CN116254222A - 一种机械分离毛囊干细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种机械分离毛囊干细胞的方法。本发明利用含有白蛋白的组织保护液对毛囊组织进行清洗浸泡，减少机械损伤对细胞带来的伤害，更好的维持细胞活性。本发明通过机械分离法制备的毛囊干细胞数量较多，细胞活性高，有效避免了酶、培养基等外源物质对细胞造成细胞表面标志物和分化潜能的改变，保持了干细胞在组织微环境中的原始生态位和功能。本发明通过机械分离法分离组织细胞，被认定为体外最低限度的操作，不被定义为药品，在临床使用条件上没有生物制剂药品的诸多限制，操作简便，无需进行体外扩增培养，高效省时，具有很好的临床应用前景。

Description

一种机械分离毛囊干细胞的方法

技术领域

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种机械分离毛囊干细胞的方法。

背景技术

雄性激素脱发是当今人们常遇的疾病，给人们在生理和心理上带来很大困扰。目前药物治疗雄性激素脱发常用的合法治疗手段包括使用米诺地尔和非那雄胺治疗，虽然有一定的治疗效果，但需要持续、无限期的使用以保持头发密度，此外还会造成多毛症、性功能障碍等问题。而利用干细胞治疗雄性激素脱发也是作用非常显著的手段，其中最适于治疗雄性激素脱发的是毛囊干细胞。头发毛囊中含有大量干细胞，包括毛囊间充质干细胞和毛囊上皮干细胞，可以分化成为毛囊间表皮、毛囊结构和皮脂腺，重建成新的毛囊，促进头发增长。因毛囊干细胞来源于毛囊，用于治疗脱发具有同源性且其为非常容易获得的自体干细胞来源，数量丰富，对患者无创，逐渐引起国内外研究者的关注。

目前分离制备人类毛囊干细胞主要是通过酶解消化(胶原酶或胰蛋白酶)分离并进行体外增殖培养的方法获取，虽能获取较多数量干细胞，但培养周期较长。此外，在体外对组织和细胞进行酶解和增殖培养等操作，在欧洲和美国等国家和区域不被认为是最低限度的操作。此方法获取的细胞被认定为“生物工艺工程”产品，被定义为一种药品，在临床应用的程序较为复杂，受到很大限制。因此，研发出一种分离毛囊干细胞的方法，以实现在体外对组织进行最低限度的操作，避免引起细胞刺激、增殖，避免改变细胞表型和分化潜能，同时保持干细胞在组织环境中的原始功能，成为了本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明是为了克服现有技术中的分离毛囊干细胞的方法难以适用于临床应用，分离操作复杂、耗时长、效率低且容易引起细胞刺激、增殖，影响细胞活性和生理功能的缺陷，提供了一种机械分离毛囊干细胞的方法。

为实现上述发明目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种机械分离毛囊干细胞的方法，包括以下步骤：

(S.1)从皮肤样本取出毛囊组织，加入组织保护液进行清洗；

(S.2)取步骤(S.1)中清洗后的毛囊组织浸泡在组织保护液内并进行剪切，除去清洗后的毛囊组织的皮下脂肪及杂物，得到毛囊组织块；

(S.3)取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块进行机械分离，加入组织保护液混匀；然后离心，去除上清，得到毛囊干细胞沉淀；加入复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，收集得到毛囊干细胞悬液；

所述步骤(S.2)以及步骤(S.3)中的组织保护液中包含有白蛋白。

常见的对采集的毛囊组织进行清洗大多数使用生理盐水或75％乙醇溶液，虽起到了消毒杀菌的作用，但盐水或75％乙醇溶液容易对毛囊造成损伤，致使毛囊坏死。本发明人发现，利用含有白蛋白的组织保护液对毛囊组织进行清洗浸泡，能有效降低其对毛囊的损害。白蛋白(albumin，又称清蛋白)是人体血浆中最主要的蛋白质，由肝实质细胞合成，具有抗氧化功能，用于维持机体营养与渗透压。白蛋白可在体外调节细胞的生理环境，减少机械损伤对细胞带来的伤害，更好的维持细胞活性。

人类毛囊组织包含毛囊隆起部位和真皮乳头等结构，在毛囊隆起部位中包含毛囊干细胞，真皮乳头包含真皮、上皮及基质细胞。毛囊组织在切割或研磨等机械剪切力的作用下被分解、破坏，使得包含在其中的毛囊干细胞、基质细胞等会释放出来，通过离心或者其他物理方法可收集得到毛囊干细胞。相较于酶解分离法，操作更为简便，无需进行体外扩增培养，处理周期更短。此外，通过研磨使毛囊组织破碎，无胰蛋白酶、胶原酶等外源物质的介入，有效避免体外培养过程中细胞表面标志物和分化潜能的改变，保持了干细胞在组织微环境中的原始生态位和功能。

另外，传统的大多数利用酶解分离细胞然后进行体外扩增培养，这种酶解分离法被认定为一种药品，在临床应用上限制较多。而通过物理研磨方式分离组织细胞，被认定为体外最低限度的操作，不被定义为药品，在临床使用条件上没有生物制剂药品的诸多限制，可以制备后立即使用，具有很好的临床应用前景。相较于其他物理分离毛囊干细胞的方式，例如在显微镜下解剖毛囊获取细胞，研磨的方式操作更简单。与切割组织块进行体外培养或直接离心收集的方式比较，研磨对组织块的破碎更完全，获取细胞的效率更高。

市场上常见的组织研磨设备多用于组织细胞破碎，以便后续的核酸、蛋白提取等用途，难以实现对组织细胞的提取分离。而本发明人采用的专用研磨器械(器械内包含金属研磨片及细胞过滤膜片等关键结构)，在研磨毛囊组织的同时可以通过金属过滤膜片进行过滤收集细胞。整个研磨及细胞收集过程均在研磨器械内，操作简便，中间无转移细胞、清洗等过程，有效防止污染，安全性更高。同时可高效提取数量较多且活性高的组织细胞。此外，该专用研磨器械能保持均衡的转速和机械研磨强度，相比于人工研磨操作法更加稳定，有效避免过大的机械作用力对组织细胞的损伤。

作为优选，所述组织保护液中还包括复方电解质液。

作为优选，所述白蛋白的浓度为0.1％～5％。

作为优选，所述步骤(S.2)中剪切的具体步骤如下：

在4～18℃无菌环境下，取步骤(S.1)中清洗后的毛囊组织浸泡在组织保护液内并剪切成条状，除去清洗后的毛囊组织的皮下脂肪及杂物，得到毛囊组织块。

作为进一步优选，所述步骤(S.2)中剪切的具体步骤如下：

在4℃无菌环境下，取步骤(S.1)中清洗后的毛囊组织浸泡在组织保护液内并剪切成2mm×2mm的条状，除去清洗后的毛囊组织的皮下脂肪及杂物，得到毛囊组织块。

体外低温(即4～18℃)环境可使细胞的转录活性处于休眠状态，减少因解离环境引入的基因表达模式改变的问题。同时，低温环境还能够减少由于机械解离引发的局部高温对细胞带来的损伤，使细胞保持更高的活性。此外，分解后的组织块更方便后续的物理研磨操作，有利于提高分离效率。

作为优选，所述步骤(S.3)中机械分离的步骤如下：

取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块进行研磨分解、过滤，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。

作为优选，所述步骤(S.3)中机械分离的具体步骤如下：

在4～18℃无菌环境下，取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块置于研磨器械内以60～150r/min进行匀速研磨分解0.5～3min并通过研磨器械内的过滤膜片进行分离，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。

作为进一步优选，所述步骤(S.3)中机械分离的具体步骤如下：

在4℃无菌环境下，取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块置于研磨器械内以80r/min进行匀速研磨分解1min并通过研磨器械内的过滤膜片进行分离，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。

将条状毛囊组织块置于研磨器械内，使研磨片保持匀速旋转(保持恒定的研磨机械强度)。在机械研磨的作用下，头皮毛囊组织被分解为更小的单位。毛囊凸起部位处的干细胞、祖细胞及真皮乳头处的毛囊基质细胞和上皮细胞得到释放，释放出的单细胞单位通过研磨器械的过滤膜片(过滤膜片孔径80～150μm)被收集存储。

作为优选，所述步骤(S.3)中得到毛囊干细胞悬液的具体步骤如下：

取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块进行研磨分解、过滤，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物；加入组织保护液混合均匀，收集得到细胞悬液；然后离心，去除上清，得到毛囊干细胞沉淀；加入复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，收集得到毛囊干细胞悬液。

作为优选，所述步骤(S.3)中机械分离的步骤如下：

取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块进行离心分解，收集得到含毛囊干细胞的组织块混合物。

作为优选，所述步骤(S.3)中得到毛囊干细胞悬液的具体步骤如下：

取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块进行离心分解，收集得到含毛囊干细胞的组织块混合物；加入组织保护液混合均匀，收集得到细胞悬液与组织块的混合物；然后离心，去除上清，得到毛囊干细胞沉淀；加入复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，经细胞滤网过滤，收集滤液得到毛囊干细胞悬液。

作为进一步优选，所述步骤(S.3)中得到毛囊干细胞悬液的具体步骤如下：

取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块进行离心分解，收集得到含毛囊干细胞的组织块混合物；加入组织保护液(每20mL组织保护液中约50个毛囊组织块)混合均匀，收集得到细胞悬液与组织块的混合物；然后以3000r/min转速离心3min，去除上清，得到毛囊干细胞沉淀；加入复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，经80～150μm孔径的细胞滤网过滤，重复离心一次，加入复方电解质液重悬细胞沉淀，过滤，收集滤液得到毛囊干细胞悬液。

作为优选，所述步骤(S.3)中组织保护液的添加量为1～50mL，复方电解质液的添加量为1～5mL。

因此，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用含有白蛋白的组织保护液对毛囊组织进行清洗浸泡，减少机械损伤对细胞带来的伤害，更好的维持细胞活性；

(2)本发明通过机械分离法制备的毛囊干细胞数量较多，细胞活性高，有效避免了酶、培养基等外源物质对细胞造成细胞表面标志物和分化潜能的改变，保持了干细胞在组织微环境中的原始生态位和功能；

(3)本发明通过机械分离法分离组织细胞，被认定为体外最低限度的操作，不被定义为药品，在临床使用条件上没有生物制剂药品的诸多限制，操作简便，无需进行体外扩增培养，高效省时，具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1为利用机械分离毛囊干细胞的方法制备毛囊干细胞的工艺流程图。

图2为毛囊干细胞提取过程图。

具体实施方式

下面结合说明书附图以及具体实施例对本发明做进一步描述。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种机械分离毛囊干细胞的方法，包括以下步骤：

(S.1)从头皮取出人类头皮毛囊组织，在4℃环境下使用组织保护液(其中，组织保护液由复方电解质液和白蛋白配制而成，白蛋白浓度为1％)进行清洗；

(S.2)在4℃环境下，无菌操作，取步骤(S.1)中清洗后的毛囊组织浸泡在组织保护液内并剪切成2mm×2mm的条状，除去清洗后的毛囊组织的皮下脂肪及杂物，得到毛囊组织块；

(S.3)在4℃环境下，无菌操作，取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块置于专用研磨器械(其中，设备名称为

型号:79350S，35微米或79450S，50微米)内以80r/min的研磨强度进行匀速研磨分解1min并通过研磨器械内的过滤膜片(过滤膜片孔径80μm)进行分离，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。加入2mL组织保护液混合均匀，收集得到细胞悬液。然后离心，去除上清，得到毛囊干细胞沉淀。加入1.2mL复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，收集得到毛囊干细胞悬液。

实施例2

一种机械分离毛囊干细胞的方法，包括以下步骤：

(S.1)从头皮取出人类头皮毛囊组织，在4℃环境下使用组织保护液(其中，组织保护液由复方电解质液和白蛋白配制而成，白蛋白浓度为1％)进行清洗；

(S.2)在4℃环境下，无菌操作，取步骤(S.1)中清洗后的毛囊组织浸泡在组织保护液内并剪切成2mm×2mm的条状，除去清洗后的毛囊组织的皮下脂肪及杂物，得到毛囊组织块；

(S.3)在4℃环境下，无菌操作，取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块进行离心分解，收集得到含毛囊干细胞的组织块混合物。加入20mL组织保护液(每20mL组织保护液中约50个毛囊组织块)混合均匀，收集得到细胞悬液与组织块的混合物。然后以3000r/min转速离心3min，离心完成后去除上清，得到毛囊干细胞沉淀。加入3.3mL复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，经100μm孔径的细胞滤网过滤，收集滤液。重复离心一次，加入复方电解质液重悬细胞沉淀，过滤，合并两次滤液得到毛囊干细胞悬液。

实施例3

一种机械分离毛囊干细胞的方法，包括以下步骤：

(S.1)从头皮取出人类头皮毛囊组织，在4℃环境下使用组织保护液(其中，组织保护液由复方电解质液和白蛋白配制而成，白蛋白浓度为0.1％)进行清洗；

(S.2)在15℃环境下，无菌操作，取步骤(S.1)中清洗后的毛囊组织浸泡在组织保护液内并剪切成2mm×2mm的条状，除去清洗后的毛囊组织的皮下脂肪及杂物，得到毛囊组织块；(S.3)在15℃环境下，无菌操作，取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块置于研磨器械内以60r/min的研磨强度进行匀速研磨分解3min并通过研磨器械内的过滤膜片(过滤膜片孔径120μm)进行分离，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。加入1mL组织保护液混合均匀，收集得到细胞悬液。然后离心，去除上清，得到毛囊干细胞沉淀。加入1mL复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，收集得到毛囊干细胞悬液。

实施例4

一种机械分离毛囊干细胞的方法，包括以下步骤：

(S.1)从头皮取出人类头皮毛囊组织，在4℃环境下使用组织保护液(其中，组织保护液由复方电解质液和白蛋白配制而成，白蛋白浓度为5％)进行清洗；

(S.2)在18℃环境下，无菌操作，取步骤(S.1)中清洗后的毛囊组织浸泡在组织保护液内并剪切成2mm×2mm的条状，除去清洗后的毛囊组织的皮下脂肪及杂物，得到毛囊组织块；(S.3)在18℃环境下，无菌操作，取步骤(S.2)中得到的毛囊组织块置于研磨器械内以150r/min的研磨强度进行匀速研磨分解0.5min并通过研磨器械内的过滤膜片(过滤膜片孔径150μm)进行分离，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。加入50mL组织保护液混合均匀，收集得到细胞悬液。然后离心，去除上清，得到毛囊干细胞沉淀。加入5mL复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，收集得到毛囊干细胞悬液。

对比例1

本实施例中的一种机械分离毛囊干细胞的方法，与实施例1的区别在于：使用的组织保护液由复方电解质液配制而成，其中不含白蛋白。其他都与实施例1中相同。

对比例2

本实施例中的一种机械分离毛囊干细胞的方法，与实施例1的区别在于：其中，组织保护液由复方电解质液和白蛋白配制而成，白蛋白浓度为0.05％。其他都与实施例1中相同。

对比例3

本实施例中的一种机械分离毛囊干细胞的方法，与实施例1的区别在于：其中，组织保护液由复方电解质液和白蛋白配制而成，白蛋白浓度为6％。其他都与实施例1中相同。

对比例4

本实施例中的一种机械分离毛囊干细胞的方法，与实施例1的区别在于：在步骤(S.3)中取上述步骤(S.2)中得到的毛囊组织块不进行研磨分解处理，直接通过细胞滤网(细胞滤网孔径80μm)进行过滤分离，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。其他都与实施例1中相同。

对比例5

本实施例中的一种机械分离毛囊干细胞的方法，与实施例1的区别在于：在步骤(S.3)中以Dounce玻璃组织研磨器(Dounce Tissue Grinder，15mL容量，杵长210mm，其采用手动操作方式，研磨强度和速率不固定)进行研磨分解1min并通过细胞滤网(细胞滤网孔径80μm)进行过滤分离，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。其他都与实施例1中相同。

对比例6

本实施例中的一种机械分离毛囊干细胞的方法，与实施例1的区别在于：在步骤(S.3)中以40r/min的研磨强度进行匀速研磨分解1min并通过研磨器械内的过滤膜片(过滤膜片孔径80μm)进行分离，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。其他都与实施例1中相同。

对比例7

本实施例中的一种机械分离毛囊干细胞的方法，与实施例1的区别在于：在步骤(S.3)中以200r/min的研磨强度进行匀速研磨分解1min并通过研磨器械内的过滤膜片(过滤膜片孔径80μm)进行分离，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。其他都与实施例1中相同。

按照实施例1～2以及对比例1～7中的机械分离毛囊干细胞的方法制备得到毛囊干细胞悬液并用1mL注射器收集备用。然后用细胞计数板计数并进行免疫化学检测，结果如下表1所示。

表1

从表1中数据分析可知：在合适的机械研磨强度(60～150r/min)和研磨时间(0.5～3min)作用下，能得到数量更多的混合细胞群和毛囊干细胞。组织保护液中含有的白蛋白浓度越高，对细胞活性的保护作用越好，细胞产率更高。但1％浓度与更高浓度影响下的细胞产率无显著相差，考虑成本，选择1％浓度似乎更为合适。

以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种机械分离毛囊干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（S.1）从皮肤样本取出毛囊组织，加入组织保护液进行清洗；

（S.2）取步骤（S.1）中清洗后的毛囊组织浸泡在组织保护液内并进行剪切，除去清洗后的毛囊组织的皮下脂肪及杂物，得到毛囊组织块；

（S.3）取步骤（S.2）中得到的毛囊组织块进行机械分离，加入组织保护液混匀；然后离心，去除上清，得到毛囊干细胞沉淀；加入复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，收集得到毛囊干细胞悬液；

所述步骤（S.2）以及步骤（S.3）中的组织保护液中包含有白蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种机械分离毛囊干细胞的方法，其特征在于，所述组织保护液中还包括复方电解质液。

3.根据权利要求2所述的一种机械分离毛囊干细胞的方法，其特征在于，所述白蛋白的浓度为0.1%~5%。

4.根据权利要求1所述的一种机械分离毛囊干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（S.2）中剪切的具体步骤如下：

在4~18℃无菌环境下，取步骤（S.1）中清洗后的毛囊组织浸泡在组织保护液内并剪切成条状，除去清洗后的毛囊组织的皮下脂肪及杂物，得到毛囊组织块。

5.根据权利要求1所述的一种机械分离毛囊干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（S.3）中机械分离的步骤如下：

取步骤（S.2）中得到的毛囊组织块进行研磨分解、过滤，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。

6.根据权利要求5所述的一种机械分离毛囊干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（S.3）中机械分离的具体步骤如下：

在4~18℃无菌环境下，取步骤（S.2）中得到的毛囊组织块置于研磨器械内以60~150r/min进行匀速研磨分解0.5~3min并通过研磨器械内的过滤膜片进行分离，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物。

7.根据权利要求5或6所述的一种机械分离毛囊干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（S.3）中得到毛囊干细胞悬液的具体步骤如下：

取步骤（S.2）中得到的毛囊组织块进行研磨分解、过滤，收集得到含毛囊干细胞的细胞混合物；加入组织保护液混合均匀，收集得到细胞悬液；然后离心，去除上清，得到毛囊干细胞沉淀；加入复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，收集得到毛囊干细胞悬液。

8.根据权利要求1所述的一种机械分离毛囊干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（S.3）中机械分离的步骤如下：

取步骤（S.2）中得到的毛囊组织块进行离心分解，收集得到含毛囊干细胞的组织块混合物。

9.根据权利要求8所述的一种机械分离毛囊干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（S.3）中得到毛囊干细胞悬液的具体步骤如下：

取步骤（S.2）中得到的毛囊组织块进行离心分解，收集得到含毛囊干细胞的组织块混合物；加入组织保护液混合均匀，收集得到细胞悬液与组织块的混合物；然后离心，去除上清，得到毛囊干细胞沉淀；加入复方电解质液重悬毛囊干细胞沉淀，经细胞滤网过滤，收集滤液得到毛囊干细胞悬液。

10.根据权利要求1所述的一种机械分离毛囊干细胞的方法，其特征在于，所述步骤（S.3）中组织保护液的添加量为1~50mL，复方电解质液的添加量为1~5mL。

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