细胞、FULL培养基购自于北京北纳创联生物技术研究院，核糖核酸(RNA)提取液(TRIzol)购自Invitrogen公司，IL-1β购自Sigma公司。
2.2实验方法
2.2.1蛋白免疫印迹法检测MMP-13和ADAMTS4等信号分子的表达
将人原代软骨细胞以2×105细胞/孔的密度播种于6孔板后培养12小时。于含有不同浓度的Eugenol(0、12.5、25、50、100和200g/g/mL)的FULL培养基中继续培养2小时。向FULL培养基中加入0或10ng/mL的IL-1β刺激细胞24小时。经PBS轻洗2次后，按照总蛋白提取试剂盒(Thermo Fisher，美国)的操作顺序提取总蛋白，使用Bradford法检测蛋白质浓度。取20g蛋白于4-12％丙烯酰胺凝胶中电泳后，将蛋白转移至PVDF膜(Bio-Rad，美国)，5％脱脂奶粉封闭40分钟。一抗使用单克隆抗体ADAMTS-4(abcam，USA)、MMP-13(abcam，USA)和-actin(abcam，USA)，于4℃过夜。经TBST洗膜后二抗使用辣根过氧化物酶标记小鼠或兔IgG，室温下孵育4小时。使用ECL系统，暗室内胶片(Kodak，美国)成像。
2.2.2TUNEL试剂检测软骨细胞的凋亡情况
将人原代软骨细胞以2×105细胞/孔的密度播种于6孔板后培养12小时。于含有不同浓度的Eugenol(0或50g/mL)的FULL培养基中继续培养2小时。向FULL培养基中加入0或50mM的CCCP刺激细胞20分钟。收集处理后的细胞，采用4％多聚甲醛固定细胞，根据TUNEL凋亡试剂盒说明书进行TUNEL染色，采用DAPI染色液复染细胞核。置于荧光显微镜下观察凋亡细胞，并通过计算TUNEL阳性细胞核数量占DAPI染色核数量的比例，计算凋亡细胞的百分率。
2.2.3RT-PCR法检测Nurr1基因表达
人原代软骨细胞以2×105细胞/mL密度播种于6孔板(直径3.5cm)后培养12小时。于含有不同浓度的Eugenol(0、25、50g/mL)的FULL培养基中继续培养2小时，使细胞吸收Eugenol。向FULL培养基中加入0或10ng/mL的IL-1β刺激细胞24小时。使用TRIzol RNA提取液进行RNA提取。使用反转录试剂盒(Promega公司，美国)进行反转录，反转录产物cDNA作为PCR扩增模板，目的基因为Nurr1。
2.3实验结果
结果显示，Eugenol能够降低基质降解酶ADAMTS和MMP13的表达，说明Eugenol可以抑制软骨基质降解(图5)；Eugenol还可以抑制软骨细胞凋亡(图6)；与对照组相比，IL-1β诱导的骨关节炎模型中Nurr1的表达水平显著增高，通过施用不同剂量的Eugenol，能显著抑制Nurr1的表达，说明Eugenol能通过抑制Nurr1的表达水平达到治疗骨关节炎的效果(图7)(#p<0.05、##p<0.01、###p<0.001)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种诊断骨关节炎的产品，其特征在于，所述产品包括能够检测Nurr1表达水平的试剂；
优选的，所述产品还包括芯片、试剂盒或核酸膜条；
优选的，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测Nurr1基因转录水平的针对Nurr1基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括Nurr1蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测Nurr1基因转录水平的试剂或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测Nurr1蛋白表达水平的试剂或芯片。
2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法、质谱法检测Nurr1基因或蛋白表达水平的试剂；
优选的，所述试剂盒中包括处理样品的仪器或试剂，所述样品包括：细胞、组织、血液、尿液、唾液、精液或粘液；
优选的，所述样品选自组织；
优选的，所述组织包括组织切片。
3.检测Nurr1基因及其表达产物的试剂在制备诊断骨关节炎的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂选自特异性识别Nurr1基因的寡核苷酸探针、特异性扩增Nurr1基因的引物或特异性结合Nurr1基因编码的蛋白的结合剂。
5.一种用于治疗骨关节炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括Nurr1基因和/或其表达产物的抑制剂；
优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
6.Nurr1基因及其表达产物在制备治疗骨关节炎的产品中的应用；
优选的，所述产品包括Nurr1的抑制剂；
优选的，所述抑制剂可以降低Nurr1的表达水平；
优选的，所述抑制剂包括化合物、特异性中和Nurr1的抗体、干扰RNA；
优选的，所述化合物是酚类化合物；
优选的，所述酚类化合物是Eugenol。
7.一种筛选治疗骨关节炎的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有Nurr1基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中Nurr1基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质降低Nurr1基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗骨关节炎的候选药物。
8.Nurr1基因及其表达产物在筛选治疗骨关节炎的候选药物的应用；
优选的，筛选候选药物的方法如下：用待筛选物质处理表达或含有Nurr1基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中Nurr1基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质降低Nurr1基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是治疗骨关节炎的候选药物。
9.一种调控Nurr1基因的方法，其特征在于，施用酚类化合物；
优选的，所述酚类化合物是Eugenol。
10.Eugenol在制备调控Nurr1的产品中的应用；
优选的，Eugenol下调Nurr1的表达水平；
优选的，Eugenol下调骨关节炎中Nurr1的表达水平。
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