CN116270901B - 中药复方及其药物组合物 - Google Patents
中药复方及其药物组合物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116270901B CN116270901B CN202211675138.2A CN202211675138A CN116270901B CN 116270901 B CN116270901 B CN 116270901B CN 202211675138 A CN202211675138 A CN 202211675138A CN 116270901 B CN116270901 B CN 116270901B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- group
- mice
- pharmaceutical composition
- longan
- blood
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title abstract description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 45
- 240000001008 Dimocarpus longan Species 0.000 claims abstract description 14
- 235000000235 Euphoria longan Nutrition 0.000 claims abstract description 14
- 240000005373 Panax quinquefolius Species 0.000 claims abstract description 12
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 240000007164 Salvia officinalis Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000305491 Gastrodia elata Species 0.000 claims abstract description 9
- 244000131316 Panax pseudoginseng Species 0.000 claims abstract description 9
- 235000003181 Panax pseudoginseng Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 235000017276 Salvia Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 20
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 10
- 235000005412 red sage Nutrition 0.000 claims description 8
- 241000305492 Gastrodia Species 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 239000006187 pill Substances 0.000 claims description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 5
- 241000180649 Panax notoginseng Species 0.000 claims description 4
- 235000003143 Panax notoginseng Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 3
- 239000002775 capsule Substances 0.000 claims description 3
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 claims description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 3
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 claims description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 claims description 2
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000006184 cosolvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 2
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 claims description 2
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 claims description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 claims description 2
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 claims description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 2
- 239000000829 suppository Substances 0.000 claims description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 claims description 2
- 239000012675 alcoholic extract Substances 0.000 claims 1
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 abstract description 23
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 23
- 208000013738 Sleep Initiation and Maintenance disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 abstract description 7
- 206010022437 insomnia Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000009205 Tinnitus Diseases 0.000 abstract description 6
- 231100000886 tinnitus Toxicity 0.000 abstract description 6
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract description 5
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000031091 Amnestic disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010062717 Increased upper airway secretion Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010071299 Slow speech Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010047513 Vision blurred Diseases 0.000 abstract description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 3
- 230000006986 amnesia Effects 0.000 abstract description 3
- 208000026435 phlegm Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 abstract description 3
- 206010014080 Ecchymosis Diseases 0.000 abstract 1
- 208000006083 Hypokinesia Diseases 0.000 abstract 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 77
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 40
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 27
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 11
- 238000010175 APPswe/PSEN1dE9 Methods 0.000 description 10
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 10
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000001149 cognitive effect Effects 0.000 description 8
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 description 8
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 8
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 7
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 7
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 7
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000012347 Morris Water Maze Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 5
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 5
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 5
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 5
- 101000831205 Danio rerio Dynein axonemal assembly factor 11 Proteins 0.000 description 4
- 102100024282 Dynein axonemal assembly factor 11 Human genes 0.000 description 4
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001559542 Hippocampus hippocampus Species 0.000 description 4
- 101000831210 Homo sapiens Dynein axonemal assembly factor 11 Proteins 0.000 description 4
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N donepezil Chemical group O=C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CC1CC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 3
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 3
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000012549 training Methods 0.000 description 3
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 3
- 102000010400 1-phosphatidylinositol-3-kinase activity proteins Human genes 0.000 description 2
- LHCPRYRLDOSKHK-UHFFFAOYSA-N 7-deaza-8-aza-adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1C=NN2 LHCPRYRLDOSKHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007665 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Human genes 0.000 description 2
- 108010007457 Extracellular Signal-Regulated MAP Kinases Proteins 0.000 description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010018924 Heme Oxygenase-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100028006 Heme oxygenase 1 Human genes 0.000 description 2
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 2
- 101000973778 Homo sapiens NAD(P)H dehydrogenase [quinone] 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000588302 Homo sapiens Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Proteins 0.000 description 2
- 101000686031 Homo sapiens Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Proteins 0.000 description 2
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 2
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 2
- 102100022365 NAD(P)H dehydrogenase [quinone] 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100031701 Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108091007960 PI3Ks Proteins 0.000 description 2
- QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M Pentobarbital sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=O)[N-]C1=O QGMRQYFBGABWDR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091008611 Protein Kinase B Proteins 0.000 description 2
- 102100023347 Proto-oncogene tyrosine-protein kinase ROS Human genes 0.000 description 2
- 239000009759 San-Chi Substances 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 2
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 2
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 2
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 2
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 2
- XWAIAVWHZJNZQQ-UHFFFAOYSA-N donepezil hydrochloride Chemical compound [H+].[Cl-].O=C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CC1CC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 XWAIAVWHZJNZQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229960002275 pentobarbital sodium Drugs 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 2
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 2
- 229940126680 traditional chinese medicines Drugs 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 238000009966 trimming Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- 230000003936 working memory Effects 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 1
- 241000721047 Danaus plexippus Species 0.000 description 1
- 206010013954 Dysphoria Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 102100032742 Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Human genes 0.000 description 1
- 101000823051 Homo sapiens Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 1
- 101000654725 Homo sapiens Histone-lysine N-methyltransferase SETD2 Proteins 0.000 description 1
- 101001046870 Homo sapiens Hypoxia-inducible factor 1-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000617536 Homo sapiens Presenilin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100022875 Hypoxia-inducible factor 1-alpha Human genes 0.000 description 1
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 1
- 108091036422 MiR-296 Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101000823042 Mus musculus Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004868 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090001041 N-Methyl-D-Aspartate Receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 206010033557 Palpitations Diseases 0.000 description 1
- 208000001431 Psychomotor Agitation Diseases 0.000 description 1
- 206010038743 Restlessness Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N Tin Chemical compound [Sn] ATJFFYVFTNAWJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000031971 Yin Deficiency Diseases 0.000 description 1
- ABUBSBSOTTXVPV-UHFFFAOYSA-H [U+6].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O Chemical compound [U+6].CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O.CC([O-])=O ABUBSBSOTTXVPV-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000019771 cognition Effects 0.000 description 1
- 230000007278 cognition impairment Effects 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 210000005257 cortical tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229960003530 donepezil Drugs 0.000 description 1
- 229960003135 donepezil hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003822 epoxy resin Substances 0.000 description 1
- 239000002389 essential drug Substances 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 102000055060 human PSEN1 Human genes 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000005470 impregnation Methods 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- RLJMLMKIBZAXJO-UHFFFAOYSA-N lead nitrate Chemical compound [O-][N+](=O)O[Pb]O[N+]([O-])=O RLJMLMKIBZAXJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000007087 memory ability Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 108091039097 miR-193b stem-loop Proteins 0.000 description 1
- -1 micropills Substances 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012346 open field test Methods 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229910052762 osmium Inorganic materials 0.000 description 1
- SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N osmium atom Chemical compound [Os] SYQBFIAQOQZEGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000647 polyepoxide Polymers 0.000 description 1
- 210000002442 prefrontal cortex Anatomy 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000004129 prosencephalon Anatomy 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000033764 rhythmic process Effects 0.000 description 1
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 1
- 230000006403 short-term memory Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006886 spatial memory Effects 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000004546 suspension concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000007939 sustained release tablet Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000003956 synaptic plasticity Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 1
- 235000010215 titanium dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002936 tranquilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/25—Araliaceae (Ginseng family), e.g. ivy, aralia, schefflera or tetrapanax
- A61K36/258—Panax (ginseng)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/53—Lamiaceae or Labiatae (Mint family), e.g. thyme, rosemary or lavender
- A61K36/537—Salvia (sage)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
- A61K36/77—Sapindaceae (Soapberry family), e.g. lychee or soapberry
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
- A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
- A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
- A61K36/898—Orchidaceae (Orchid family)
- A61K36/8988—Gastrodia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P39/00—General protective or antinoxious agents
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Botany (AREA)
- Alternative & Traditional Medicine (AREA)
- Mycology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Anesthesiology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明公开了一种中药复方，包括重量比为5‑8:5‑8:2‑4:2‑4:2的西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼。本发明用于气血不足、痰瘀互结之痴呆、眩晕、耳鸣、不寐等，主治健忘、短气乏力、语言迟缓，或有头晕、目眩、耳鸣、失眠等，面唇暗紫，舌质暗红或有瘀斑，脉细涩。
Description
技术领域
本发明涉及中药技术领域。更具体地说，本发明涉及一种中药复方及其药物组合物。
背景技术
天麻、西洋参、三七、丹参、龙眼是五味药食同源的中药。天麻平抑肝阳、祛外风通经络，乃治眩晕、头痛之要药，《本草纲目》曰：“天麻乃定风草，故为治风之神药”，西洋参益气养阴生津，主治气阴两虚，三七活血散瘀，止血不留瘀，化瘀不伤正，《医学衷中参西录》记载：“三七，善化瘀血，又善止血妄行”，主治瘀滞不通，丹参活血祛瘀生新、清心凉血除烦，功同四物，主治瘀血阻窍、烦躁不安、心悸失眠，龙眼补益心脾、养血安神。本研究在此基础上进一步通过实验探索五药配伍合方的安全性与有效性。
发明内容
本发明的目的是解决至少上述问题，提供一种中药复方及其组合物，其用于气血不足、痰瘀互结之痴呆、眩晕、耳鸣、不寐等，主治健忘、短气乏力、语言迟缓，或有头晕、目眩、耳鸣、失眠等，面唇暗紫，舌质暗红或有瘀斑，脉细涩。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种中药复方，包括重量比为5-8:5-8:2-4:2-4:2的西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼。
优选的是，所述西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼均为水提物或醇提物。
优选的是，所述西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼均为原药直接研磨成粉末。
优选的是，所述药物含有所述中药复方和药学上可接受的载体。
优选的是，药学上可接受的载体包括稀释剂、增溶剂、潜溶剂、崩解剂、分散剂、润滑剂、矫味剂、抗氧剂、粘合剂、吸收剂、湿润剂、缓冲剂、交联剂。
优选的是，所述药物被制成药学上允许的剂型。
优选的是，所述剂型包括丸剂、片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、滴丸、滴剂、喷雾剂、注射剂、混悬液、凝胶剂、栓剂。
优选的是，所述剂型为散剂。
优选的是，所述药物中的中药复方的给药剂量为不低于0.4mg/kg·d。
本发明至少包括以下有益效果：天麻为君药，西洋为臣药，天麻祛邪，西洋参扶正，二药相须为用，三七为臣药，丹参为佐药，龙眼为使药；五药合用，补虚与活血相伍，养血与祛瘀同施，扶正而不留瘀，祛瘀而不伤正，共奏补气养血、通阳散结、活血通络之功，用于气血不足、痰瘀互结之痴呆、眩晕、耳鸣、不寐等，主治健忘、短气乏力、语言迟缓，或有头晕、目眩、耳鸣、失眠等，面唇暗紫，舌质暗红或有瘀斑，脉细涩。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为干预前的Y迷宫自发交替实验与新物体识别实验；
图2为干预后小鼠的逃避潜伏期折线图；
图3为Morris水迷宫空间探索实验结果；
图4为Y迷宫实验结果；
图5为新物体识别实验结果；
图6为血常规检测结果；
图7为各组小鼠的HE染色结果。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
1 实验材料与试剂
1.1 实验仪器
1.2实验试剂
2药物制备
中药复方由“西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼”五味药按照6:6:3:3:2的比例制成散剂，由广西中医药大学第一附属医院药房提供。称量中药复方，加入生理盐水中搅拌混匀，充分溶解，制成浓度为80mg/mL的中药复方水溶液，放入SB-800DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)震荡混匀，现配现用。
盐酸多奈哌齐由植恩生物技术股份有限公司生产，规格：5mg/片，批准文号：国药准字H20010723，产品批号：22040005，用生理盐水配制成浓度0.065mg/mL水溶液，4℃冰箱中备用。
3 实验分组及干预
3.1 实验动物分组及标记
64只SPF级雄性6月龄APP/PS1转基因小鼠(APP/PS1是双转基因小鼠，表达嵌合的小鼠/人淀粉样蛋白前体蛋白(Mo/HuAPP695swe)和突变的人早老蛋白1(PS1-dE9)，二者都定位于CNS神经元)和13只雄性APP/PS1阴性小鼠，由江苏华创信诺医药科技有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(苏)2020-0009，实验动物使用许可证号：SYXK(苏)2020-0041，实验动物质量合格证号：202245603。所有涉及动物的实验程序均经广西中医药大学实验动物福利与伦理委员会审查批准，审核批号：DW20220707-188，实验过程中所有研究设计及操作均符合替代(Replace)、减少(Reduce)及优化(Refine)的3R原则。所有小鼠饲养于广西中医药大学动物实验中心SPF级实验室，实验动物使用许可证号：SYXK(桂)2019-0001，动物实验操作人员培训证号22070901。
3.2适应性喂养1周期间小鼠实验室干预管理
温湿度：配合动物房情况，进行合理通风，保持一定的温度和湿度。温度和湿度要按照国际规定进行相关设定和控制。温度：(23±2)℃，每日观察温度，必要时调整温度。相对湿度：50％。噪音：60分贝以下。光照：要进行昼夜光照，模拟自然环境。照明：12小时，每日8:00开灯，20:00关灯。氨气：为了保持空气新鲜，控制在20ppm以下。换气：15次/小时。气流：20厘米/分。笼具：每周换一次小鼠笼具内的SPF玉米芯垫料(北京科奥协力饲料有限公司)。饲料：购买氮气包装C060辐照实验鼠维持饲料(江苏省协同医药生物工程有限责任公司)喂养小鼠。小鼠自由摄食、饮水。小鼠采食以夜间为主，每天下午15点加满饲料及饮水，并于次日早上8点检查，补充缺料笼具的饲料。饮水：每3天洗一次饮水瓶，并注意及时添加新鲜洁净的饮水。
3.3小鼠分组及行为学检测
13只APP/PS1阴性雄性小鼠作为空白对照组(Blank control group，CON)，64只APP/PS1雄性实验小鼠按照随机区组法分为4组：模型组(Model group，MOD)、中药复方低剂量组(Low dose group powder，LDG)、中药复方高剂量组(High dose group of powder，HDG)、盐酸多奈哌齐组(Donepezil group，DON)，每组16只。适应性喂养7天后行Y迷宫自发交替实验与新物体识别实验评估药物干预前各组小鼠的记忆能力与探索能力。
①Y迷宫自发交替实验(Y-maze Spontaneous Alternation Test，YSA)
各组小鼠给药前及给药结束后进行Y迷宫实验测试。Y迷宫装置由三个长35cm、宽5cm、高15cm的完全相同、臂间夹角120°的黑色不透明支臂组成，三个臂末端贴有不同图案标志。Y迷宫底部薄薄的铺一层垫料，每只小鼠实验前将垫料搅拌混合均匀平铺，以排除上一只小鼠的行走路线及气味的干扰。三臂依次标记为A、B、C，小鼠交替探索三个不同臂(例如ABC，ACB，BAC，BCA，CAB，CBA)作为实际转换次数(Alternation)。非交替探索三个不同臂(例如BCB、ACA、BAB等)则不计入转换次数。探索进臂总次数减两次作为最大转换数。
实验时保持室内安静，正式实验前将每只小鼠放入Y迷宫适应5min。间隔1h后开始正式实验，将小鼠放入Y迷宫A臂，确保每只小鼠头部方向一致。软件实时监测记录5min内小鼠进入三个臂的总次数(N)以及进臂顺序。小鼠连续进入3个不同支臂为1次正确交替反应，同时记录正确交替反应次数。自发交替准确率(％)＝正确交替反应次数/(进入三个臂的总次数-2)×100％。自由交替反应率为评估小鼠的短期记忆能力(工作记忆)、空间位置觉和方向觉的辨别能力和片段式记忆的指标。
②新物体识别实验(Novel Object Recognition Tests，NOR)
新物体识别实验在50×50×50cm3的四周周壁黑色的旷场测试箱中进行，箱底部薄薄的铺一层垫料，每只小鼠实验前将垫料搅拌混合均匀平铺，以排除上一只小鼠的行走路线及气味的干扰。整个实验过程保持环境安静，尽量避免产生干扰小鼠行为的因素。实验过程分为训练期和检测期，分别观察小鼠5min自由探索过程。训练期在置物放置a1、a2两个相同的物体，检测期将a2物体换为b物体，依次将小鼠由距两物体相同距离的同一位置面向箱壁放入箱内，通过摄像头开始记录小鼠探索新旧物体的时间与活动行为。分别记录小鼠接触两个物体的时间及次数，小鼠鼻尖接触或距离识别物体距离不超过2cm视为探索行为。检测期计算新物体认知指数(Object Recognition index)＝Tb/(Ta1+Tb)×100％，新物体认知指数变化率(Discrimination index)＝(Tb-Ta1)/(Ta1+Tb)。Tb:b物体(新物体)探索时间(秒)；Ta1:a1物体(旧物体)探索时间(秒)。
3.4药物干预
完成Y迷宫自发交替实验、新物体识别实验测试小鼠的行为学表现后予灌胃给药。中药复方的给药剂量按照临床人与小鼠体表面积折算等效剂量给药。每只小鼠10mL/kg·d，每次灌药前给所有小鼠统一称好体重，按编号记录并计算好每只老鼠中药的使用剂量后按组依次灌药，连续灌服4周；模型组、空白对照组均予等体积生理盐水灌胃，持续灌胃给药4周后进行指标检测。
①空白对照组：每天给予等体积生理盐水灌胃1次；
②模型组：每天给予等体积生理盐水灌胃1次；
③中药复方低剂量组：每天给予0.4g/kg的中药复方灌胃1次；
④中药复方高剂量组：每天给予0.8g/kg的中药复方灌胃1次；
⑤盐酸多奈哌齐组：每天给予0.65mg/kg的多奈哌齐混悬液灌胃1次。
3.5取材、样品制备
(1)血清样品制备：中药复方灌胃给药4周结束后，记录所有实验小鼠体重，样本采集前12h禁食不禁水。小鼠予0.3％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射进入完全麻醉状态后，眼球取血，全血静置后，3000r/min，15min无菌离心分离血清，分装后-80℃保存直至检测。
(2)小鼠海马组织与全脑采集与预处理：小鼠予0.3％戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射进入完全麻醉状态完成采血后，通过颈椎脱臼处死。在冰上迅速取出全脑，分离皮层组织和海马，称海马重量。海马组织用锡箔纸包装，置于液氮罐中保存。其次留取包含完整海马的脑段，迅速置于4％多聚甲醛中固定24h。将固定好的组织经过梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋，常规切片，制备若干张包含海马最大面的连续冠状切片，厚度5μm。行HE染色与免疫组化染色，观察海马组织学改变。
(3)其他组织器官采集：小鼠脱颈处理后，摘取心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、结肠等组织器官，并在生理盐水中洗涤，滤纸吸干表面水分。迅速将组织浸入4％多聚甲醛溶液固定进行组织病理学检测，暂未检测的组织于液氮速冻并储存于-80℃超低温冰箱中待用。
(4)小鼠粪便采集：药物干预第28天，将小鼠依次放入干净的代谢笼，每笼1只。待小鼠排便后，立即用冻存管收集各组小鼠新鲜的粪便(≥100mg)，收集迅速装入无菌冻存管中放入液氮中速冻，30min后再将冻存管移入-80℃冰箱中保存。
3.6观察指标及检测方法
3.6.1小鼠行为学分析
小鼠行为学分析在广西中医药大学科学实验中心的动物行为学室内完成，行为学室温度23±1℃，光照节律为12/12小时，早7点至晚19点进行光照。在行为学测试开始前实验人员与小鼠充分熟悉，并提前转移小鼠到行为学室适应环境，以减轻测试中带来的应激反应。
3.6.1.1Morris水迷宫实验(Morris Water Maze Tests，MWM Tests)
将直径120cm、高50cm的圆形水池分为4个象限，池内水深26cm，水温维持在23±1℃。目标象限内距离池壁35cm处放置1个直径10cm、高25cm的圆形站台，站台位于钛白粉染成白色的池水下1cm，避免小鼠看到平台。目标象限池壁上粘贴一个边长15cm的绿色等边三角形塑料标志，作为小鼠记忆及判断空间位置的引导物。水迷宫上方安置连接显示系统的摄像机，同步记录小鼠的活动轨迹。适应性训练后开展正式实验。
定位航行实验：每天将各组小鼠分别从四个象限入水点面向池壁放入水中，记录小鼠在入水60s内找到水下圆形平台后四肢爬上平台并停留超过10s所需时间，记录为逃避潜伏期；超过60s则记录该小鼠逃避潜伏期为60s，并引导小鼠在平台停留10s。实验完成后擦干每只小鼠并使用取暖器烘干小鼠毛发的水。每只小鼠每天实验4次，连续5天，观察小鼠的学习与记忆过程。
空间搜索实验：第6天撤掉圆形平台，将小鼠面向池壁放入水中，记录60s内小鼠经过路径及在原目标象限滞留时间、经过原目标平台的次数，作为空间记忆的检测指标。
3.6.1.2Y迷宫自发交替实验(Y-maze Spontaneous Alternation Test，YSA)
方法如前文所述。
3.6.1.3新物体识别实验(Novel Object Recognition Tests，NOR)
方法如前文所述。
3.6.2组织石蜡包埋切片
3.6.2.1取材：新鲜组织固定于4％多聚甲醛24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
3.6.2.2脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4h-85％酒精2h-90％酒精2h-95％酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-蜡I1h-蜡II 1h-蜡III 1h。
3.6.2.3包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
3.6.2.4切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚4μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
3.6.3HE染色
3.6.3.1石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗。
3.6.3.2苏木素染细胞核：切片入Harris苏木素染3-8min，自来水洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，0.6％氨水返蓝，流水冲洗。
3.6.3.3伊红染细胞质：切片入伊红染液中染色1-3min。
3.6.3.4脱水封片：将切片依次放入95％酒精I 5min-95％酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-二甲苯Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
3.6.3.5显微镜镜检：图像采集分析。
3.6.4透射电镜分析
取出脑组织放进3％戊二醛中固定24h后，PBS缓冲液洗涤，2％锇酸固定2h，再予丙酮脱水3次，环氧树脂混合液浸泡、包埋24h，修块、定位，甲苯氨蓝染色观察，超薄切片后予醋酸铀、硝酸铅双重染色，透射电镜观察海马神经元、神经元线粒体等超微结构。
3.6.5细胞凋亡分析
采用TUNEL法检测。将HE染色中4μm连续石蜡切片用PBS缓冲液洗涤3次后，荧光显微镜观察海马尤其是CA1区细胞凋亡情况，使用计算机图像处理系统，每张切片随机选取10个视野测定凋亡细胞计数，并采集图像。
3.6.6ELISA检测
取1g小鼠海马组织，按小鼠海马组织与生理盐水体积比值为1:9的比例加入冰生理盐水，充分研磨制备成海马组织匀浆。4℃条件下予2500r/min离心10min，取上清液，ELISA法测定Aβ1-42、Tau、APP。
3.6.7Real-time PCR分析
分析miR-193b、miR-296、Aβ1-42、Tau、APP、EGFR、PI3K、Akt、MAPK、ERK、FN1、HIF-1α、BDNF、ROS、HO-1、NQO1、Nrf2的mRNA表达。采用Trizol法提取海马组织总RNA，紫外分光法分析RNA浓度和纯度。将总RNA逆转录合成cDNA。设计并合成相关目的基因引物，然后进行实时荧光定量PCR，分析相关基因mRNA水平。
3.6.8Western blot分析
分析Aβ、Tau、APP、MAPK、FN1、EGFR、PI3K、Akt、HIF-1α、ERK、BDNF、ROS、HO-1、NQO1、Nrf2蛋白表达。称取各组海马组织50mg，加入500μL体积的混合裂解液，采用组织匀浆器将海马组织匀浆碎裂，超声裂解仪裂解30s后开启低温高速离心(4℃，15000rpm，15min)。运用BCA试剂盒检测蛋白样品浓度后进行SDS-PAGE电泳，Western转膜，将膜与一抗、二抗孵育，最后化学发光法显影。
4统计学方法
采用SPSS25.0统计软件进行数据统计处理，GraphPad Prism 8软件进行数据分析作图。首先进行正态性及方差齐性检验，如果各组均满足正态分布且方差齐，两组间总体均数比较采用t检验；多组间总体均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，如果组间差异有统计学意义，进一步采用Bonferroni法进行两两比较。非正态分布或方差不齐时，两组间总体分布采用非参数Mann-Whitney U检验；多组间比较采用Kruskal-Wallis检验，如果组间差异有统计学意义，进一步采用Bonferroni校正检验进行两两比较，P＜0.05为差异具有统计学意义。
5结果
5.1药物干预前各组小鼠的行为学基线资料分析
本研究通过Y迷宫自发交替实验与新物体识别实验测试并量化APP/PS1小鼠的认知缺陷程度。Y迷宫自发交替实验是一种检测啮齿类动物探索新环境的意愿、行动能力、短时工作记忆能力的行为学测试。啮齿动物通常喜欢探索新区域，而非熟悉的区域，这与海马、前额叶皮层、基底前脑和隔膜等脑区域功能相关。新物体识别实验是基于啮齿类动物(比如小鼠)喜欢探索新事物、产生趋向行为的原理来检测其识别记忆能力的行为学测试，实验过程没有引起小鼠强烈的厌烦因素(如畏水与电击等)，不对小鼠产生不良刺激，且较为客观。新物体识别实验可以研究小鼠的探索能力和短期的非空间近记忆能力，评价动物的视觉物体识别记忆的完整性和注意力。干预前APP/PS1组小鼠的Y迷宫自发交替准确率(Z＝-3.267，P＝0.001＜0.05)与新物体认知指数(T＝3.65，P＝0.00＜0.05)低于CON组(图1A、1B)，(**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，与CON组相比)。APP/PS1小鼠按照随机区组法分为MOD组、LDG组、HDG组、DON组，4组APP/PS1小鼠的Y迷宫自发交替准确率与新物体认知指数合计得分值差异没有统计学意义(F＝0.040，P＝0.989＞0.05)，且4组APP/PS1小鼠的Y迷宫自发交替准确率与新物体认知指数合计得分值都低于CON组(P＜0.05)(图1C)。
5.2药物干预后各组小鼠的行为学结果
5.2.1Morris水迷宫定位航行实验的逃避潜伏期比较
Morris水迷宫定位航行实验可以观察小鼠的学习与记忆过程。水迷宫定位航行实验第1天各组逃避潜伏期的差异无统计学意义(P＞0.05)；至第3天各组的差异尚无统计学意义(H＝8.241，P＝0.083＞0.05)；随着小鼠在Morris水迷宫定位航行实验中的学习，从干预后小鼠的逃避潜伏期比较表(表1)与折线图(图2)可以明显看出，HDG组、LDG组、DON组、CON组小鼠的逃避潜伏期明显缩短，至实验第4天(H＝42.93，P＝0.000＜0.05)与第5天(H＝49.74，P＝0.000＜0.05)各组逃避潜伏期的差异有统计学意义，HDG组、LDG组、DON组、CON组小鼠找到平台的时间较MOD组减少，差异有统计学意义(P＜0.05)，显示HDG组、LDG组、DON组、CON组小鼠在Morris水迷宫定位航行实验中的学习与
表1
5.2.2Morris水迷宫空间探索实验结果
MWM实验通过强迫实验动物游泳，学习、记忆并寻找水中隐藏平台，评估动物的空间位置学习能力和记忆能力，与海马的突触可塑性和NMDA受体功能相关，是研究动物认知功能的经典行为学检测方法。本研究的空间探索实验结果显示，与CON组相比，MOD组小鼠的游泳路径杂乱、无目的性，无明显寻找标志物、目标象限及目标平台的趋向性；LDG组、HDG组、DON组小鼠的游泳路径较MOD组相比，具有寻找标志物、目标象限及平台的目的性(图3A)。
各组的小鼠平均游泳速度差异有统计学意义(H＝47.76，P＝0.00＜0.05)，HDG组、LDG组、DON组、CON组小鼠平均游泳速度较MOD组快，差异有统计学意义(P＜0.001)，表明MOD组小鼠运动能力较CON组下降，HDG组、LDG组、DON组干预后APP/PS1小鼠的运动能力改善(图3B，***表示P＜0.001，与MOD组相比)。
各组小鼠的目标平台象限滞留时间的差异有统计学意义(H＝12.679，P＝0.013＜0.05)，其中HDG组(P＝0.02＜0.05)与CON组(P＝0.03＜0.05)的目标平台象限滞留时间长于MOD组(图3C，*表示P＜0.05，与MOD组相比)。各组小鼠的目标平台象限与目标平台对侧象限时间之比的差异也有统计学意义(H＝21.54，P＝0.000＜0.05)。CON组(P＝0.043＜0.05)、LDG组(P＝0.001＜0.05)、HDG组(P＝0.000＜0.05)、DON组(P＝0.022＜0.05)的目标平台象限与目标平台对侧象限时间之比高于MOD组。
各组小鼠的穿越原目标平台次数的差异有统计学意义(H＝14.10，P＝0.007＜0.05)，CON组(P＝0.039＜0.05)、LDG组(P＝0.011＜0.05)、DON组(P＝0.033＜0.05)穿越原目标平台次数多于MOD组，差异有统计学意义(图3D，*表示P＜0.05，与MOD组相比)。
5.2.2Y迷宫实验结果
各组小鼠进入Y迷宫三臂运动的总次数的差异无统计学意义(F＝1.943，P＝0.113＞0.05)(图4A)，Y迷宫自发交替准确率的差异有统计学意义(H＝16.38，P＝0.003＜0.05)。CON组、HDG组Y迷宫自发交替准确率分别为75％与73％，优于MOD组的58％，差异有统计学意义(图4B，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，与MOD组相比)。
5.2.3新物体识别实验结果
新物体识别实验中MOD组小鼠相较于CON组小鼠，探索新物体的行为与时间减少，LDG组、HDG组、DON组小鼠探索新物体的行为与时间增加(图5A)。各组小鼠的新物体认知指数与新物体认知指数变化率的差异有统计学意义(H＝9.52，P＝0.049＜0.05)。DON组与MOD组的新物体认知指数分别为68％与47％，DON组与MOD组的新物体认知指数变化率分别为37％与-7％，差异有统计学意义(图5B，*表示P＜0.05，与MOD组相比)。5.3药物干预后各组小鼠的血常规检测结果
为了进一步研究中药复方的安全性，本研究检测干预后各组小鼠的血常规检测结果的变化情况。结果显示各组小鼠的血常规检测结果超出正常区间的个例甚少。统计分析显示干预后的血常规各项指标均值都在正常参考区间，其中HGB检验结果的差异有统计学意义(H＝13.77，P＝0.008＜0.05)，进一步分析显示LDG组与HDG组的HGB检验结果高于CON组，差异有统计学意义(P＝0.04＜0.05)。各组小鼠的RBC(H＝9.308，P＝0.054＞0.05)、WBC(H＝6.453，P＝0.168＞0.05)、PLT(F＝0.944，P＝0.444＞0.05)的差异无统计学意义(图6，*表示P＜0.05，与CON组相比)。
5.4干预后各组小鼠的HE染色结果
药物干预后的HE染色显示，CON组脑组织海马区CA1神经元排列整齐紧密，胞体轮廓清晰，大小较为均一，未见明显变性，数量未见减少。MOD组海马CA1区神经元损伤严重，细胞数量减少，排列紊乱，大量神经变性，胞体浓缩深染，形状不规则，部分可见病理性纤维缠结，凋亡细胞数明显增加(图7黑色箭头所示)。DON组海马CA1区神经元结构极轻度异常，神经排列整齐紧密，偶见变性，如黑色箭头所示，损伤程度较MOD组明显改善。LDG组海马CA1区域神经元排列较为整齐，细胞数量未见减少，部分神经变性，胞体浓缩深染，损伤程度较模型组明显改善；HDG组海马CA1区域神经元排列较为整齐，偶见细胞变性，胞体深染，损伤程度较模型组明显改善。
本发明中药复方包括重量比为5-8:5-8:2-4:2-4:2的西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼。所述西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼均为水提物或醇提物。或者，所述西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼均为原药直接研磨成粉末。
本发明中药复方可以直接使用，或者以药物制剂的形式使用。
所述药物制剂含有治疗有效量的本发明中药复方，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和赋形剂。
所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物制剂以单位体重服用量的形式使用。本发明用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂(纳米制剂)、口服液等。
这里说明的设备数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不悖离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (8)
1.一种提升认知功能的中药组合物，其特征在于，该中药组合物由重量比为6:6:3:3:2的西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼制成。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼均为水提物或醇提物。
3.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，所述西洋参、天麻、三七、丹参、龙眼均为原药直接研磨成粉末。
4.一种提升认知功能的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由权利要求1所述的中药组合物和药学上可接受的载体制成。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，药学上可接受的载体选自稀释剂、增溶剂、潜溶剂、崩解剂、分散剂、润滑剂、矫味剂、抗氧剂、粘合剂、吸收剂、湿润剂、缓冲剂、交联剂中的一种或多种。
6.如权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物被制成药学上允许的剂型。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述剂型选自：丸剂、片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、滴剂、喷雾剂、注射剂、混悬液、凝胶剂、栓剂。
8.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述剂型为散剂或滴丸。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211675138.2A CN116270901B (zh) | 2022-12-26 | 2022-12-26 | 中药复方及其药物组合物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211675138.2A CN116270901B (zh) | 2022-12-26 | 2022-12-26 | 中药复方及其药物组合物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116270901A CN116270901A (zh) | 2023-06-23 |
| CN116270901B true CN116270901B (zh) | 2023-11-10 |
Family
ID=86829425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211675138.2A Active CN116270901B (zh) | 2022-12-26 | 2022-12-26 | 中药复方及其药物组合物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116270901B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101849979A (zh) * | 2009-11-06 | 2010-10-06 | 中山市中智药业集团有限公司 | 中药组合物颗粒剂及其制备方法 |
| CN102771791A (zh) * | 2012-08-13 | 2012-11-14 | 广州白云山和记黄埔中药有限公司 | 一种保健食品及其制备方法及其用途 |
| CN103533948A (zh) * | 2011-03-29 | 2014-01-22 | 百疗医株式会社 | 神经疾病的治疗及记忆力减退改善用生药组合物 |
| CN108567914A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-09-25 | 厦门元之道生物科技有限公司 | 一种具有改善睡眠作用的中药制剂及其制备方法和应用 |
| CN110575500A (zh) * | 2018-06-11 | 2019-12-17 | 刘代芬 | 一种用于清理血管壁的药物组合物 |
| CN114344414A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-04-15 | 甘肃朴森药业有限公司 | 一种安神助眠的中药组合物及制备方法与应用 |
-
2022
- 2022-12-26 CN CN202211675138.2A patent/CN116270901B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101849979A (zh) * | 2009-11-06 | 2010-10-06 | 中山市中智药业集团有限公司 | 中药组合物颗粒剂及其制备方法 |
| CN103533948A (zh) * | 2011-03-29 | 2014-01-22 | 百疗医株式会社 | 神经疾病的治疗及记忆力减退改善用生药组合物 |
| CN102771791A (zh) * | 2012-08-13 | 2012-11-14 | 广州白云山和记黄埔中药有限公司 | 一种保健食品及其制备方法及其用途 |
| CN110575500A (zh) * | 2018-06-11 | 2019-12-17 | 刘代芬 | 一种用于清理血管壁的药物组合物 |
| CN108567914A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-09-25 | 厦门元之道生物科技有限公司 | 一种具有改善睡眠作用的中药制剂及其制备方法和应用 |
| CN114344414A (zh) * | 2022-01-29 | 2022-04-15 | 甘肃朴森药业有限公司 | 一种安神助眠的中药组合物及制备方法与应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116270901A (zh) | 2023-06-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN102548571A (zh) | 用于预防和治疗脑部疾病和疾病状态的组合物和方法 | |
| Durán et al. | Cerebellum and spatial cognition in goldfish | |
| CN116270901B (zh) | 中药复方及其药物组合物 | |
| CN102784160B (zh) | 连翘苷作为唯一活性成分在制备改善认知功能及治疗阿尔茨海默症药物中的应用 | |
| CN109512870B (zh) | 药物组合物及其制备方法和应用 | |
| CN115644455B (zh) | 牛脾肽粉在改善肠道功能中的用途 | |
| Deba et al. | An animal model to test reversal of cognitive decline associated with beta-amyloid pathologies | |
| CN102813646B (zh) | 高芒果苷在制备防治老年痴呆及记忆力减退药物中的应用及其药物组合物与制剂 | |
| CN112119977B (zh) | Cd317诱导的抑郁和记忆损伤的小鼠模型的构建方法及其应用 | |
| CN114869919A (zh) | 海藻及其提取物在制备抗神经炎症药物上的应用及抗神经炎症药物 | |
| CN101548987B (zh) | 一种用于降解β淀粉样蛋白的细胞培养提取物及其制备方法和应用 | |
| CN107029023B (zh) | 一种中药组合物及应用 | |
| CN103969394A (zh) | 一种治疗阿尔茨海默病的药物的质量检测方法 | |
| CN110090274A (zh) | 一种治疗鸡肾肿湿热症的中药组合物及制备方法和应用 | |
| CN109364097A (zh) | 瓜尔豆胶在制备抗抑郁症药物及保健品中的应用 | |
| Finbarrs-Bello et al. | Effect of combination of three herbs (Akaki extract) on frontal lobe of the albino Wistar rat | |
| CN108403881A (zh) | 一种治疗老年痴呆的药物组合物及其制备方法与用途 | |
| CN109846950A (zh) | 柠檬提取物在制备预防或治疗阿尔茨海默病导致的认知障碍药物中的应用 | |
| CN109289002B (zh) | 一种药食同源的组合物 | |
| CN113367327B (zh) | 一种生酮饮食在预防单纯疱疹病毒性脑炎中的应用 | |
| CN115364164B (zh) | 一种治疗肝郁型失眠的中药组合物及其应用 | |
| CN114209717A (zh) | 鹿胶及其药物组合物和用途 | |
| Kuru et al. | Electroencephalographic and behavioral effects of intracerebroventricular or intraperitoneal injections of toxic honey extract in adult Wistar rats and GAERS | |
| Nomso et al. | Effects of Ethanol Extract Leaves of Nymphaea lotus (water lily) on Learning and Memory in CD-1 Mice | |
| CN115813917A (zh) | 一种具有快速改善认知功能的化合物及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |