CN116267095A - 一种毛慈菇专用伴生菌培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及种植技术领域，具体为一种毛慈菇专用伴生菌培养方法，包括以下步骤:1、营造培养环境；2、搅拌播种；3、制备母种；4、液体种子制备；5、菌种直播。本发明提高毛慈菇专用伴生菌的培养效率，提高栽种成活率。
Description
技术领域
本发明涉及种植技术领域，具体为一种毛慈菇专用伴生菌培养方法。
背景技术
毛慈菇为兰科植物杜娟兰，独蒜兰或云南独蒜兰的干燥假鳞茎。前者习称“毛慈菇”，分布范围与天麻类似；后二者习称“冰球子”，主产于云贵川等高海拔山地。夏，秋二季采挖除去地上部分及泥沙，分开大小，置沸水锅中蒸煮及透心，干燥。切片或捣碎用。杜鹃兰本品具有“清热解毒、消痈散结”的作用，别名茅慈菇，为兰科植物；冰球子中文学名毛慈菇，为兰科。
毛慈菇做为兰科植物，虽然每一颗蒴果中都含有成千上万颗种子，但是种子天生缺乏胚乳等营养，种皮还很厚实(图1)，自然萌发率很低，且萌发时需要相对应的伴生真菌共生，才能顺利萌发。因此，杜鹃兰等兰科植物现在繁殖的主要技术为块茎分株繁殖和植物组织培养繁殖。块茎分株繁殖的生长周期长，繁殖慢；植物组织培养繁殖，也叫植物克隆技术，其投资大，技术强，要求严格，并不太适合广大农户的发展。分离鉴定并筛选出毛慈菇专用的伴生菌培养方法，能很好地解决上述问题，且成本低，适合药农操作。
发明内容
本发明的目的是提供一种毛慈菇专用伴生菌培养方法。
本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种毛慈菇专用伴生菌培养方法，包括以下步骤:1、营造培养环境；2、搅拌播种；3、制备母种；4、液体种子制备；5、菌种直播。
所述步骤1具体为整理适合的土地及菌种培养环境。
所述步骤2具体为播种前萌发菌的处理，首先将萌发菌取出放盆中，先用手将萌发菌撕成碎片，或用刀切碎，拌种时，将毛慈菇种子从蒴果中抖出，种子轻轻地均匀地散在菌种表面，边撒边抖拌。
所述步骤3具体为首先制备母种培养基，再通过母种培养基进行母种的培养。
通过上述方法的到的毛慈姑萌发菌分子鉴定相关说明
(1)用CTAB法，分别抽提三株毛慈菇萌发菌菌种的基因组DNA；
(2)用ITS-PCR的方法去检测三株毛慈菇萌发菌菌种。
ITS-PCR反应引物：
正向引物ITSl-F：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，
反向引物ITS4-R：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；
PCR反应体系：10×Buffer(Mg2+free)4.0μL；Mg2+2.0μL；dNTP1.0μL；ITSl-F 1.0μL；ITS4-R 1.0μL；模板DNA(50ng/μL)1.0μL；反应总体积为40μL；
第一次PCR条件：
预变性：95℃，5min；
变性：95℃，1min；
复性：55℃，1min；
延伸：72℃，1min；
循环数：×32；
延伸：72℃，10min；
保温：12℃，10min；
取5ulPCR反应后的产物跑1.0％的琼脂糖凝胶，得到对应菌株的ITS单一条带(图2)后，再将剩余的PCR反应产物，送到武汉华煜基因公司进行双向测序，对公司返还的测序结果进行质量处理和拼接，将拼接后的结果与NCBI(美国国家生物信息中心)数据库中的相关序列信息进行Blast比对。
(3)NCBI-Blast比对结果展示：
其中，MB1：晶粒小鬼伞(Coprinellus micaceus)或墨汁鬼伞(Coprinopsisatramentaria)，MB1比对结果见图3，其扩增产物的核苷酸序列如下：
5’-CTTCCGTAAGGGTGACCTGCGGAAGGATCATTAACGAATAACTATGGTGTCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCATTGTGCACGCCCGCCATTTTTATCTATCCACCTGTGCACCGACTGTAGGTCTGGATGACTCTCGTGCTCTCTGAGTGCGGATGCGAGGATTGCCCTTCAACTCGGAGGTGTCTCTCCTCGAATTTCCAGGCTCTACGTCTTTTTACACACCCCAAAAGCATGATATAGAATGTAGTCAATGGGCTTGATCGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCAKTAAATTCTCAACCTCACCCGTTTTCTGAACGGTTCTYCGAGGCTTGGATGTGGGGGTTTGTGCAGGCTGCCTCAGCGCGGTCYGCTCCCCTGAAATGCATTAGCGAGTTCGTACTGAGCTCCGTCTATTGGTGTGATAATTATCTACGCCGTGGACAGGGTTTAGACTCGCTTCTAACCGTCCGCAAGGACAATACCTTTGACAATTtGACCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCATAAAAGCCGGAAGGAA-3’
上述扩增片段的长度为708bp。
其中，MC1：白小鬼伞(Coprinellus disseminatus)，MB1比对结果见图4，其扩增产物的核苷酸序列如下：
5’-AGGATAATTATCGAATAAGTATGGTGTCTTGGTTGTCGCTGGCTCCTCGGAGCATCGTGCWCGCCCGCCATTTTYATCTATCCACCTGYGCACCGAATGTAGGTSTGGATGACTCTCGCCCTCGGGCGGATGCGAGGTTTGCGTTTGCGTGCAAGCGCTCTCCTCSAATTTCCAGGCTCTACKTCTCTTTACACACCCCAAACGTATGATGCARAATGTAGTCAATGGGCCTTTAMAAGCCTATAAAACACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAAATTCTCAACCTCACCGGTTTTCTGAACCGTTCTTCGAGGCTTGGATGTGGGGGTTTGTGCAGGTCGCCTCAGCGCGGTCTGCTCCCCTGAAATGCATTAGCGAGATTCATTCTGGACCTCCGTCTATCGGTGTGATAATTATCTACGTCGTTGACTTGGTTCGGACTCGCTTCTAACCGTCCGCGAGGACAACATACTTGACAATTGACCTCAAATCAGGTAGA-3’
上述扩增片段的长度为638bp。
其中，XGS：辐毛鬼伞(Coprinopsis atramentaria)，XGS比对结果见图5，其扩增产物的核苷酸序列如下：
5’-GCGTCTTGGTTGTAGCTGGCTCCTCGGAGCAATGTGCACGCCCGCCATTTTTATCTTTCCACCTGTGCACCGACTGTAGGTCTGGATACCTCTCGCCCTTCACGGGGCGGAGCGAGGGTTGCCCGTCMCMCGGCTYCCCTYGAATTTYCMGGCTYTAMGTYTTTTTACMCMCCCCMATAGTAWGATGCAGAAWGTAGTCAAWGGGSTTYTCAGCCTATAAAACMMTATACAAMTTTYAGCAAMGGATYTYTTGGSTYTYGCATYGATGAAGAAMGCAGSGAAATGSGATAAGTAAWGTGAAWTGCAGAAWTCAGTGAATYATYGAATYTTTGAAMGCMCCYTGCGSTCCTTGGTATTYCGAGGAGCMWGCCTGKTTGAGKGTCMTTAAATTYTYAACCTCMCCMGTTTTYTGAAMTGTTYTTYGAGGSTTGGAWGKGGGGGKTTGKGCMGGSTGCCTCMCGGCGGTYCGSTYCCCTGAAAWGCMWTAGSGAGTTCATAMTGAAMTTCCGTYTAWTGGKGKGATAATTATYTACGCCGTGGACGAGGATYAGACTYGSTTYTAACCGTYCGSGAGGACAAATACCTTGACAATTGACCTCAAATCAGGTAGACACCCGCTAAACTTAACCAAATCATAAACCGGAAGAAAA-3’
上述扩增片段的长度为654bp。
综上所述，本发明的有益技术效果为：
利用毛慈菇专用伴生菌播种的方法，显著提高了毛慈菇种子的自然萌发和播种的效率，提高了毛慈菇的栽种成活率(图6)。
附图说明
图1是本发明所用的毛慈菇种子的体视显微照片。
图2是本发明所用的三个菌株凝胶电泳结果图(1，2，3：MB1，MC1，XGS)。
图3是本发明MB1菌株的Blast比对结果图。
图4是本发明MC1菌株的Blast比对结果图。
图5是本发明XGS菌株的Blast比对结果图。
图6是本发明毛慈菇萌发菌大田萌发效果图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明作进一步详细说明。
本发明公开的一种毛慈菇专用伴生菌培养方法，包括以下步骤:1、营造培养环境；2、搅拌播种；3、制备母种；4、液体种子制备；5、菌种直播。
所述步骤1具体为整理适合的土地及菌种培养环境。
所述步骤2具体为播种前的处理，将萌发菌取出放盆中，先用手将萌发菌撕成碎片或用刀切碎，拌种时，将毛慈菇种子从蒴果中抖出，种子轻轻地均匀地散在菌种表面，边撒边抖拌。
所述步骤3具体为首先制备母种培养基，再通过母种培养基进行母种的培养。
提高毛慈菇专用伴生菌的培养效率，提高栽种成活率。
本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的菌种、结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种毛慈菇专用伴生菌培养方法，其特征在于，包括以下步骤:1、营造培养环境；2、搅拌播种；3、制备母种；4、液体种子制备；5、菌种直播。
2.根据权利要求1所述的一种毛慈菇专用伴生菌培养方法，其特征在于：所述步骤1具体为整理适合的土地及菌种培养环境。
3.根据权利要求1所述的一种毛慈菇专用伴生菌培养方法，其特征在于：所述步骤2具体为播种前将萌发菌取出放盆中先用手将萌发菌撕成碎片或用刀切碎，拌种时，将毛慈菇种子从蒴果中抖出，种子轻轻地均匀地散在菌种表面，边撒边抖拌。
4.根据权利要求1所述的一种毛慈菇专用伴生菌培养方法，其特征在于：所述步骤3具体为首先制备母种培养基，再通过母种培养基进行母种的培养。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117701397A (zh) * | 2023-03-16 | 2024-03-15 | 中南民族大学 | 一种促进杜鹃兰种子萌发的小鬼伞属庭院小鬼伞菌及其应用 |
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2023
- 2023-02-17 CN CN202310132651.5A patent/CN116267095A/zh active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN117701397A (zh) * | 2023-03-16 | 2024-03-15 | 中南民族大学 | 一种促进杜鹃兰种子萌发的小鬼伞属庭院小鬼伞菌及其应用 |
| CN117701397B (zh) * | 2023-03-16 | 2024-05-31 | 中南民族大学 | 一种促进杜鹃兰种子萌发的小鬼伞属庭院小鬼伞菌及其应用 |
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