CN116253760A - 一种磷酸富集型化学交联剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种磷酸富集型化学交联剂及其制备方法和应用,属于有机合成技术领域。本交联剂具有以下功能特点:1)具有磷酸富集单元,实现交联肽高通量、高灵敏度鉴定;2)具有琥珀酰亚胺酯结构单元,反应条件温和高效;3)具有光反应活性基团,实现蛋白质的动态结构及相互作用信息的快速捕获;4)分子中含有磷酸基及磺酸钠单元,一方面提高了交联剂的亲水性,另一方面抑制交联剂的透膜性;5)分子骨架结构引入聚乙二醇(PEG)链,改善交联剂的亲水性。本发明交联剂应用于细胞质膜蛋白质组学领域,为实现细胞质膜蛋白质复合体的规模化分析、细胞质膜蛋白质的三维空间结构解析、细胞质膜蛋白质相互作用解析提供重要的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及一种磷酸富集型化学交联剂及其制备方法和应用。本发明交联剂是一种三功能的化学交联剂,具有磷酸富集基团、琥珀酰亚胺酯磺酸钠基团、光反应活性基团。其中,光反应活性基团包括双吖丙啶、三氟甲基双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上。另外,分子骨架中引入PEG链,进一步增加分子的亲水特性及柔性;生理条件交联剂带有负电荷,使交联剂靶向细胞质膜,实现实现细胞质膜蛋白质复合体的规模化分析、细胞质膜蛋白质的三维空间结构解析、细胞质膜蛋白质相互作用解析。该发明属于有机合成技术领域。
背景技术
蛋白质是生物体内各项生命活动的主要承担者。细胞中蛋白质时时刻刻发生相互作用,形成更高维度动态的蛋白质复合物,并以精准有序的方式调节生命过程;同时其自身构象也在发生精细的变化。因此,研究蛋白质间相互作用、蛋白质复合物的三维空间构象对于了解蛋白质功能、解释和预测各种生命现象起着至关重要的作用(Chemical reviews,2021,DOI:10.1021/acs.chemrev.1c00223;Protein Science,2021,30:773-784.,Analytical chemistry,2019,91:6953-6961.)。
细胞质膜蛋白质在细胞的增殖分化、能量转换、信号转导及物质运输等方面发挥着重要的作用。目前,大多数药物治疗靶点定位在细胞质膜蛋白,因此研究细胞质膜蛋白质相互作用对于生命科学、临床医学、药物开发等领域具有极其重要的意义(Naturecommunications,2019,10:3131;Science,2018,362:829-834.)。
近几年,随着化学交联剂、生物样品蛋白质预处理方法以及交联肽的数据解析方法的不断发展,使得化学交联质谱技术(CXMS)越来越受到研究学者的关注,在研究蛋白质结构及其相互作用领域扮演着重要角色(Chemical reviews,2021,DOI:10.1021/acs.chemrev.1c00223;Protein Science,2021,30:773-784.)。相比传统技术如酵母双杂交、免疫共沉淀、核磁共振、X射线衍射等,化学交联质谱技术具有独特的优势,如适用于复杂的样品体系(亚细胞器、细胞、组织等)、能够捕获瞬时和弱的蛋白质相互作用、解析生理条件下原位动态的蛋白质相互作用等(Current opinion in Chemical Biology,2019,48:8-18;Methods,2018,144:53-63;Mass Spectrometry Reviews,2010,29:862-876;Analytical Chemistry,2016,88:7930-7937;Journal of Proteome Research,2017,1:722.)。
化学交联质谱技术通常采用双功能的化学交联剂(如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)共价结合到空间相邻的赖氨酸末端氨基。交联后的蛋白质样品酶解成肽段,进而采用经典的蛋白质组学由底而上的(bottom-up)策略,实现交联肽的鉴定以及蛋白质结构及相互作用的解析。针对复杂的生物样品,尤其细胞或组织样品,由于蛋白质种类多、丰度跨度大,以及交联反应效率有限,导致酶解后的样品成分复杂,其中交联肽含量极低(通常0.1%左右),因此交联肽的质谱鉴定极其困难。因此,为了提高交联肽的比例及质谱鉴定的灵敏度,同时降低常规肽段的背景干扰,人们开发多了各种各样的富集型交联剂。生物素-链霉亲和素系统是常见的富集方法(Analytical chemistry,2020,92:8292-8297.)。由于生物素基团产生较大反应位阻影响交联反应效率以及交联肽疏水性增强,不利于质谱鉴定,人们又开发了含有炔基(叠氮)的交联剂。其原理是炔基(叠氮)经点击化学反应间接引入生物素。富集后的交联肽经断裂(酸、光、还原等多种方式)释放生物素,进入质谱采集(PNAS,2021,118:32e2023360118;Analytical chemistry,2021,93:4166-4174.)。虽然这种富集方式已成功应用于细胞蛋白质结构及其相互作用的规模化分析,但仍存在操作步骤繁琐,样品回收率低等问题。
固相金属亲和色谱(IMAC)是利用磷酸基团与固相化的Fe3+、Ga2+及Cu2+等金属离子的亲和来富集磷酸化肽,具有特异性好、结合力强、易于洗脱释放的优点,在磷酸化蛋白质组具有广泛的应用。因此人们将磷酸基团键合在交联剂上,实现了更高效的交联肽富集方法(ACS Central science,2019,5:1514-1522;Chemical science,2019,10:6443-6447;WO2013082518-A1,2013;CN110702922-A,2020.)。
交联剂常见的功能基团包括琥珀酰亚胺酯(与氨基反应)、马来酰亚胺(与巯基反应)等。然而,细胞质膜蛋白,尤其跨膜区蛋白,含有较多的亮氨酸、异亮氨酸等疏水氨基酸,反应活性基团较少,常规的化学交联剂无法原位捕获跨膜区蛋白的动态空间构象或相互作用信息。而光反应活性基团如芳基叠氮、二苯甲酮、双吖丙啶具有光引发、反应速率快、反应位点丰富等优点(Chimia,2018,72:758-763;Journal of the American ChemicalSociety,2019,141:11759-11764;CN106021988-A,2016.),有望用于细胞质膜蛋白相互作用规模化分析中。
发明内容
基于上述化学交联剂的研究现状及设计原则,本发明设计并合成了一种磷酸富集型化学交联剂。本发明交联剂具有具有磷酸富集单元,通过固相金属亲和色谱(IMAC)富集方式提高交联肽在质谱中的信号强度,降低常规肽段背景干扰,实现交联肽高通量、高灵敏度鉴定;具有琥珀酰亚胺酯结构单元,生理条件下与蛋白质、多肽赖氨酸残基末端或N端氨基发生酰胺化反应,实现温和高效的共价交联反应;具有光反应活性基团,包括双吖丙啶、三氟甲基双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种,紫外光照即可发生瞬时自由基插入反应,实现蛋白质的动态结构及相互作用信息的快速捕获,同时反应位点包括20种天然氨基酸残基,实现更全面的蛋白质复合物结构及相互作用信息解析;分子中含有磷酸基及磺酸钠单元,一方面提高了交联剂的亲水性,另一方面交联剂在生理条件带有负电,抑制交联剂的透膜性,使交联剂靶向细胞质膜,获得细胞质膜蛋白质复合物的信息;分子骨架结构引入聚乙二醇(PEG)链,提高交联剂的亲水性及柔性,有利于捕获更多的相互作用蛋白信息。本发明交联剂应用于细胞质膜蛋白质组学领域,为实现细胞质膜蛋白质复合体的规模化分析、细胞质膜蛋白质的三维空间结构解析、细胞质膜蛋白质-蛋白质相互作用解析提供重要的技术支撑。
本发明提供的多功能交联剂,结构如下图所示:
其中,R为光反应活性基团,包括双吖丙啶、三氟甲基双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮中的一种或两种以上。
具体包含4种结构,如下图所示:
双吖丙啶为光反应活性基团的交联剂结构:
三氟甲基双吖丙啶为光反应活性基团的交联剂结构:
二苯甲酮为光反应活性基团的交联剂结构:
苯基叠氮为光反应活性基团的交联剂结构:
本发明提供了交联剂的制备方法,具体步骤如下:
第一步,4-(2-羧基乙基)庚二酸(以下简称癸三酸,化合物1)为起始原料,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(以下简称EDCI)为缩合剂,N-羟基琥珀酰亚胺(以下简称NHS)为羟基供体,二甲基亚砜(以下简称DMSO)为反应溶剂,发生酯化反应,制备癸三琥珀酰亚胺酯(化合物1);反应完成,不经分离纯化,直接进行酰胺化反应,以氨基-PEG3-羧酸为原料,加入有机碱三乙胺(以下简称TEA),制备三PEG3-三羧酸(化合物2)。
第二步,化合物2为反应原料,EDCI为缩合剂,磺酸钠NHS为羟基供体,DMSO为反应溶剂,发生酯化反应,制备三PEG3-三琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物3)。
第三步,化合物3及含光反应活性基团的胺为原料,摩尔比控制在1:(1.0-1.2),TEA为有机碱,DMSO为反应溶液,发生酰胺化反应,制备含光反应活性基团的三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物4);其中光反应活性基团包括双吖丙啶、三氟甲基双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上。
第四步,化合物4及氨丙基磷酸为原料,摩尔比控制在1:(1.0-1.2),TEA为有机碱,DMSO为反应溶液,发生酰胺化反应,制备含光反应活性基团的三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物5,目标交联剂);其中光反应活性基团包括双吖丙啶、三氟甲基双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上。
本发明交联剂应用于细胞质膜蛋白质组学领域,为实现细胞质膜蛋白质复合体的规模化分析、细胞质膜蛋白质的三维空间结构解析、细胞质膜蛋白质-蛋白质相互作用解析提供重要的技术支撑。
与现有化学交联剂相比,本发明交联剂具有如下优点:
1.具有磷酸富集单元,通过固相金属亲和色谱(IMAC)富集方式提高交联肽在质谱中的信号强度,降低常规肽段背景干扰,实现交联肽高通量、高灵敏度鉴定;
2.具有琥珀酰亚胺酯结构单元,生理条件下与蛋白质、多肽赖氨酸残基末端或N端氨基发生酰胺化反应,实现温和高效的共价交联反应;
3.具有光反应活性基团,包括双吖丙啶、三氟甲基双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种,紫外光照即可发生瞬时自由基插入反应,实现蛋白质的动态结构及相互作用信息的快速捕获,同时反应位点包括20种天然氨基酸残基,实现更全面的蛋白质复合物结构及相互作用信息解析;
4.分子中含有磷酸基及磺酸钠单元,一方面提高了交联剂的亲水性,另一方面交联剂在生理条件带有负电,抑制交联剂的透膜性,使交联剂靶向细胞质膜,获得细胞质膜蛋白质复合物的信息;
5.分子骨架结构引入聚乙二醇(PEG)链,提高交联剂的亲水性及柔韧性,有利于捕获更多的相互作用蛋白信息。
附图说明
图1为化学交联剂结构通式;
图2为化学交联剂的合成路线;
图3双吖丙啶为光反应活性基团的交联剂的具体结构式;
图4三氟甲基双吖丙啶为光反应活性基团的交联剂的具体结构式;
图5二苯甲酮为光反应活性基团的交联剂的具体结构式;
图6苯基叠氮为光反应活性基团的交联剂的具体结构式;
图7实施例4荧光共聚焦图;
图8实验流程图;
图9双吖丙啶为光反应活性基团的交联剂的肽段质谱采集图;
图10三氟甲基双吖丙啶为光反应活性基团的交联剂肽段质谱采集图;
图11二苯甲酮为光反应活性基团的交联剂的肽段质谱采集图;
图12苯基叠氮为光反应活性基团的交联剂的肽段质谱采集图。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例公开了一种双吖丙啶为光反应活性基团的交联剂的制备方法,包含四个反应步骤,制备方法如下所示:
第一步,三PEG3-三羧酸(化合物2)的制备。将癸三酸(1.16g,5mmol)、EDCI(3.84g,20mmol)、NHS(2.3g,20mmol)溶于25ml DMSO中,25℃反应24h。反应完毕,反应液加入TEA(5.06g,50mmol),称取氨基-PEG3-羧基(4.42g,20mmol)溶于5ml DMSO中,并缓慢滴加至上述反应液,25℃反应10min。反应完毕,反应液经过柱层析分析纯化,分离填料为200-400目硅球,流动相为甲醇氯仿混合液,甲醇氯仿体积比控制在1:3,除去有机相,得到无色油状液体三PEG3-三羧酸化合物2(3.36g,4mmol,收率80%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.12(s,3H),5.36(t,J=6.4Hz,1H),4.10(s,2H),2.82(s,2H),2.56(m,4H),2.33(s,1H),2.12(d,J=6.4Hz,2H),2.05-2.01(m,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H);HR-MS(C15H23N3O6s):理论值:841.4420,测定值[M+H]+:842.4621.
第二步,三PEG3-三琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物3)的制备。将化合物2(2.524g,3mmol)、EDCI(2.3g,12mmol)和磺酸钠NHS(3.15g,12mmol)加入20ml DMSO中,25℃反应24h。反应完毕,反应液缓慢滴加至相对于反应液8倍体积的无水THF,静置12h,除去THF,即得到无色油状物三PEG3-三琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐化合物3(2.83g,2.5mmol,收率83.4%)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ8.12(s,3H),5.36(t,J=6.4Hz,1H),4.10(s,2H),2.82(s,2H),2.56(m,4H),2.33(s,1H),2.12(d,J=6.4Hz,2H),2.05-2.01(m,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H);HR-MS(C15H23N3O6s):理论值:1129.4676,测定值[M+H]+:1130.5621.
第三步,双吖丙啶-三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物4)的制备。将化合物3(1.13g,1mmol)溶于20ml DMSO中,加入TEA(304mg,3mmol),混合均匀。称取氨甲基双吖丙啶(127.5mg,1.0mmol)溶于2mmol DMSO中,缓慢滴加至反应液,约5min滴加完毕。反应温度控制在25℃,反应时间控制在5min。反应完毕,反应液经半制备液相分离纯化,流动相分别为水(含0.1%体积的TFA)、乙腈(含0.1%体积的TFA),采用线性梯度:2%的水相增加到15%的水相,用时30min,收集24-28min流出液,真空冻干24h,即可得到双吖丙啶-三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐化合物4(880mg,0.8mmol,收率80%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J=6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s,2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J=6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H),2.05(t,J=6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H);HR-MS(C15H23N3O6s):理论值:1100.5125,测定值[M+H]:1101.2347.第四步,双吖丙啶-三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(目标交联剂)(化合物5)的制备。将化合物4(550mg,0.5mmol)溶于DMSO中,加入TEA(152mg,1.5mmol),混合均匀。称取氨丙基磷酸(139mg,0.5mmol)溶于2ml DMSO中,缓慢滴加至反应液,约5min滴加完毕。反应温度控制在25℃,反应时间控制在5min。反应完毕,反应液经半制备液相分离纯化,流动相分别为水(含0.1%体积的TFA)、乙腈(含0.1%体积的TFA),采用线性梯度:2%的水相增加到35%的水相,用时40min,收集32-35min流出液,真空冻干24h,即可得到双吖丙啶-三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐化合物5(368mg,0.3mmol,收率60%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J=6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s,2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J=6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H),2.05(t,J=6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H);HR-MS(C15H23N3O6s):理论值:1228.4798,测定值[M+H]:1229.4621.
实施例2
本实施例公开了一种三氟甲基双吖丙啶为光反应活性基团的交联剂的制备方法,包含四个反应步骤,制备方法如下所示:
其中,第一、二步同实施例1第一、二步。
第三步,三氟甲基双吖丙啶-三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物4)的制备。将化合物3(1.89g,1mmol)溶于20ml DMSO中,加入TEA(304mg,3mmol),混合均匀。称取氨甲基三氟甲基双吖丙啶(149.5mg,1.5mmol)溶于2ml DMSO中,缓慢滴加至反应液,约5min滴加完毕。反应温度控制在25℃,反应时间控制在5min。反应完毕,反应液经半制备液相分离纯化,流动相分别为水(含0.1%体积的TFA)、乙腈(含0.1%体积的TFA),采用线性梯度:2%的水相增加到15%的水相,用时30min,收集24-28min流出液,真空冻干24h,即可得到含三氟甲基双吖丙啶的三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐4(141g,0.79mmol,收率81%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J=6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s,2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J=6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H),2.05(t,J=6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H);HR-MS(C15H23N3O6s):理论值:1165.5125,测定值[M+H]+:1166.2347.
第四步,三氟甲基双吖丙啶-三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(目标交联剂)(化合物5)的制备。将化合物4(780mg,0.5mmol)溶于DMSO中,加入TEA(152mg,1.5mmol),混合均匀。称取氨丙基磷酸(139mg,0.5mmol)溶于2ml DMSO中,缓慢滴加至反应液,约5min滴加完毕。反应温度控制在25℃,反应时间控制在5min。反应完毕,反应液经半制备液相分离纯化,流动相分别为水(含0.1%体积的TFA)、乙腈(含0.1%体积的TFA),采用线性梯度:2%的水相增加到35%的水相,用时40min,收集32-35min流出液,真空冻干24h,即可得到三氟甲基双吖丙啶的三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐5(368mg,0.3mmol,收率60%)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J=6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s,2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J=6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H),2.05(t,J=6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H);HR-MS(C15H23N3O6s):理论值:1398.5155,测定值[M+H]+:1399.2314.
实施例3
本实施例公开了一种二苯甲酮为光反应活性基团的交联剂的制备方法,包含四个反应步骤,制备方法如下所示:
其中,第一、二步同实施例1。
第三步,二苯甲酮-三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物4)的制备。将化合物3(1.89g,1mmol)溶于20ml DMSO中,加入TEA(304mg,3mmol),混合均匀。称取氨甲基双吖丙啶(127.5mg,1.5mmol)溶于2ml DMSO中,缓慢滴加至反应液,约5min滴加完毕。反应温度控制在25℃,反应时间控制在5min。反应完毕,反应液经半制备液相分离纯化,流动相分别为水(含0.1%体积的TFA)、乙腈(含0.1%体积的TFA),采用线性梯度:2%的水相增加到15%的水相,用时30min,收集24-28min流出液,真空冻干24h,即可得到含二苯甲酮的三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐4(1.21g,0.8mmol,收率80%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J=6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s,2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J=6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H),2.05(t,J=6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H);HR-MS(C15H23N3O6s):理论值:1100.5125,测定值[M+H]+:1101.2347.
第四步,二苯甲酮-三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(目标交联剂)(化合物5)的制备。将化合物4(780mg,0.5mmol)溶于DMSO中,加入TEA(152mg,1.5mmol),混合均匀。称取氨丙基磷酸(139mg,0.5mmol)溶于2ml DMSO中,缓慢滴加至反应液,约5min滴加完毕。反应温度控制在25℃,反应时间控制在5min。反应完毕,反应液经半制备液相分离纯化,流动相分别为水(含0.1%体积的TFA)、乙腈(含0.1%体积的TFA),采用线性梯度:2%的水相增加到35%的水相,用时40min,收集32-35min流出液,真空冻干24h,即可得到二苯甲酮的三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐4(368mg,0.3mmol,收率60%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J=6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s,2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J=6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H),2.05(t,J=6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H);HR-MS(C15H23N3O6s):理论值:1354.5155,测定值[M+H]+:1355.2314.
实施例4
本实施例公开了一种苯基叠氮为光反应活性基团的交联剂的制备方法,包含四个反应步骤,制备方法如下所示:
其中,第一、二步同实施例1。
第三步,苯基叠氮-三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物4)的制备。将化合物3(1.89g,1mmol)溶于20ml DMSO中,加入TEA(304mg,3mmol),混合均匀。称取氨甲基双吖丙啶(127.5mg,1.5mmol)溶于2ml DMSO中,缓慢滴加至反应液,约5min滴加完毕。反应温度控制在25℃,反应时间控制在5min。反应完毕,反应液经半制备液相分离纯化,流动相分别为水(含0.1%体积的TFA)、乙腈(含0.1%体积的TFA),采用线性梯度:2%的水相增加到15%的水相,用时30min,收集24-28min流出液,真空冻干24h,即可得到含苯基叠氮的三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐化合物4(1.21g,0.8mmol,收率80%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J=6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s,2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J=6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H),2.05(t,J=6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H);HR-MS(C15H23N3O6s):理论值:1100.5125,测定值[M+H]+:1101.2347.
第四步,苯基叠氮-三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(目标交联剂)(化合物5)的制备。将化合物4(780mg,0.5mmol)溶于DMSO中,加入TEA(152mg,1.5mmol),混合均匀。称取氨丙基磷酸(139mg,0.5mmol)溶于2ml DMSO中,缓慢滴加至反应液,约5min滴加完毕。反应温度控制在25℃,反应时间控制在5min。反应完毕,反应液经半制备液相分离纯化,流动相分别为水(含0.1%体积的TFA)、乙腈(含0.1%体积的TFA),采用线性梯度:2%的水相增加到35%的水相,用时40min,收集32-35min流出液,真空冻干24h,即可得到苯基叠氮的三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐化合物5(368mg,0.3mmol,收率60%)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm)δ4.76(s,1H),3.36(t,J=6.4Hz,1H),3.10(s,2H),2.92(s,2H),2.86(m,4H),2.83(s,1H),2.72(d,J=6.4Hz,2H),2.65-2.60(m,2H),2.05(t,J=6.4Hz,2H),1.57(m,2H),1.25(m,2H);HR-MS(C15H23N3O6s):理论值:1354.5155,测定值[M+H]+:1355.2314.
实施例5
将实施例1中的含双吖丙啶的交联剂应用于Hela细胞,检测交联剂的细胞定位。配置终浓度为5mM的交联剂母液1ml,溶剂为1%(体积比)DMSO/PBS,加入至PBS洗过的(1万个)Hela细胞中,25℃化学交联5min、254nm紫外光交联5min。反应完毕,细胞加入1ml10%(体积比)甲醛/PBS溶液,细胞固定15min。加入1ml0.1%(体积比)triton X-100/PBS细胞打孔15min,与1ml1μmmol磷酸抗体(含荧光素标签)共孵育1h,PBS洗五遍,经过荧光共聚焦荧光显色,检测波长488nm,可以明显观测到细胞膜为绿色荧光,而细胞内无任何荧光(附图7),说明本发明交联剂成功定位在细胞膜上,并未透过细胞膜。
实施例6
将实施例1中的含双吖丙啶的交联剂应用于Hela细胞,进行交联肽鉴定。将含双吖丙啶的交联剂溶于1%(体积比)DMSO/PBS中,配置浓度为5mM的交联剂反应液。取1ml上述交联剂25℃与1E7个Hela细胞共孵育5min,转移至254nm紫外发生仪,光照5min,即完成光交联反应。加入10ul 1M的碳酸氢铵水溶液淬灭反应,加入1ml0.1%(体积比)NP40/PBS表面活性剂将细胞破碎,16000g离心5min,提取细胞质蛋白质,蛋白质混合液加入终浓度10mM DTT还原,终浓度20mM IAA避光反应30min,按照消化酶与蛋白质量比1:50加入Trypsin酶切,最后使用键合Fe3+的IMAC柱子富集磷酸交联肽(碧云天公司,上海中国),并用10ml0.1%(体积比)SDS/PBS洗脱两次,除去非特异性吸附肽段。最后10ml1 M HCl酸洗脱液洗脱磷酸肽,Lumos Fusion液质串联质谱分析,数据使用pLink2处理,1%FDR,最终鉴定到交联肽段2128条,其中1895条定位在细胞质膜蛋白,占比89.1%。
实施例7
将实施例2中的含三氟甲基双吖丙啶的交联剂应用于Hela细胞,进行交联肽鉴定。将含三氟甲基双吖丙啶的交联剂溶于1%(体积比)DMSO/PBS中,配置浓度为5mM的交联剂反应液。取1ml上述交联剂25℃与1E7个Hela细胞共孵育5min,转移至254nm紫外发生仪,光照5min,即完成光交联反应。加入10ul 1M的碳酸氢铵水溶液淬灭反应,加入1ml 0.1%(体积比)NP40/PBS表面活性剂将细胞破碎,16000g离心5min,提取细胞质蛋白质,蛋白质混合液加入终浓度10mM DTT还原,终浓度20mM IAA避光反应30min,按照消化酶与蛋白质量比1:50加入Trypsin酶切,最后使用键合Fe3+的IMAC柱子富集磷酸交联肽(碧云天公司,上海中国),并用10ml 0.1%(体积比)SDS/PBS洗脱两次,除去非特异性吸附肽段。最后10ml 1MHCl酸洗脱液洗脱磷酸肽,Lumos Fusion液质串联质谱分析,数据使用pLink2处理,1%FDR,最终鉴定到交联肽段3514条,其中2862条定位在细胞质膜蛋白,占比81.4%。
实施例8
将实施例3中的含二苯甲酮的交联剂应用于Hela细胞,进行交联肽鉴定。将含二苯甲酮的交联剂溶于1%(体积比)DMSO/PBS中,配置浓度为5mM的交联剂反应液。取1ml上述交联剂25℃与1E7个Hela细胞共孵育5min,转移至254nm紫外发生仪,光照5min,即完成光交联反应。加入10ul 1M的碳酸氢铵水溶液淬灭反应,加入1ml 0.1%(体积比)NP40/PBS表面活性剂将细胞破碎,16000g离心5min,提取细胞质蛋白质,蛋白质混合液加入终浓度10mM DTT还原,终浓度20mM IAA避光反应30min,按照消化酶与蛋白质量比1:50加入Trypsin酶切,最后使用键合Fe3+的IMAC柱子富集磷酸交联肽(碧云天公司,上海中国),并用10ml 0.1%(体积比)SDS/PBS洗脱两次,除去非特异性吸附肽段。最后10ml 1M HCl酸洗脱液洗脱磷酸肽,Lumos Fusion液质串联质谱分析,数据使用pLink2处理,1%FDR,最终鉴定到交联肽段1648条,其中1342条定位在细胞质膜蛋白,占比81.4%。
实施例9
将实施例4中的含苯基叠氮的交联剂应用于Hela细胞,进行交联肽鉴定。将含苯基叠氮的交联剂溶于1%(体积比)DMSO/PBS中,配置浓度为5mM的交联剂反应液。取1ml上述交联剂25℃与1E7个Hela细胞共孵育5min,转移至254nm紫外发生仪,光照5min,即完成光交联反应。加入10ul 1M的碳酸氢铵水溶液淬灭反应,加入1ml 0.1%(体积比)NP40/PBS表面活性剂将细胞破碎,16000g离心5min,提取细胞质蛋白质,蛋白质混合液加入终浓度10mM DTT还原,终浓度20mM IAA避光反应30min,按照消化酶与蛋白质量比1:50加入Trypsin酶切,最后使用键合Fe3+的IMAC柱子富集磷酸交联肽(碧云天公司,上海中国),并用10ml 0.1%(体积比)SDS/PBS洗脱两次,除去非特异性吸附肽段。最后10ml 1M HCl酸洗脱液洗脱磷酸肽,Lumos Fusion液质串联质谱分析,数据使用pLink2处理,1%FDR,最终鉴定到交联肽段1955条,其中1607条定位在细胞质膜蛋白,占比82.2%。
Claims (8)
2.一种权利要求1所述的交联剂的制备方法,其特征在于,具体过程如下:
步骤一,4-(2-羧基乙基)庚二酸(以下简称癸三酸,化合物1)为起始原料,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(以下简称EDCI)为缩合剂,N-羟基琥珀酰亚胺(以下简称NHS)为羟基供体,二甲基亚砜(以下简称DMSO)为反应溶剂,发生酯化反应,制备癸三琥珀酰亚胺酯1;反应完成,不经分离纯化,直接进行酰胺化反应,加入氨基-PEG3-羧酸以及有机碱三乙胺(以下简称TEA),制备三PEG3-三羧酸(化合物2);
步骤二,化合物2为反应原料,EDCI为缩合剂,磺酸钠NHS为羟基供体,DMSO为反应溶剂,发生酯化反应,制备三PEG3-三琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物3);
步骤三,化合物3及含光反应活性基团的胺为原料,摩尔比控制在1:(1.0-1.2),TEA为有机碱,DMSO为反应溶液,发生酰胺化反应,制备含光反应活性基团的三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物4);其中光反应活性基团包括双吖丙啶、三氟甲基双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上;
步骤四,化合物4及氨丙基磷酸为原料,摩尔比控制在1:(1.0-1.2),TEA为有机碱,DMSO为反应溶液,发生酰胺化反应,制备含光反应活性基团的三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物5,目标交联剂);其中光反应活性基团包括双吖丙啶、三氟甲基双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上;
3.根据权利要求2所述的交联剂的制备方法,其特征在于:步骤一中将反应物癸三酸(化合物1)、EDCI、NHS溶于DMSO中,癸三酸、EDCI与NHS摩尔比控制在1:(3.5-4.5):(3.5-4.5),反应温度控制在25-30℃,反应时间控制在24-36h;反应完毕,反应液直接加入相对于癸三酸3.5-4.5当量的氨基-PEG3-羧基,加入相对于癸三酸10-15当量的TEA,继续反应5-30min,反应温度控制在25-30℃;反应完毕,反应液经过柱层析分析纯化,分离填料为200-400目硅胶,流动相为甲醇氯仿混合液,甲醇氯仿体积比控制在1:(2.0-4.0),除去有机相,得到无色油状液体三PEG3-三羧酸(化合物2)。
4.根据权利要求2所述的交联剂的制备方法,其特征在于:步骤二中将化合物2、EDCI、磺酸钠NHS溶于DMSO中,化合物2、EDCI与磺酸钠NHS摩尔比控制在1:(3.5-4.5):(3.5-4.5),反应温度控制在25-30℃,反应时间控制在24-36h;反应完毕,反应液缓慢滴加至相对于反应液5-8倍体积的无水四氢呋喃(以下简称THF),静置12-24h,除去THF,即得到无色油状物三PEG3-三琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物3)。
5.根据权利要求2所述的交联剂的制备方法,其特征在于:步骤三中将化合物3溶于DMSO中,加入相对于化合物3的3.0-4.0当量的TEA,混合均匀。将相对化合物3的1.0-1.2当量的含光反应活性基团的胺溶于DMSO中,缓慢滴加至反应液,约5-10min滴加完毕。反应温度控制在25-30℃,反应时间控制在5-30min。反应完毕,反应液经半制备液相分离纯化,流动相分别为水(含0.1-0.5%体积的TFA)、乙腈(含0.1-0.5%体积的TFA),采用线性梯度:2-4%的水相增加到15-18%的水相,用时30min,收集24-28min流出液,真空冻干,即可得到含光反应活性基团的三PEG3-二琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物4),其中光反应活性基团包括双吖丙啶、三氟甲基双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上。
6.根据权利要求2所述的交联剂的制备方法,其特征在于:步骤四中将化合物4溶于DMSO中,加入相对于化合物4的3.0-4.0当量的TEA,混合均匀;将相对于化合物4的1.0-1.2当量氨丙基磷酸溶于DMSO中,缓慢滴加至反应液,约5-10min滴加完毕。反应温度控制在25-30℃,反应时间控制在5-30min;反应完毕,反应液经半制备液相分离纯化,流动相分别为水(含0.1-0.5%体积的TFA)、乙腈(含0.1-0.5%体积的TFA),采用线性梯度:2-4%的水相增加到30-35%的水相,用时40min,收集32-35min流出液,真空冻干,即可得到含光反应基团的三PEG3-磷酸基-琥珀酰亚胺酯磺酸钠盐(化合物5,目标交联剂),其中光反应活性基团包括双吖丙啶、三氟甲基双吖丙啶、二苯甲酮、苯基叠氮的一种或两种以上。
7.一种权利要求1所述的交联剂的应用,其特征在于:可用于细胞质膜蛋白质组学领域,包括细胞质膜蛋白质复合体的规模化分析、细胞质膜蛋白质的三维空间结构解析或细胞质膜蛋白质-蛋白质相互作用解析。
8.根据权利要求7所述的交联剂的应用,其特征在于:将含光反应基团的交联剂应用于Bel-7402人源细胞,254-365nm的紫外光照5-10min即完成交联反应;细胞中加入NP40表面活性剂超声破碎,提取蛋白质,经过DTT还原,IAA烷基化,Trypsin酶解,以及键合Fe3+的IMAC柱子富集磷酸交联肽,Lumos Fusion Obtrap液质连用采集质谱数据,以人源膜蛋白质为数据库pFind 2.0搜库,实现人源细胞质膜蛋白质复合体的规模化分析,包括细胞质膜蛋白质的三维空间结构解析或细胞质膜蛋白质-蛋白质相互作用解析。
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