CN116270626A - 一种去甲哈尔满在制备抗菌剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种去甲哈尔满在制备抗菌剂中的应用，本发明中群体感应抑制剂Norharmane与阿奇霉素联合应用时，存在明显的协同增效作用，可在不抑制细菌生长的情况下抑制细菌相关毒力因子的表达，从而减弱细菌的毒力，在体内对耐药性铜绿假单胞菌具有良好的抗菌效果。对耐药性铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠，能显著提升感染后小鼠的生存率和降低小鼠肺部的细菌负荷，并且能降低小鼠肺部炎症因子水平和改善肺泡结构损伤，在获得相同的抗菌效果下，可显著降低给药剂量，从而降低药物的副作用。Norharmane联合阿奇霉素作为抗细菌耐药性抗菌药物或抗生素辅助治疗药物的开发提供支持。

Description

一种去甲哈尔满在制备抗菌剂中的应用

(一)技术领域

本发明涉及药学领域，具体涉及一种群体感应抑制剂去甲哈尔满(Norharmane)与阿奇霉素联合在制备抗菌剂中的应用。

(二)背景技术

细菌感染一直以来都是人类所面对的一个重大健康挑战，但自抗生素问世以来，这一问题得到了有效解决。然而，随着抗生素的广泛使用和随意滥用，抗生素耐药性问题逐渐显现，许多抗生素在其上市后的几年内就出现了耐药性。与此同时，新型抗生素的开发速度逐渐减慢。据2016年发表的《全球抗菌药物耐药回顾》估计，如果目前的情况得不到改善，到2050年全球每年将有1000万人死于耐药菌感染。2020年WHO发布的《2019年全球卫生估计报告》仍指出，目前抗感染药物的需求并未解决。

因此，亟需寻找新的靶点来开发能抵抗细菌耐药性的新的抗菌药物。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种去甲哈尔满在制备抗菌剂中的应用，将群体感应抑制活性的小分子化合物去甲哈尔满与阿奇霉素联用，不仅能够显著降低铜绿假单胞菌的毒力因子，能显著提升肺炎小鼠的生存率并降低小鼠肺部细菌负荷，降低小鼠肺部炎症因子水平和改善肺泡结构损伤；并在临床试验中对铜绿假单胞菌引起肺囊性纤维化患者表现出良好的治疗效果。二者联用时，在多种细菌感染模型小鼠中具有协同增效作用，包括铜绿假单胞菌肺炎模型、大肠杆菌大腿感染模型和金黄色葡萄球菌腹膜炎模型；并且在获得相同的抗菌效果下，显著降低给药剂量。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种去甲哈尔满在制备抗菌剂中的应用，所述抗菌剂为去甲哈尔满与阿奇霉素的混合。

优选的，所述去甲哈尔满以盐酸盐形式作用，所述阿奇霉素以盐酸阿奇霉素形式作用，所述去甲哈尔满盐酸盐与盐酸阿奇霉素以质量比3:1-4混合，更优选3:2.7。

所述Norharmane结构式为：

所述阿奇霉素的结构式为：

优选的，所述抗菌剂为耐药铜绿假单胞菌肺炎抑菌剂，所述耐药铜绿假单胞菌为耐药铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)GDMCC No：61027。

优选的，所述抗菌剂为治疗肺囊性纤维化药物。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

1、本发明中群体感应抑制剂Norharmane与阿奇霉素联合应用时，在体内对耐药性铜绿假单胞菌具有良好的抗菌效果。对耐药性铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠，能显著提升感染后小鼠的生存率和降低小鼠肺部的细菌负荷，并且能降低小鼠肺部炎症因子水平和改善肺泡结构损伤。

2、Norharmane和阿奇霉素均可在不抑制细菌生长的情况下抑制细菌相关毒力因子的表达，从而减弱细菌的毒力，具有防止铜绿假单胞菌产生耐药的潜力。

3、Norharmane与阿奇霉素联合应用时在多种细菌感染模型中存在明显的协同增效作用，包括铜绿假单胞菌肺炎模型、大肠杆菌大腿感染模型和金黄色葡萄球菌腹膜炎模型，在获得相同的抗菌效果下，可显著降低给药剂量，从而降低药物的副作用。

4、Norharmane联合阿奇霉素作为抗细菌耐药性抗菌药物或抗生素辅助治疗药物的开发提供支持。

(四)附图说明

图1、Norharmane和阿奇霉素对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠生存率的影响。

图2、Norharmane和阿奇霉素对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠肺部细菌负荷的影响。

图3、小鼠肺组织扫描电镜。

图4、小鼠肺匀浆液中炎症因子水平。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：去甲哈尔满与阿奇霉素联合应用在铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠中的抗菌效果

1.材料

1.1药品与试剂

Norharmane，上海毕得医药有限公司；

阿奇霉素，罗恩试剂有限公司；

生理盐水，上海源叶生物科技有限公司；

浓盐酸，国药集团化学试剂有限公司；

环磷酰胺，上海毕得医药有限公司；

胰蛋白胨，上海阿拉丁试剂有限公司；

酵母提取物，国药集团化学试剂有限公司；

琼脂，国药集团化学试剂有限公司；

氯化钠，国药集团化学试剂有限公司；

甲醇，上海泰坦科技股份有限公司；

磷酸氢二钠，上海麦克林生化科技有限公司；

氢氧化钠，国药集团化学试剂有限公司；

无菌PBS缓冲液，博士德生物工程有限公司；

去甲哈尔满碱盐酸盐(去甲哈尔满碱·HCl)注射液：100mg的去甲哈尔满用7-8mL甲醇溶解后，加入1-2mL过量浓盐酸，室温下磁力搅拌反应6h，反应完成后旋干除去体系内甲醇、多余盐酸及水，即得到去甲哈尔满盐酸盐固体123mg，使用时根据所需要的浓度用生理盐水现用现配，并用0.22μm滤膜过滤。

阿奇霉素盐酸盐注射液：首先配制1mol/L盐酸水溶液和1mol/L磷酸氢二钠水溶液备用。称取100mg阿奇霉素固体，加4ml生理盐水，搅拌混悬缓慢滴加盐酸水溶液使之充分反应，再用Na₂PO₄调节pH为6.5-8.0。过0.22μm滤膜，并从滤膜上补加生理盐水至10ml，使用时用生理盐水根据所需浓度稀释。

培养基：

(1)LB液体培养基：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，混合均匀后在25℃用1mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2±0.2，分装到250mL锥形瓶后在121℃，1×10⁵Pa下灭菌20min，备用。

(2)LB琼脂培养基：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，溶剂为水，混合均匀后加入质量浓度1.5％-2.0％的琼脂粉，在25℃用1mol/L的NaOH溶液调节pH为7.2±0.2，121℃，1×10⁵Pa下灭菌20min，倒平板备用。

1.2仪器

SW-CJ-IFB净化工作台，苏州安泰空气技术有限公司；

LDZF-75L-I立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；

LRH-250生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；

ZS-AR恒温培养振荡器，浙江华源仪器有限公司；

YH-M3001电子天平，东阳市英衡智能设备有限公司；

BCE224i-ICCN分析天平，德国Sartorius公司；

DELTA320台式pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；

IKA C-MAG HS7磁力搅拌器，艾卡仪器设备有限公司；

IKA RV3eco旋转蒸发仪，艾卡仪器设备有限公司；

1.3实验菌株

实验菌株：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)C218，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61027，保藏日期为2020年5月13日，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510075，已在专利申请CN11235801A中公开。

1.4实验动物

健康无特异性病原体(SPF)的ICR小鼠(20±2g)，来自杭州杭斯生物科技有限公司(中国杭州)。小鼠饲养条件为温度20～26℃，相对湿度40％～70％，每12h进行一次明暗循环，小鼠可自由获取食物和水。

2.内容与方法

2.1Norharmane联合阿奇霉素对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠生存率的影响

(1)菌液制备

-80℃下保存的铜绿假单胞菌GDMCC No：61027冻存液室温下解冻后，划线接种到LB琼脂培养基上，37℃培养24h，取发育良好的单一菌落再次接种，37℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取单菌落，接种到LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。用无菌生理盐水调节菌液浓度至OD₆₀₀为0.5-0.8，备用。

(2)诱导免疫抑制

所有小鼠适应性饲养一周后，腹腔注射环磷酰胺诱导免疫抑制，前4天给予150mg/kg/天，第5天给予100mg/kg/天。

(3)肺炎模型建立

免疫抑制诱导完成后次日开始进行造模，采用鼻内接种的方式感染小鼠：将小鼠直立，吸取20μl菌液滴于小鼠一侧鼻孔，5-10min后再吸取20μl滴于另一侧鼻孔，观察模型诱导后小鼠的一般状态，如呼吸急促、毛发竖立、颤抖等，确定模型构建成功。

(4)分组及给药

将27只雌性模型小鼠随机分为模型对照组(n＝8)、Norharmane·HCl 12mg/kg组(n＝8)、盐酸阿奇霉素组(22mg/kg，n＝8)以及联合给药组(Norharmane·HCl 3mg/kg+盐酸阿奇霉素2.7mg/kg，n＝3)。

治疗组以皮下注射的方式注射不同剂量的药物，模型对照组皮下注射等体积生理盐水，于接种菌液24h后开始给药，每12h给药一次，持续一周。期间观察小鼠摄食、活动、体毛、呼吸等变化，记录小鼠死亡情况。

2.2Norharmane联合阿奇霉素对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠肺泡结构、肺部细菌负荷和肺部炎症因子水平的影响

(1)菌液制备

-80℃下保存的铜绿假单胞菌GDMCC No：61027冻存液室温下解冻后，划线接种到LB琼脂培养基上，37℃培养24h，取发育良好的单一菌落再次接种，37℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取单菌落，接种到LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。用无菌生理盐水调节菌液浓度至3.0×10⁹CFU mL^-1，备用。

(2)诱导免疫抑制

所有小鼠适应性饲养一周后，腹腔注射环磷酰胺诱导免疫抑制，前4天给予150mg/kg/天，第5天给予100mg/kg/天。

(3)肺炎模型建立

免疫抑制诱导完成后次日开始进行造模，采用鼻内接种的方式感染小鼠：小鼠直立，吸取20μl菌液滴于小鼠一侧鼻孔，5-10min后再吸取20μl滴于另一侧鼻孔，观察模型诱导后小鼠的一般状态，如呼吸急促、毛发竖立、颤抖等，确定模型构建成功。

(4)分组及给药

将32只模型小鼠随机分为4组，每组8只，雌雄各半，分别为模型对照组、Norharmane·HCl 12mg/kg组、盐酸阿奇霉素22mg/kg组、以及联合给药组(Norharmane·HCl 3mg/kg+盐酸阿奇霉素2.7mg/kg)。

治疗组以皮下注射的方式注射不同剂量的药物，模型对照组皮下注射等体积生理盐水，于接种菌液2h后给药。

(5)扫描电镜

给药完成后24h处死小鼠，无菌采集肺组织。剪取一小块肺部组织，用生理盐水清洗后。肺组织在2.5％戊二醛中4℃过夜固定，然后倒掉戊二醛，用生理盐水清洗2～3次，除去残留戊二醛；洗净组织后，室温下用50％、70％、90％、100％的乙醇依次梯度脱水，各浓度脱水时间均为15min；脱水后，倒出乙醇，再加入叔丁醇，放置于-20℃的冰箱内，预冻后用冷冻真空干燥机充分干燥，然后用扫描电子显微镜观察并拍照。另取肺组织检测肺部细菌负荷和炎症因子水平。

(6)菌落计数

其余肺组织称重，以5ml无菌PBS作匀浆介质充分匀浆，匀浆完成后梯度稀释，吸取100μl稀释匀浆液，均匀涂布于LB琼脂培养基上，于37℃过夜培养，然后肉眼进行菌落计数。

3.结果

3.1Norharmane联合阿奇霉素对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠生存率的影响

结果见图1，与模型对照组相比，Norharmane·HCl以12mg/kg的剂量给药时能够提高铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠的存活率，并且治疗效果优于盐酸阿奇霉素；此外，联合给药时的药效优于单独使用Norharmane·HCl或盐酸阿奇霉素，并且剂量与单独用药时相比大大降低。这表明Norharmane能在致死性铜绿假单胞菌肺炎中保护小鼠，并且与阿奇霉素具有协同增效作用。

3.2Norharmane联合阿奇霉素对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠肺泡结构、肺部细菌负荷和炎症因子水平的影响

对小鼠肺泡结构的影响见图2，生理盐水组小鼠肺泡壁明显增厚、肺泡结构受到破坏，但在Norharmane·HCl以及联合给药治疗后，这些现象得到了改善。

对小鼠肺部细菌负荷的影响见图3，12mg/kg的Norharmane·HCl处理后，小鼠肺部细菌负荷较生理盐水组显著降低，而阿奇霉素则无明显降低效果。二者联合应用时的药效与12mg/kg的Norharmane·HCl相当，但药物的使用剂量降低超过一倍，联合给药组的药效也显著优于阿奇霉素。表明Norharmane对铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠具有良好的保护作用，并且与阿奇霉素存在协同增效作用，能够减少药物用量。

对小鼠肺匀浆液中炎症因子水平的影响见图4，12mg/kg的CJW1·HCl处理以及联合给药组均显著降低了小鼠肺匀浆中IL-6和IL-8的水平，而22mg/kg的盐酸阿奇霉素对IL-8水平则没有显著降低效果；并且联合给药组的降低效果与单独使用CJW1·HCl或盐酸阿奇霉素相当，而剂量却大大降低。

由以上结果可知，Norharmane在铜绿假单胞菌肺炎模型小鼠体内具有一定抗菌效果，并且与阿奇霉素联用时对多种细菌具有明显的协调增效作用，从而大大降低药物的使用剂量。

上述内容虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种改变、修饰、替代、简化、应用均应为等效的置换条件，都包括在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种去甲哈尔满在制备抗菌剂中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂为去甲哈尔满与阿奇霉素的混合。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述去甲哈尔满以盐酸盐形式作用，所述阿奇霉素以盐酸阿奇霉素形式作用，所述去甲哈尔满盐酸盐与盐酸阿奇霉素以质量比3:1-4混合。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂为耐药铜绿假单胞菌肺炎抑菌剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述耐药铜绿假单胞菌为耐药铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)GDMCC No：61027。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗菌剂为治疗肺囊性纤维化药物。

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